Nanog慢病毒载体构建及在胚胎干细胞分化调控中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.004

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (19): 2763-2769.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.004

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Nanog慢病毒载体构建及在胚胎干细胞分化调控中的应用

陈霏¹，万利²，李艳³，李欣⁴

1广州医科大学基础学院组织学与胚胎学教研室，广东省广州市 511436
2广州医科大学附属第四医院检验科，广东省广州市 511447
3广州医科大学附属乐从医院，广东省佛山市 528315
4广州医科大学药学院药理学系，广东省广州市 511436

收稿日期:2016-03-07 出版日期:2016-05-06 发布日期:2016-05-06
通讯作者: 李欣，博士，讲师，广州医科大学药学院药理学系，广东省广州市 511436
作者简介:陈霏，男，1984年生，博士，讲师，主要从事干细胞研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金(31401240)；广东省医学科研基金(B2014190，B2014185)；广州医科大学科研项目(2013C01，L135060)

Construction of Nanog lentiviral expression vector and its application in differentiation regulation of embryonic stem cells

Chen Fei¹, Wan Li², Li Yan³, Li Xin⁴

1Department of Histology and Embryology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China
2Department of Laboratory, the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 511447, Guangdong Province, China
3Affiliated Lecong Hospital of Guangzhou Medical University, Foshan 528315, Guangdong Province, China
4Department of Pharmacology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China

Received:2016-03-07 Online:2016-05-06 Published:2016-05-06
Contact: Li Xin, Ph.D., Lecturer, Department of Pharmacology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China
About author:Chen Fei, Ph.D., Lecturer, Department of Histology and Embryology, Guangzhou Medical University, Guangzhou 511436, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31401240; the Medical Research Fund of Guangdong Province, No. B2014190, B2014185; Research Project of Guangzhou Medical University, No. 2013C01

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Nanog基因：特定性高表达于多能干细胞，例如诱导多能干细胞与胚胎干细胞，并且随多能干细胞的分化，表达量迅速下调。因此Nanog基因可作胚胎干细胞的分化研究中重要的观察对象，把带有Nanog介导hrGFP载体转入建立纯化的胚胎干细胞系，就可以实时观察胚胎干细胞的干性特征，并可通过观察其分化过程中绿色荧光的表达实时跟踪记录分化过程，这在多能干细胞的分化及分化调控研究中具有十分重要的意义。
Gateway技术：是利用λ噬菌体特异性结合位点，可在Clonase的作用下整合到宿主E.coli的基因组中的一种新的通用型克隆技术。利用Gateway技术构建载体，只需要在目的基因两端加上特异性的 15 bp大小的att结合位点，通过两种Clonase作用下的BP和LR结合反应，即可将目的基因导入载体中，其整合率可达到100%。而且去除了酶切、连接过程，可以避免假阳性的出现。因其操作方便，Gateway技术近年来在基因工程中的应用已越来越广泛。

摘要
背景：在胚胎干细胞分化调控研究中，仍缺少安全有效的组织特异性启动子介导的荧光报告基因的慢病毒表达载体。
目的：构建一个表达多能干细胞组织特异性启动子Nanog同时携带荧光报告基因和抗生素筛选基因的慢病毒表达载体Puro-Nanog-hrGFP，建立小鼠胚胎干细胞转基因细胞系，并观察其在小鼠胚胎干细胞细胞诱导分化过程中的表达。
方法：利用PCR扩增Nanog基因，通过LR反应连接荧光报告基因hrGFP构建慢病毒表达载体Puro-Nanog-hrGFP。慢病毒包装并转导小鼠胚胎干细胞后运用嘌呤霉素筛选得到小鼠胚胎干细胞转基因细胞系并进行鉴定，然后诱导其分化，观察随着小鼠胚胎干细胞的分化Nanog的表达情况。
结果与结论：通过特定引物PCR鉴定证实，慢病毒表达载体Nanog-hrGFP构建成功，将其成功导入小鼠胚胎干细胞，经筛纯化得到表达绿色荧光的小鼠胚胎干细胞单克隆细胞系，并通过诱导其分化可观察到绿色荧光表达逐渐减弱，可为进一步调控干细胞分化奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7448-826X(李欣)

