玻璃体腔注射促红细胞生成素保护糖尿病视网膜病变模型大鼠的视神经作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (18): 2690-2696.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.18.016

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玻璃体腔注射促红细胞生成素保护糖尿病视网膜病变模型大鼠的视神经作用

张永红¹，张晓湄¹，韦笑一¹，唐柳苹¹，刘代华²，凌宇¹

广西壮族自治区柳州市人民医院，1眼科，2药剂科，广西壮族自治区柳州市 545006

收稿日期:2016-03-15 出版日期:2016-04-29 发布日期:2016-04-29
通讯作者: 张永红，广西壮族自治区柳州市人民医院眼科，广西壮族自治区柳州市 545006
作者简介:张永红，女，1977年生，湖南省衡阳市人，汉族， 2008年中南大学湘雅医学院毕业，博士，副主任医师。
基金资助:
广西自然科学基金项目(2010GXNSFB013090)

Vitreous cavity injection with erythropoietin protects optic nerve in a rat model of diabetic retinopathy

Zhang Yong-hong¹, Zhang Xiao-mei¹, Wei Xiao-yi¹, Tang Liu-ping¹, Liu Dai-hua², Ling Yu¹

1Department of Ophthalmology, 2Department of Pharmacy, Liuzhou People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2016-03-15 Online:2016-04-29 Published:2016-04-29
Contact: Zhang Yong-hong, Department of Ophthalmology, Liuzhou People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Yong-hong, M.D., Associate chief physician, Department of Ophthalmology, Liuzhou People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Liuzhou 545006, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2010GXNSFB013090

摘要/Abstract

摘要：

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文章快速阅读：
促红细胞生成素：是一种参与中枢神经包括视网膜损伤反应的重要介质，参与机体多种功能的调节。且具有良好的水溶性，可以直接经玻璃体注射给药，在多种视网膜损伤的动物模型中发挥保护作用，如促进视网膜节细胞的生长，保护视神经横断眼的节细胞、保护视网膜免受缺血再灌注损伤等。

糖尿病视网膜病变：是糖尿病眼病不可逆最严重可致盲的并发症，由于糖代谢紊乱，容易并发视网膜微血管系统损伤，最终导致视网膜一系列病理改变，包括血管舒缩调节功能失常、血管周细胞凋亡和血管基底膜增厚等。

背景：糖尿病会导致多种并发症的出现，其中视网膜病变是一种常见的类型，为探究促红细胞生成素在糖尿病视网膜病变中的作用，建立具有临床视网膜新生血管相似病理特征且重复性高的动物模型是十分必要的。

目的：观察玻璃体腔注射促红细胞生成素对糖尿病视网膜病变大鼠视神经的保护作用。

方法：建立糖尿病视网膜病变模型大鼠，于玻璃体腔注射促红细胞生成素干预，连续注射14 d，设模型组和正常对照组作对比。

结果与结论：①透射电镜观察：与模型组相比，促红细胞生成素组视网膜神经节细胞核呈现出均匀的染色，细胞膜完整，内质网呈轻微肿胀，细胞核周围线粒体存在数量较少的空泡；②Western blot和RT-PCR检测：与模型组相比，促红细胞生成素组Caspase-3激活型、Bax蛋白表达降低(P < 0.05)，Caspase-3原型蛋白和Bcl-2蛋白表达明显提高(P < 0.05)，两组核转录因子κB和Survivn基因的表达也差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果证实：玻璃体腔注射促红细胞生成素对糖尿病视网膜病变大鼠视神经有保护作用，可能与其抑制细胞凋亡有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0003-1237-7449(张永红)

关键词: 实验动物, 细胞损伤与修复模型, 糖尿病, 并发症, 玻璃体, 玻璃体腔, 腔内注射, 视网膜病变, 促红细胞生成素, 大鼠, 细胞凋亡, 凋亡因子, 广西壮族自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Diabetes can lead to many complications. Of them, retinopathy is a common type. To explore the effect of erythropoietin in diabetic retinopathy, it is necessary to establish an animal model of similar pathologic features and high reproducibility in clinical retinal neovascularization.

OBJECTIVE: To investigate the protective effect of vitreous cavity injection of erythropoietin on optic nerve of rats with diabetic retinopathy.

