玛咖对力竭运动后老年模型大鼠肾脏线粒体呼吸功能及抗衰老能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.019

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

呼吸链：又叫电子传递链，它的作用是接受代谢物脱下的氢经过一系列的传递体，按一定顺序，最终传递给氧原子生成水和逐渐释放ATP的过程。

玛咖：是原产南美洲的一种十字花科植物，叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，富含多种营养成分，能延缓运动疲劳的发生，延迟人体衰老。玛咖提取物包含4 种生物碱、芥子油苷、多种维生素如蛋白质、氨基酸、多糖、矿物质和多种天然植物活性成分。

背景：研究表明，玛咖可增强细胞的免疫功能，提高线粒体呼吸链酶活性，起到抗氧化抗衰老的作用。

目的：观察玛咖对力竭运动后老年大鼠肾脏线粒体呼吸功能及抗衰老能力的影响。

方法：将10月龄老年大鼠每日灌胃1次玛咖粉剂(5 g/kg)，同时进行递增负荷跑台运动，每周5 d，同时设对照组、玛咖组和运动组作对照。训练6周后，各组大鼠均进行力竭运动(35 m/min)，随后即刻腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠取出肾脏，差速离心提取线粒体，分光光度计测定线粒体呼吸链酶活性。

结果与结论：①线粒体呼吸链酶及抗氧化酶活性：与对照组、玛咖组和运动组相比，玛咖+运动组线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅲ、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均升高(P < 0.05或P < 0.01)、丙二醛含量均降低(P < 0.05或P < 0.01)；②结果说明：补充玛咖结合递增负荷运动训练均可提高力竭运动后老年大鼠肾脏线粒呼吸功能，延缓衰老，且补充玛咖与递增负荷运动具有协同效应。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-6969-9727(彭丽娜)

关键词: 实验动物, 运动系统动物模型, 玛咖, 递增负荷, 力竭, 运动, 老年, 大鼠, 肾脏, 线粒体, 呼吸链酶, 抗衰老

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that Maca can enhance immune cell function, improve mitochondrial respiratory chain enzymes, and play a role in anti-oxidation and anti-aging.
OBJECTIVE: To observe Maca effects on kidney mitochondrial respiratory function and anti-aging capabilities in elderly rats after exhausted exercise.
METHODS: 10-month-old elderly rats were intragastrically administrated Maca powder 5 g/kg, once a day, and did treadmill exercise, 5 days in a week. Rats were randomly divided into control group, Maca group and training group and Maca+training group. At 6 weeks after training, rats in each group did exhausted exercise (35 m/min), and immediately received intraperitoneal injection of 2% sodium pentobarbital. The kidney was obtained, and mitochondria were extracted by differential centrifugation. A spectrophotometer was used to measure mitochondrial respiratory chain activity.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Mitochondrial respiratory chain enzyme and antioxidant enzyme activity: mitochondrial respiratory chain enzyme I-III, superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities were higher in the Maca+training group than in the control group, Maca group and training group (P < 0.05 or P < 0.01), but malondialdehyde content was lower (P < 0.05 or P < 0.01). (2) Results suggested that the combination of supplement Maca and incremental exercise can improve mitochondrial respiratory function and delay aging in the kidney of aged rats after exhausted exercise. Moreover, supplemented Maca and incremental exercise have a synergistic effect.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Models, Animal, Mitochondria

彭丽娜，贾鹏. 玛咖对力竭运动后老年模型大鼠肾脏线粒体呼吸功能及抗衰老能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2711-2716.

Peng Li-na, Jia Peng. Peng Li-na, Jia Peng (College of Physical Education, Langfang Teachers University, Langfang 065000, Hebei Province, China)[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2711-2716.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析大鼠64只依跑台适应情况，淘汰不能运动或运动时出现炎症者，最终保留48只进入结果分析。

2.2 模型创新性实验设计从运动速度到运动时间都呈现小幅度递增趋势，改变了以往的递增负荷中只增加速度而时间不变的模式，更加突出了小幅度增加速度也间接延长时间的运动模式。