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 慢病毒, Gateway技术, Nanog, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There is a lack of safe and effective modular lentivectors in differentiation regulation of embryonic stem cells.
OBJECTIVE: To construct a modular lentivector, Puro-Nanog-hrGFP, with Nanog promoter-controlled humanized renilla reniformis green fluorescent protein (hrGFP) and puromycin and to observe the expression of Nanog during the differentiation of Nanog-hrGFP-transfected mouse embryonic stem cell lines.
METHODS: After PCR amplification, Nanog, hrGFP and entry vector were recombined into the pDest-puro vectors to generate the lentiviral expression vector, Puro-Nanog-hrGFP, by the LR reaction. Through lentivirus production, transduction and puromycin screening, the transduced cell lines with Nanog-hrGFP gene were generated and identified. Expression of Nanog during the differentiation of transgenic mouse cell lines was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The lentiviral expression vectors Puro-Nanog-hrGFP were constructed successfully by Gateway technology, and then the transducted cell lines were obtained by lentiviral infection. The expression of Nanog was gradually decreased during the process of transgenic cell lines differentiation, which provides a new tool for further investigation on regulation of stem cell differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Embryonic Stem Cells, Transgenes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈霏，万利，李艳，李欣. Nanog慢病毒载体构建及在胚胎干细胞分化调控中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(19): 2763-2769.

Chen Fei, Wan Li, Li Yan, Li Xin. Construction of Nanog lentiviral expression vector and its application in differentiation regulation of embryonic stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(19): 2763-2769.

图/表（结果） 2

2.1 入门克隆pup-Nanog的鉴定 通过kana正选，氯霉素负选出来的克隆，进行质粒和PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示PCR条带500 bp左右(如图3)，与Nanog大小相符，表明入门克隆pup-Nanog构建成功。

2.2 目的载体(Nanog-hrGFP)的鉴定 慢病毒表达载体质粒(Nanog-hrGFP)PCR扩增目的载体中Nanog和hrGFP序列，琼脂糖电泳显示，Marker为1 kb，PCR鉴定结果与Nanog(500 bp左右)和hrGFP(720 bp)，结果发现PCR电泳图大小符合，表明慢病毒表达载体质粒(Nanog-hrGFP)构建成功(图4)。

2.3 慢病毒的包装 将Nanog-hrGFP质粒与Vira Power^TM Lentiviral Packaging Mix共转染239FT细胞，约48 h后，镜下可见部分细胞融合，出现多核复合体；60 h后细胞融合和多核复合体增多，如图5，72 h收集病毒上清。超速离心浓缩病毒，并进行生物安全性和滴度检测，结果发现生物安全性良好。

2.4 转基因细胞系的建立及纯化 小鼠胚胎干细胞经Nanog-hrGFP病毒浓缩液连续转导3次后，荧光显微镜观察克隆中部分细胞表达绿色荧光逐渐增多，细胞传代扩增后加入1-5 mg/L的Puro进行筛选，连续筛选12 d，得到了较纯的小鼠胚胎干细胞转基因细胞系。然后再用胰酶消化成单个细胞，待克隆长大后挑取单个克隆进行培养，扩增，即可得到单细胞克隆的小鼠胚胎干细胞转基因细胞系，表达绿色荧光蛋白，荧光显微镜可观察小鼠胚胎干细胞全部为绿色(图6)，表达外源基因导入成功。

2.5 Nanog-hrGFP转基因细胞系的鉴定 碱性磷酸酶、Nanog、SSEA-1在增殖活跃的胚胎干细胞中活性较高，常用作原始未分化细胞的标志之一。镜下见小鼠胚胎成纤维细胞不能被染色，Nanog-hrGFP转基因细胞系进行碱性磷酸酶，SSEA-1和Nanog染色为强阳性(图7)。

2.6 转基因细胞系分化过程中Nanog的表达变化Nanog-hrGFP-mES经拟胚体后进行贴壁2，4 d时荧光观察拍照记录，结果发现随着贴壁时间的延长，克隆细胞逐渐散开，转基因细胞逐渐分化成梭形或扁平状，绿色荧光表达降低表明Nanog表达量逐渐降低(图8)。同时qPCR提取检测Nanog的表达情况发现，转基因细胞组与对照组小鼠胚胎干细胞的Nanog表达量也逐渐降低，但实验组表达量降低的更为迅速，也再次证明外源基因Nanog-hrGFP导入成功。

参考文献

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4): 663-676.