METHODS: Rat models of diabetic retinopathy were established and injected with erythropoietin through vitreous space for 14 consecutive days. Results were compared between the model and normal control groups.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Transmission electron microscope: compared with the model group, retinal ganglion cell nucleus presented uniform red; cell membrane was intact; endoplasmic reticulum exhibited slight swelling. A small number of vacuoles were found in mitochondria around the nuclei. (2) Western blot assay and RT-PCR: compared with the model group, Caspase-3 and Bax protein expression was lower in the erythropoietin group (P < 0.05). Caspase-3 protein and Bcl-2 protein expression was significantly higher in the erythropoietin group than in the model group (P < 0.05). Significant differences in nuclear factor κB and Survivn gene expression were detected between the model and erythropoietin groups (P < 0.05). (3) Results verified that vitreous cavity injection of erythropoietin had neuroprotective effect on rats with diabetic retinopathy, which may be associated with the inhibitory effect on apoptosis.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Models, Animal, Diabetes Mellitus

张永红，张晓湄，韦笑一，唐柳苹，刘代华，凌宇. 玻璃体腔注射促红细胞生成素保护糖尿病视网膜病变模型大鼠的视神经作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(18): 2690-2696.

Zhang Yong-hong, Zhang Xiao-mei, Wei Xiao-yi, Tang Liu-ping, Liu Dai-hua, Ling Yu. Vitreous cavity injection with erythropoietin protects optic nerve in a rat model of diabetic retinopathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(18): 2690-2696.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析入组的大鼠30只全部进入最终结果分析，未出现中途死亡动物，无脱落。实验流程见图1。

2.2 模型创新性实验中利用链脲佐菌素诱导获得实验所需动物模型，链脲佐菌素所产生的不良反应相对较小，可以在增加药物剂量提高实验动物成模率、成模后血糖水平和降低自缓解率的同时，减少实验动物的死亡。

2.3 模型稳定性建模后大鼠出现视网膜神经节细胞层内核层水肿视网膜神经节细胞减少、静脉扩张与基底膜增厚等病理改变，对临床早期糖尿病视网膜病变情况进行了较之直观的模拟。相关的实验方法和结果等，可以为临床糖尿病视网膜病变提供一定的实验依据。

2.4 大鼠视网膜组织损伤情况玻璃体腔注射后30 d，正常对照组视网膜神经节细胞处于正常状态，核染色均匀，颜色清晰，细胞核周围散落分布不同的细胞器，细胞膜完整，形态正常(图2A)。促红细胞生成素组视网膜神经节细胞核呈现出均匀的染色，细胞膜完整，内质网呈轻微肿胀，细胞核周围线粒体存在数量较少的空泡(图2B)。模型组视网膜神经节细胞出现明显的核固缩，细胞核染色加深。线粒体嵴消失，周围可见存在大量的线粒体空泡(图2C)。

2.5 大鼠视网膜节细胞Caspase-3，Bax，Bcl-2的表达Western blot检测分析结果显示，与模型组相比，促红细胞生成素组Caspase-3激活型、Bax蛋白表达降低，Caspase-3原型蛋白和Bcl-2蛋白表达明显提高(P < 0.05)，见表2和图3。

2.6 大鼠视网膜节细胞核转录因子κB和Survivn基因的表达经PCR检测显示，正常对照组和模型组的核转录因子κB基因表达无差异；模型组与促红细胞生成素组的核转录因子κB表达差异有显著性意义(P < 0.05)；模型组较正常对照组的Survivn基因表达显著降低(P < 0.05)；而促红细胞生成素组较模型组的Survivn基因表达明显升高(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物模型实验。

1.2 时间及地点 2013年10月至2014年7月在山东大学附属省立医院脊柱外科完成。

1.3 造模动物及材料 SD大鼠30只，雌雄各半，体质量180-220 g，由济南市金丰实验动物繁育有限公司提供，许可证号SCXK(鲁)2014-0010，动物一般情况良好。促红细胞生成素由上海益新医药有限公司提供，批准文号：国药准字S20020045。

1.4 造模及干预将30只SD大鼠随机分为3组，正常对照组10只，为促红细胞生成素组10只，模型组10只。促红细胞生成素组于建模成功后用微量进样器在角巩膜缘后进针，于玻璃体腔注射促红细胞生成素5 μL(促红细胞生成素用生理盐水稀释至40 mg/L)，正常对照组和模型组于玻璃体腔注射相同体积的生理盐水。连续注射14 d，每周进行眼底荧光造影^[12]。