2.3 模型稳定性小幅度增加速度也间接延长时间的运动模式，更加适用老年人的锻炼方式，把对于老年大鼠的动物训练模型转移到临床应用之上。

2.4 玛咖结合递增负荷运动对力竭运动后老年大鼠肾脏线粒体呼吸功能的影响与对照组比较，玛咖组大鼠肾脏线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ活性均出现升高趋势。线粒体呼吸链酶与对照组比较，玛咖组大鼠肾脏线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ活性均出现升高趋势。线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅲ活性提高30.61%和27.48%(P < 0.05)，线粒体呼吸链酶Ⅱ提高42.63%(P < 0.01)，线粒体呼吸链酶Ⅳ活性提高了14.28%(P > 0.05)；与对照组比较，运动组线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅱ活性分别提高24.66%和26.53%(P < 0.05)，线粒体呼吸链酶Ⅲ提高了50.22%(P < 0.01)，线粒体呼吸链酶Ⅳ提高了11.09%(P > 0.05)；与对照组比较，玛咖+运动组大鼠肾脏线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ活性分别提高58.82%，60.99%和71.68%(P < 0.01)，线粒体呼吸链酶Ⅳ 活性提高了29.88%(P > 0.05)。与玛咖组比较，玛咖+运动组大鼠肾脏线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅳ活性均呈现升高趋势，线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅲ活性提高了40.65%和60.95%(P < 0.01)，线粒体呼吸链酶Ⅱ活性提高了31.99%(P < 0.05)；线粒体呼吸链酶Ⅳ 活性提高了18.19%(P > 0.05)。与运动组比较，玛咖+运动组线粒体呼吸链酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ活性分别提高45.34%，46.89%和43.10%(P < 0.01)，线粒体呼吸链酶Ⅳ活性提高了12.03%(P > 0.05)。见表1。

2.5 玛咖结合递增负荷运动对力竭运动后老年大鼠肾脏抗衰老能力的影响与对照组比较，玛咖组、运动组、玛咖+运动组大鼠肾脏线粒体谷胱甘肽过氧化物酶活性分别提高了32.04%，34.87%和49.20%(P < 0.05或P < 0.01)；与对照组比较，玛咖组、运动组和玛咖+运动组超氧化物歧化酶活性分别升高26.08%，36.03%和45.36%(P < 0.05或P < 0.01)。玛咖组、运动组、玛咖+运动组大鼠肾脏线粒体丙二醛含量均高于对照组，玛咖组、运动组分别提高了26.79%和20.55%(P < 0.05)，玛咖+运动组丙二醛含量提高了14.01%(P > 0.05)。与玛咖组比较，玛咖+运动组谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性分别提高了25.24%，26.08%(P < 0.05)；丙二醛含量下降了14.87%(P > 0.05)。与运动组相比，玛咖+运动组谷胱甘肽过氧化物酶活性提高了21.99%(P < 0.05)；超氧化物歧化酶活性提高14.59% (P > 0.05)，丙二醛含量下降了7.61%(P > 0.05)。见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物模型实验。

1.2 时间及地点于2014年5月至2015年8月在廊坊师范学院完成，部分实验在廊坊市第一人民医院生化实验室完成。

1.3 造模动物选取10月龄健康雄性Wistar大鼠48只，体质量(350±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将48只Wistar大鼠随机分成4组，分别为对照组(不训练、无玛咖)、玛咖组(不训练、喂玛咖)、运动组(训练、无玛咖)和玛咖+运动组(训练、喂玛咖)，每组12只，分笼饲养，每笼6只，自由饮水。

1.4 造模方法根据以往研究建立慢性疲劳模型大鼠的方法^[9-10]，运动组和玛咖+运动组大鼠进行6周递增负荷跑台运动，每周5 d，1次/d。速度15，18，20，25，28，30 m/min，时间为20，30，35，40，45，50 min。玛咖组和玛咖+运动组大鼠训练结束，每日给予大鼠玛咖粉5 g/kg^[11](秘鲁AGRO公司，配制方法：将5.0 g玛咖粉剂加纯净水至100 mL，配成0.05 g/mL质量浓度溶液)灌胃。大鼠经过6周训练后，所有大鼠于第7周的周一上午进行1次性力竭运动，速度是35 m/min^[9]，对照组除外。