[2] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5): 861-872.

[3] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007;318(5858): 1917-1920.

[4] Cheng F, Ke Q, Chen F, et al. Protecting against wayward human induced pluripotent stem cells with a suicide gene. Biomaterials. 2012;33(11): 3195-3204.

[5] 张杨,李秀兰.诱导性多潜能干细胞的安全性及临床应用[J].中国组织工程研究, 2013,17(27):5087-5093.

[6] Li W, Xiang AP. Safeguarding clinical translation of pluripotent stem cells with suicide genes. Organogenesis. 2013;9(1):34-39.

[7] 姚欣鹏,徐旸,张璐,等.分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤[J].中国组织工程研究,2013,17(36): 6481-6488.

[8] Landy A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 1989;58: 913-949.

[9] Furuya M, Yasuchika K, Mizutani K, et al. Electroporation of cynomolgus monkey embryonic stem cells. Genesis. 2003;37(4): 180-187.

[10] Ueda S, Yoshikawa M, Ouji Y, et al. Cynomolgus monkey embryonic stem cell lines express green fluorescent protein. J Biosci Bioeng. 2006;102(1): 14-20.

[11] Suter DM, Cartier L, Bettiol E, et al. Rapid generation of stable transgenic embryonic stem cell lines using modular lentivectors. Stem Cells. 2006;24(3): 615-623.

[12] Belfield EJ, Hughes RK, Tsesmetzis N, et al. The gateway pDEST17 expression vector encodes a -1 ribosomal frameshifting sequence. Nucleic Acids Res. 2007;35(4): 1322-1332.

[13] Chen QJ, Zhou HM, Chen J, et al. A Gateway-based platform for multigene plant transformation. Plant Mol Biol. 2006;62(6): 927-936.

[14] Sivagnanam S, Majumdar A, Yoshimoto K, et al. Early experiences in developing and managing the neuroscience gateway. Concurr Comput. 2015;27(2): 473-488.

[15] Wu TM, Lin KC, Liau WS, et al. A set of GFP-based organelle marker lines combined with DsRed-based gateway vectors for subcellular localization study in rice (Oryza sativa L.). Plant Mol Biol. 2016;90(1-2): 107-115.

[16] Griffin TZ, Kang W, Ma Y, et al. The HAND Database: a gateway to understanding the role of HIV in HIV-associated neurocognitive disorders. BMC Med Genomics. 2015;8(1):70.

[17] Silva J, Nichols J, Theunissen TW, et al. Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell, 2009; 138(4): 722-737.

[18] Galvagni F, Neri F.Snail represses Nanog to promote embryonic stem cell differentiation. Genom Data. 2015; 4:82-83.

[19] 沈洁,李金辉,阮静,等.诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立[J].中国组织工程研究,2014, 18(19): 3005-3011.

[20] Evans M. Discovering pluripotency: 30 years of mouse embryonic stem cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011; 12(10): 680-686.

[21] Kiuru M, Boyer JL, O'Connor TP, et al. Genetic control of wayward pluripotent stem cells and their progeny after transplantation. Cell Stem Cell. 2009;4(4): 289-300.

[22] Wilkinson AC, Goode DK, Cheng YH, et al. Single site-specific integration targeting coupled with embryonic stem cell differentiation provides a high-throughput alternative to in vivo enhancer analyses. Biol Open. 2013;2(11):1229-1238.

[23] Xia X, Zhang Y, Zieth CR, et al. Transgenes delivered by lentiviral vector are suppressed in human embryonic stem cells in a promoter-dependent manner. Stem Cells Dev. 2007;16(1): 167-176.

[24] 蔡弢艺,陈雄生,贾连顺,等.碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化[J].中国组织工程研究,2014,18(23):3727-3731.

[25] Smith-Arica JR, Thomson AJ, Ansell R, et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning Stem Cells. 2003;5(1): 51-62.

[26] Prouty AM, Fischer J, Purdom A, et al. Spiritual Coping: A Gateway to Enhancing Family Communication During Cancer Treatment. J Relig Health. 2016;55(1): 269-287.

[27] Amaya CN, Bryan BA. Enrichment of the embryonic stem cell reprogramming factors Oct4, Nanog, Myc, and Sox2 in benign and malignant vascular tumors. BMC Clin Pathol. 2015;15:18.