糖尿病视网膜病变模型大鼠的建立：促红细胞生成素组与模型组建立糖尿病视网膜病变模型。大鼠适应性喂养1周，禁食12 h，以60 mg/kg链脲佐菌素(苏州拜吉氏生物科技有限公司；临用前用0.1 mmol/L，pH 4.2的柠檬酸钠缓冲液配成20 g/L的溶液)快速一次性左下腹腔注射建立糖尿病模型，给药后24 h及1周时经尾静脉采血，检测清晨血糖水平，如果经2次检测血糖水平均在16.7 mol/L以上，则视为糖尿病模型建立成功。

1.5 造模成功的检测标准糖尿病模型建立成功后，继续进行观察，对动物进行眼底镜和荧光素眼底造影检查，发现微血管瘤、毛细血管扩张、动静脉异常等，则视为早期糖尿病视网膜病变建立成功^[11]。

1.6 透射电镜检测玻璃体腔注射后30 d，大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉处死，用眼科显微器械迅速取出一侧眼球，置于体积分数3%二醛固定液中，在手术显微镜下快速沿角巩膜缘剪除角膜，去除晶体虹膜及玻璃体组织，使固定液完全覆盖视网膜，常规体积分数1%饿酸固定，系列丙酮脱水，环氧树脂包埋，经光学显微镜下定位，超薄切片后，透射电镜(重庆康华瑞明科技股份有限公司)观察各组大鼠的视网膜神经节细胞超微结构的改变。

1.7 视网膜神经节细胞相关因子表达的检测玻璃体腔注射后30 d，大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉处死，获得眼球标本，以Western blot法检测各组大鼠视网膜神经节细胞相关指标(Caspase-3，Bax，Bcl-2等)的蛋白表达水平^[13]。收集细胞，用PBS洗涤。抽提细胞裂解液，进行蛋白定量，电泳后进行硝酸纤维素膜或PVDF膜转移。添加体积分数5%脱脂奶粉进行封闭，置于室温1.5-2.0 h或4 ℃过夜，添加Caspase-3多抗或单抗室温反应一两小时或4 ℃过夜。利用TBST洗3次，5-10 min/次，添加HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应一两小时，利用TBST洗3次，5-10 min/次，以GAPDH为内参，最后进行显色。结果用目的蛋白和内参的灰度值相对比值表示。

用RT-PCR方法检测各组大鼠视网膜神经节细胞相关指标(核转录因子κB和Survivn)的基因表达水平^[13]。进行引物设计及合成，按照目的基因序列设计引物，以GAPDH基因为内参，引物由上海生工生物工程有限公司合成并经质量检测。

引物序列：
引物	序列
核转录因子κB	上游：5’-CCC TGC AGC TGG AGA GTG TGG-3’，下游：5’-ACC AGT TGG GGA ACT GTG CAG AC-3’
Survivn	上游：5’-GGC CAG CCC AGA AAC CAG CC-3’ 下游：5’-ACT GCA CTG GCT GAG ACA GCA C-3'

取各组视网膜放入玻璃匀浆器中，加入1 mL Trizol充分匀浆，将匀浆液转入1.5 mL EP管中，静置5 min，提取各组大鼠视网膜总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳。

1.8 主要观察指标注射后30 d，电镜下观察组织损伤情况，并观察Western blot检测结果，观察大鼠视网膜神经节细胞相关指标蛋白表达水平和视网膜神经节细胞相关指标基因表达情况。

1.9 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，利用SPSS 19.0软件完成数据处理。组间数据比较采用配对t 检验和单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 糖尿病并发症糖尿病患者可能出现视物模糊，引起白内障、眼肌麻痹、糖尿病视网膜病变等病症，其中视网膜疾病更为常见^[14]。糖尿病视网膜病变包括视网膜微小动脉瘤、出血和渗出，是糖尿病的严重并发症之一^[15]。糖尿病视网膜病变是高血糖对视网膜微小血管的损伤所引起的，它是重要的致盲眼病，但早期一般没有症状，患者也无异样感，容易被忽视。但随着疾病的发展，会逐渐发展为严重的增殖性病变导致各种严重后果的出现，包括视网膜脱离等^[16-18]。从而严重影响患者及家庭的生活水平，也是导致患者失明的主要原因。