1.5 造模成功的检测标准要对力竭运动后肾脏线粒体呼吸链酶活性进行研究，成功建立动物模型无疑是非常关键的。目前中国学者在建立动物跑台模型时所采用的运动方式、负荷强度、量并无统一标准。结合实验结果看，此次实验所采用的造模训练方案均引起了大鼠肾脏线粒体呼吸链酶活性显著提高，这说明实验所采用的造模训练方案整体是比较合理的。

1.6 肾脏线粒体缓冲液、悬浮液的配制缓冲液配制250 mmol/L蔗糖(相对分子质量342.29)10 mmol/L Tris-HCl(相对分子质量121.14)5 mmol/L EDTA(相对分子质量372.24)；悬浮液配制：280 mmol/L蔗糖(相对分子质量342.29)0.5 mmol/L的EDTA(相对分子质量372.24)10 mmol/L Tris-HCl(相对分子质量121.14)，pH 7.4，备用。

1.7 肾脏标本制备及线粒体的提取力竭后即刻腹腔注射体积分数2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，迅速取出肾脏组织，在预冷生理盐水中除去脂肪、筋膜等结缔组织后，冰浴中剪成碎块，并在按体积比1∶5加入缓冲液匀浆，每次匀浆30 s，间隔30 s，反复3次，制成匀浆液。匀浆液在0-4 ℃下，离心600 r/min，15 min，弃沉淀，取上清液；所得沉淀用适量缓冲液充分反复吹打悬浮后再离心12 000 r/min，15 min，弃上清液，取沉淀，在4 ℃下，与250 mmol/L蔗糖混合后再离心12 000 r/min，10 min，所得沉淀物即为肾脏线粒体小球^[12]。

1.8 肾脏线粒体呼吸链酶活性、线粒体超氧化物歧化酶、线粒体谷胱甘肽过氧化物酶活性、丙二醛含量测定室温下测定肾脏线粒体呼吸链酶活性。将10 μL线粒体蛋白加入到酶线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ反应缓冲液2 mL中，3 min内连续测定紫外线波长340，600，550，550 nm处NADH，FADH2，细胞色素C还原酶与细胞色素C氧化酶吸光值的变化，以此表示肾脏线粒体呼吸链酶线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ的活性^[13]。

超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性、丙二醛含量测定，严格按照测试盒的操作程序进行(南京建成生物工程研究所)。考马斯亮蓝G250测定蛋白含量。

1.9 主要观察指标各组线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ、线粒体谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量变化。

1.10 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，所有数据均用x(_)±s表示，数据符合正态分布，组间数据差异比较采用单因素方差分析和LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 模型创新性、材料、方法的改进及应用价值关于慢性疲劳模型，赵俊等^[14]提到方剑乔采取10，15，20，24，28 m/min的速度每天运动10 min，随后第7周转至28 m/min速度运动直至力竭；王洲等^[15]采用速度为16 m/min，总运动时间90 min。田野等^[9]在递增负荷中采用速度为15，22，27，31，35 m/min速度运动20 min的模型。

结合以上造模方案，实验设计从运动速度到运动时间都呈现小幅度递增趋势，改变了以往的递增负荷中只增加速度而时间不变的模式，更加突出了小幅度增加速度也间接延长时间的运动模式，并且结合实验结果看，均引起了大鼠肾脏线粒体呼吸链酶，抗氧化酶活性显著提高，这说明实验所采用的造模训练方案整体是比较合理的，可把对于老年大鼠的动物训练模型转移到临床实践之上。另外，实验在实验仪器和测试手段上也有所改进。

3.2 玛咖结合递增负荷运动对力竭运动后老年大鼠肾脏线粒体呼吸功能的影响研究表明，长时间有氧运动训练可以增加线粒体呼吸链酶活性，延缓衰老过程中线粒体功能的退行性变化^[16]。李洁等^[17-19]研究也表明，长期运动训练可改善骨骼肌、心肌等线粒体呼吸功能。

实验结果显示，经过6周递增负荷跑台运动，力竭运动后老年大鼠肾脏线粒体呼吸链酶活性均有升高趋势，说明长期有氧运动训练可改善肾脏线粒体呼吸链的适应性，提高大鼠肾脏线粒体呼吸功能，这与陈彩珍等的研究结果相似^[20]。