[28] Kang J, Shakya A, Tantin D. Stem cells, stress, metabolism and cancer: a drama in two Octs. Trends Biochem Sci. 2009;34(10):491-499.

[29] Liedtke S, Stephan M, Kögler G. et al. Oct4 expression revisited: potential pitfalls for data misinterpretation in stem cell research. Biol Chem. 2008;389(7): 845-850.

[30] Tsai LL, Hu FW, Lee SS, et al. Oct4 mediates tumor initiating properties in oral squamous cell carcinomas through the regulation of epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 2014;9(1):e87207.

[31] Liu J, Wang L, Ma L, et al. Significantly increased expression of OCT4 and ABCG2 in spheroid body-forming cells of the human gastric cancer MKN-45 cell line. Oncol Lett. 2013;6(4):891-896.

[32] Silva J, Nichols J, Theunissen TW, et al. Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell. 2009; 138(4): 722-737.

[33] Li WZ, Ai ZY, Wang ZW, et al. GATA-1 directly regulates Nanog in mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2015;465(3):575-579.

[34] Guo C, Xue Y, Yang G, et al. Nanog RNA binding proteins YBX1 and ILF3 affect pluripotency of embryonic stem cells. Cell Biol Int. 2015. [Epub ahead of print]

引言

日本科学家Takahashi等^[1]2006年首先提出了诱导多能干细胞的科学构想，通过Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四个基因(SY4基因)组合经反转录过表达系统完成小鼠诱导多能干细胞的诱导过程。2007年Takahashi^[2]和美国科学家Thomson等分别重编程了人类成纤维细胞，得到了人诱导多能干细胞系^[3]。

诱导多能干细胞的出现解决了胚胎干细胞应用中的伦理问题，但是在诱导多能干细胞和胚胎干细胞的分化调控研究中，仍缺少安全有效的载体工具，而且临床应用还存在安全性问题^[4-5]。转基因是一种将外源基因导入生物体或者细胞内，使宿主的遗传性状发生改变的方法。通过转基因技术使干细胞携带标记基因，可以在体内外实验中作为示踪剂对移植的细胞进行跟踪，标记基因携带报告基因便于干细胞的观察研究^[6-7]。鉴于胚胎干细胞和转基因技术的重要性，因此，如何能将外源基因高效地转入胚胎干细胞并能在不影响其生物学特性的情况下持续稳定表达就显得十分必要。

目前，胚胎干细胞的转基因方法有很多种^[8]，包括物理方法(如电穿孔)、化学方法(如Lipofectamine 2000)和病毒转导3大类^[9-11]。由于诱导多能干细胞呈克隆状生长，生长环境比较复杂，通过慢病毒载体介导获得表达外源基因的均一性细胞群体是较理想的方法。传统的慢病毒质粒构建技术需要进行酶切、连接等过程，操作繁琐复杂，近年来有一种模块化构建质粒载体的Gateway技术，更为灵活通用。Gateway技术是利用λ噬菌体特异性结合位点，可在Clonase的作用下整合到宿主E.coli的基因组中的一种新的通用型克隆技术^[12]。利用Gateway技术构建载体，只需要在目的基因两端加上特异性的15 bp大小的att结合位点，通过两种Clonase作用下的BP和LR结合反应，即可将目的基因导入载体中，其整合率可达到100%。而且去除了酶切、连接过程，可以避免假阳性的出现^[13]。因其操作方便，Gateway技术近年来在基因工程中的应用已越来越广泛^[14-16]。

Nanog基因特定性高表达于多能干细胞，例如诱导多能干细胞与胚胎干细胞，并且随多能干细胞的分化，表达量迅速下调^[17]。因此Nanog基因可作胚胎干细胞的分化研究中重要的观察对象，把带有Nanog介导HRGFP载体转入建立纯化的胚胎干细胞系，就可以实时观察胚胎干细胞的干性特征，并可通过观察其分化过程中绿色荧光的表达实时跟踪记录分化过程，这在多能干细胞的分化及分化调控研究中具有十分重要的意义^[18-19]。