3.2 糖尿病动物模型目前，糖尿病动物模型建模方法主要有自发性动物模型、基因敲除与转基因型、手术和化学药物诱导等几种。其中，通过化学诱导方式进行建模，可以获得较满意的结果，是目前糖尿病并发症研究的主流方法。此次实验需要对动物模型进行较长的观察，所以要求建模方法获得的动物模型血糖水平必须较高、成模时间尽可能短，成功率高、同时自缓解率、病死率尽可能地低以获得实验分组所需的样本数目。另外，实验选择利用链脲佐菌素所产生的不良反应相对较小，可在增加药物剂量提高实验动物成模率、成模后血糖水平和降低自缓解率的同时仍维持较低的实验动物死亡率。为此，在此次实验中，选择通过链脲佐菌素诱导的方法建立糖尿病实验动物模型。实验通过链脲佐菌素腹腔注射成功地制作了糖尿病动物模型。实验中还观察到，随着糖尿病病程的延长，实验动物开始出现视网膜神经节细胞层内核层水肿视网膜神经节细胞减少、静脉扩张与基底膜增厚等病理改变。从而对临床早期糖尿病视网膜病变情况进行了很好的模拟。

3.3 糖尿病视网膜病变促红细胞生成素治疗促红细胞生成素是一种激素样物质，由肝脏以及肾脏分泌，可以发挥出促进红细胞生成的作用^[19-22]。促红细胞生成素有保护视网膜的作用，对人类胚胎期视网膜的形成起着非常关键的作用。视网膜供氧和供血不足，正是缺少促红素的表现^[23-25]。促红细胞生成素还具有很强的营养神经营养的作用，可以对不同神经产生十分重要的影响，有效促进其分化和存活以及再生^[26-28]，且促红细胞生成素具有良好的水溶性，可直接经玻璃体注射给药^[29]。因此，临床对糖尿病视网膜病变患者进行治疗的过程中，可采用玻璃体腔注射促红细胞生成素的方式^[30-32]。为了研究糖尿病早期视网膜病变的玻璃体腔内注射促红细胞生成素治疗的效果，实验选择对玻璃体腔内注射促红细胞生成素后视神经情况进行观察。通过电镜下观察发现，促红细胞生成素组视网膜神经节细胞核呈现出均匀的染色，细胞膜完整，内质网呈轻微肿胀，细胞核周围线粒体存在数量较少的空泡。模型组视网膜神经节细胞出现明显的核固缩，细胞核染色加深，线粒体嵴消失，周围可见存在大量的线粒体空泡。上述结果表明玻璃体腔内注射促红细胞生成素后视网膜神经节细胞超微结构得到显著的改善。

实验还对各凋亡因子水平进行了分析，以了解促红细胞生成素的抑制细胞凋亡作用。其中，Caspase-3激活型是凋亡因子，介导细胞凋亡^[36]。Caspase-3原型是一个与Caspase-3激活型互补的指标，激活型表达增高，原型则表达下降，简而言之，若组织有损伤，激活型表达增高，而原型的表达下降^[33-37]。Bax是凋亡因子，可介导细胞凋亡。Bcl-2是抗凋亡因子，可抑制细胞凋亡。核转录因子κB是核因子，可调控细胞的生长^[38]。

实验通过检测和比较发现，正常对照组和模型组的核转录因子κB表达无显著差异；模型组与促红细胞生成素组的核转录因子κB表达有显著差异，提示促红细胞生成素能提高神经节细胞中核转录因子κB的表达水平，改善细胞损伤，抗凋亡。Survivn是抗凋亡因子，抑制细胞凋亡。数据统计表明，模型组较正常对照组的Survivn表达显著降低，提示糖尿病导致视网膜神经节细胞凋亡；而促红细胞生成素组较模型组的Survivn表达明显升高。实验结果表明，糖尿病会导致视网膜神经节细胞凋亡，对视网膜神经节细胞造成损伤损伤。经玻璃体腔注射促红细胞生成素之后，可显著改善大鼠视网膜各项指标，抑制细胞凋亡，保护视网膜细胞存活的效果，具有一定的临床应用前景^[39-40]。

综上所述，作者此次实验对糖尿病早期视网膜病变的玻璃体腔内注射促红细胞生成素治疗的效果进行了分析，为临床糖尿病早期视网膜病变的治疗提供了一定的参考依据。但是，糖尿病早期视网膜病变的发病机制十分复杂，各种因素之间彼此作用，互相影响，促红细胞生成素与其他致病因素以及促红细胞生成素与其他生长因子之间的关系尚不清楚，有待在今后进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

玻璃体腔注射促红细胞生成素保护糖尿病视网膜病变模型大鼠的视神经作用

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