研究显示，补充抗氧化剂和长期进行有氧运动可在一定程度上维持人体氧化与抗氧化的平衡，改善线粒体功能，预防线粒体老化^[21-22]。另一研究表明，补充玛咖具有抗疲劳功能^[23]。

实验结果显示，补充玛咖可提高老年大鼠力竭运动后肾脏线粒体呼吸链功能。且玛咖结合运动组大于玛咖组和运动组，说明玛咖结合递增负荷运动训练在改善老年大鼠肾脏线粒体呼吸功能方面具有协同作用。其机制可能是：有氧训练可显著提高人体的有氧代谢水平，提高人体线粒体基质酶及呼吸链酶活性，提高氧化磷酸化功能，增进人体有氧工作能力^[24-25]；同时玛咖本身富含多种生物活性物质，使线粒体呼吸功能得到稳固，延缓人体疲劳，提高运动能力^[26]。这与课题组以往研究结果相一致，但存在组织差异性^[8]。

课题组前期研究选取2月龄大鼠骨骼肌作为研究对象，从数据上看，相同之处是补充玛咖、运动训练、玛咖结合运动训练均可以提高线粒体呼吸链酶活性，但提高的程度不同，酶活性的敏感部位也不相同。

以往研究显示，玛咖组敏感部位在线粒体呼吸链酶Ⅳ，运动组敏感部位在线粒体呼吸链酶Ⅱ，玛咖结合运动训练最敏感在线粒体呼吸链酶Ⅳ；实验玛咖组敏感部位在线粒体呼吸链酶Ⅱ，运动组敏感部位在线粒体呼吸链酶Ⅲ，玛咖结合运动训练最敏感在线粒体呼吸链酶Ⅲ。总之，补充玛咖结合跑台运动训练可提高老年大鼠肾脏线粒体呼吸功能，且玛咖与运动训练具有协同效应。

3.3 玛咖结合递增负荷运动对力竭运动后老年大鼠肾脏抗衰老能力的影响研究表明，力竭运动导致线粒体膜完整性受损，大量自由基堆积，细胞免疫系统功能下降，造成人体衰老甚至死亡^[27]。

还有研究表明，玛咖提取物能增强老龄小鼠血清、肝脏谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，降低血清及肝脏中的丙二醛含量，说明玛咖具有一定的抗衰老作用^[28]。实验结果显示，递增负荷运动可以提高力竭运动后老年大鼠线粒体抗氧化酶活性，同时脂质过氧化物含量也增多，这一结果与课题组前期的研究成果相似^[8]。

还有实验证明，玛咖醇提取物、生物碱和多糖可以提高人体抗氧化酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，快速清除自由基，改善人体代谢能力，具有良好的抗氧化抗衰老作用^[28-29]。

实验结果显示，补充玛咖、玛咖结合运动均可提高老年大鼠力竭运动后肾脏线粒体抗氧化酶活性，同时脂质过氧化物含量也增多，但玛咖+运动组抗氧化酶活性的提高幅度大于玛咖组和运动组，而丙二醛水平的增加量却小于玛咖组和运动组。其分子机制一方面是补充玛咖可以明显提高肾脏线粒体谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，清除过量的丙二醛，保护细胞膜结构和功能完整性，增强人体细胞免疫功能，力竭运动后老年大鼠肾脏线粒体抗氧化酶活性的提高可能与玛咖本身含有多种生物活性物质有关^[30]。另一方面在长期递增负荷运动训练刺激下，大鼠肾脏线粒体适应性增加了抗氧化酶的活性及对脂质过氧化物的耐受能力，从而对延缓细胞及人体衰老起一定的积极作用。但实验的不足之处是玛咖的剂量不同，造成影响效果可能会存在差异，以后有待进一步探讨。

总之，补充玛咖、运动训练、补充玛咖结合运动训练均可提高老年大鼠力竭运动后肾脏线粒体呼吸功能，提高抗氧化能力，降低脂质过氧化物含量，增强人体耐受力，延缓人体衰老。且补充玛咖结合运动训练具有良好的协同作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程