因此，实验运用多位点Gateway技术构建了多能干细胞特异性启动子Nanog控制下的荧光报告基因hrGFP慢病毒表达载体Nanog-hrGFP。经慢病毒包装浓缩后转入小鼠胚胎干细胞，再通过嘌呤霉素进行筛选纯化，获得了同时表达外源基因Nanog和绿色荧光报告基因hrGFP的Nanog-hrGFP小鼠胚胎干细胞系。经拟胚体分化后，通过观察小鼠胚胎干细胞分化中的绿色荧光表达，可以记录胚胎干细胞分化过程，为进一步在多能干细胞分化调控中的应用奠定基础。

材料方法

1.1 设计 观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月在广州医科大学组织学与胚胎学教研室完成。

1.3 材料 含Nanog序列的质粒由新加坡国立大学的Paul Robson赠送；小鼠胚胎干细胞系：美国ATCC公司购买；小鼠诱导多能干细胞系：系中山大学干细胞与组织工程研究中心建立；239FT细胞株：Life Technologies公司；小鼠白血病抑制因子：Chemicon公司；LR Clonase^TM Ⅱ Plus enzyme mix：Life Technologies公司；One Shot^® Stbl3 Chemically Competent E.coli：Life Technologies公司；目的载体pDestpuro：Life Technologies公司；TIANamp Virus RNA Kit 病毒RNA提取试剂盒：TIANGEN公司；碱性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)：Sigma公司；Anti-Oct4(兔抗Oct抗体)：Santa Cruz公司；Anti-SSEA4(兔抗SSEA4抗体)：Millipore公司；Anti-Nanog(兔抗Nanog抗体)：Chemicon 公司。

1.4 实验方法

1.4.1 构建启动子入门克隆pup-Nanog 利用attB引物PCR扩增带有含Nanog序列的质粒(表1)，制备含有attB1R和attB4位点的序列attB4-Nanog-attB1R的片段，参照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)回收attB4-Nanog-attB1R PCR扩增片段，然后在BP Clonase^TMⅡ Enzyme Mix(BP酶)作用下分别与入门载体pDONRTMP4-P1R发生BP位点重组反应，通过卡那霉素(kanamycin，kana)的正筛选，氯霉素负选，PCR检测和测序鉴定出正确克隆pup-Nanog (图1)。

1.4.2 构建慢病毒表达载体Nanog-hrGFP 利用LR Clonase^TMⅡ Plus enzyme mix(LR酶)将携带启动子的入门克隆pUp-Nanog、携带目的基因的入门克隆pDown-hrGFP、携带抗性基因Puro目的载体pLV/Des(pDestpuro)连接起来构建慢病毒表达载体Nanog-hrGFP (图2)。

将表达载体Nanog-hrGFP转化至感受态菌stb13上，通过氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)的正筛选，氯霉素负选，质粒电泳，PCR检测和测序鉴定出正确克隆pLV/Final-puro-Nanog-hrGFP(Nanog-hrGFP)。

1.4.3 慢病毒的包装及转染 将载体质粒(SL3、SL4、SL5)和慢病毒表达载体质粒(Nanog-hrGFP)在Opti- MEM培养液中通过脂质体(Lipofectamine^TM2000)转入到293FT细胞中，在37 ℃、体积分数5% CO₂的条件下培养48-72 h后，收集病毒上清，超速离心浓缩后放置-80 ℃冰箱待用。
运用小鼠胚胎成纤维细胞(Feeder)和小鼠白血病抑制因子培养小鼠胚胎干细胞，在37 ℃、体积分数5%CO₂的条件下培养下，每两至三天用0.25%胰酶消化传代1次。选取生长状态良好的小鼠胚胎干细胞，按传代的方法分别接种到预先铺好小鼠胚胎成纤维细胞的12孔板内。待小鼠胚胎干细胞贴壁后，分别选取覆盖率为80%的细胞加入100 µL浓缩病毒液，8-12 h后换为新鲜的小鼠胚胎干细胞培养液培养。由于小鼠胚胎干细胞呈克隆状生长，细胞致密，故需用病毒液连续感染两至三次。感染完成后72 h对转导后的小鼠胚胎干细胞按1 mg/L Puro的量进行筛选，根据细胞生长状态和对药物的敏感度，应适时调整时间和浓度。约14 d后，便可得到的携带外源基因(Nanog-hrGFP)的小鼠胚胎干细胞转基因细胞系(Nanog-hrGFP-mES)。

1.4.4 转基因细胞纯化及鉴定

单克隆细胞系的纯化：将获得的转基因细胞消化成单个细胞接种于预先铺好小鼠胚胎成纤维细胞的细胞培养板上，待长到第3天时，在解剖显微镜下挑取单个细胞长成的克隆，待细胞扩增后，可得到纯化单细胞克隆的细胞系，建好系的细胞冻存在液氮罐作永久保存。

转基因细胞系干细胞生物学特性的鉴定：将获得的单克隆细胞系(Nanog-hrGFP-mES)，用40 g/L多聚甲醛固定，然后进行碱性磷酸酶染色观察拍照；以及mECs相同的分子特异性标记Nanog和SSEA1染色，抗体信息如表2，DAPI染核后镜下观察并拍照。

1.4.5 转基因细胞系分化过程中Nanog的表达变化 用胰酶将去除小鼠胚胎成纤维细胞的未分化的Nanog-hrGFP-mES接种至细菌培养板，用mEB培养液悬浮培养4 d形成拟胚体，然后种到0.2%明胶包被好的细胞培养板上贴壁培养，mEB培养液培养2，4 d时荧光观察拍照记录，同时qPCR提取检测Nanog的表达情况。

1.5 主要观察指标 荧光显微镜观察慢病毒转导纯化后转基因细胞系(Nanog-hrGFP-mES)的hrGFP表达情况；荧光显微镜观察转基因细胞系(Nanog-hrGFP-mES)的分化过程中hrGFP表达情况；qPCR提取检测转基因细胞系的分化过程中Nanog的表达。

1.6 统计学分析 由第一作者采用SPSS 13.0统计学软件对Nanog的qPCR的检测结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，结果P < 0.01时差异有显著性意义。

讨论

目前已知的载体DNA导入方式包括电穿孔、核转染(nucleofection)、脂质体转染以及病毒转染等^[20-22]。尽管已有多个课题组比较了不同的转染方式的效率，但目前公认的高效的转染方式是Lentivirus系统。其转导(transduction)效率可超过50%^[23]，远远高于腺病毒或腺相关病毒0.01%-11%的效率^[24-25]。但传统的lentivirus载体也存在以下问题：克隆位点较少，效率低。而Gateway克隆技术是利用λ噬菌体DNA自然条件下可与其宿主大肠杆菌DNA发生位点特异性重组整合和可逆切割分离这一机制并加以改进创建的。基于λ噬菌体的位点特异性重组，可以代替传统上利用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入表达载体。只要通过BP反应建立分别包含组织特异性启动子或荧光蛋白基因片段的入门克隆载体，就可以通过LR反应识别特异重组位点，从而一步将所需序列导入合适位置^[26]。

小鼠胚胎干细胞特异性表达Nanog、Oct4等转录因子，这些因子维持多能干细胞自我更新、增殖分化的作用^[27]。Oct4在胚胎发育过程中参与多向分化的调节^[28]，且在很多分化的组织细胞中表达^[29]。但近期有研究发现Oct4在多种恶性肿瘤组织或细胞系中异常表达，表明Oct4不仅表达于多能干细胞，还极有可能参与成体细胞及肿瘤的发生^[30-31]。Nanog基因特定性高表达于多能干细胞，并且随多能干细胞的分化，表达量迅速下调，可作为观察胚胎干细胞分化调控标志物^[32-34]。

因此作者利用基于Gateway多重组位点技术的模块载体构建系统构建了Nanog-hrGFP慢病毒表达载体，然后导入小鼠胚胎干细胞，经筛选获得了稳定表达Nanog-hrGFP细胞系，且经过鉴定发现Nanog-hrGFP不影响转入细胞的多能干细胞特性，而且在胚胎干细胞的体内分化过程中，Nanog控制的hrGFP随着分化的延长，荧光表达逐渐减弱，可实时记录胚胎干细胞的分化调控过程。

Gateway技术构建的慢病毒载体转胚胎干细胞建系，高效稳定而不影响其生物学特性，且可通过嘌呤霉素筛选纯化出单克隆细胞系，将Nanog控制的hrGFP1导入胚胎干细胞，能够跟踪胚胎干细胞在体内的迁移、分化进行跟踪。而且通过Nanog控制的外源基因(比如自杀基因等等)，在细胞替代治疗中有选择性的消除残留的未分化的胚胎干细胞，解决胚胎干细胞应用过程中形成肿瘤的潜在危险，具备十分广阔的应用前景。

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.