缓释重组人骨形态发生蛋白2仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架的制备及表征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (16): 2384-2390.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.16.014

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缓释重组人骨形态发生蛋白2仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架的制备及表征

丁琛，刘浩

四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041

收稿日期:2016-03-08 出版日期:2016-04-15 发布日期:2016-04-15
通讯作者: 刘浩，博士，博士生导师，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041
作者简介:丁琛，男，1984年生，四川省威远县人，汉族，2014年四川大学华西临床医学院毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱外科及骨组织工程方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81572141)

A novel biomimetic nanofibrous heparin/gelatin scaffold with sustained-release recombinant human bone morphogenetic protein-2: preparation and characterization

Ding Chen, Liu Hao

Department of Orthopedic Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Received:2016-03-08 Online:2016-04-15 Published:2016-04-15
Contact: Liu Hao, M.D., Doctoral supervisor, Department of Orthopedic Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Ding Chen, M.D., Attending physician, Department of Orthopedic Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81572141

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨形态发生蛋白2：属于转化生长因子β超家族，在骨再生的多个阶段起重要作用，它能够刺激细胞增殖，成骨细胞分化并诱导骨基质形成，被认为是骨诱导能力最强的生长因子之一。但骨形态发生蛋白2在体内环境中的半衰期较短，容易被体液酶解稀释，若大剂量应用则易导致全身并发症，所以研究者们致力于采用合适的载体搭载骨形态发生蛋白2，以控制其释放，从而提高它的生物效应。

纳米纤维肝素/明胶复合支架：利用催化反应使肝素与明胶共价结合，制备肝素化明胶，然后将普通明胶与肝素化明胶以不同比例混合，利用热致相分离结合致孔剂洗出技术，制备出纳米纤维肝素/明胶复合支架，使该材料在模拟骨组织细胞外基质纳米纤维结构的同时，能实现对骨形态发生蛋白2的缓释。

背景：仿生结构是近年来组织工程支架设计最重要的目标之一，但文献报道的仿生支架多不具有缓释生长因子的能力。

目的：制备新型仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架，观察其微观结构、机械强度及对重组人骨形态发生蛋白2的缓释作用。

方法：利用化学交联方法制备肝素化明胶材料，将不同比例的普通明胶和肝素化明胶材料混合，利用热致相分离法和模板成孔技术，制备出含0，20%，40%肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架。扫描电镜观察新型支架的微观结构，甲苯胺蓝法检测各组支架中的肝素含量，测试支架机械强度，采用ELISA法测定各组支架对重组人骨形态发生蛋白2的释放情况。

结果与结论：①纳米纤维肝素/明胶复合支架有很高的孔隙率，大孔结构250-420 μm，孔隙连通度良好，且孔壁具有仿生纳米纤维结构；②含0，20%，40%肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架中的肝素含量分别为0，(12.82±2.49)，(25.08±3.69) mg/g，3组间比较差异有显著性意义(P<0.05)；③含0，20%，40%肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架的弹性模量分别为(299±38)，(286±40)， (236±33) kPa，3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④随着肝素化明胶含量的增加，纳米纤维肝素/明胶复合支架对重组人骨形态发生蛋白2的吸附能力增强，显著降低重组人骨形态发生蛋白2的突释，延长释放时间。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
ORCID:0000-0001-6974-9691(刘浩)

关键词: 生物材料, 缓释材料, 重组人骨形态发生蛋白2, 肝素, 明胶, 纳米纤维, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bionic structure is one of the most important goals of scaffold design in tissue engineering. However, the majority of the bionic scaffolds do not have the capacity of sustained release of growth factors.

OBJECTIVE: To fabricate a novel biomimetic nanofibrous heparin/gelatin scaffold and investigate the characterization of the scaffolds including the microstructure, the mechanical strength and in vitro recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) release.

METHODS: Heparin-conjugated gelatin was prepared by chemical crosslinking and mixed with gelatin at different ratios. Nanofibrous composite scaffolds with different ratios of heparin-conjugated gelatin (0, 20% and 40%) were fabricated by using a thermally induced phase separation combined with particle leaching technique. The amount of conjugated heparin in the scaffolds, scaffold microstructures and mechanical strength were detected and observed. The release kinetics of rhBMP-2 from the scaffolds with different concentrations of heparin conjugated gelatin was detected using ELISA method.

RESULTS AND CONCLUSION: The composite scaffolds possessed abundant porosities, good mechanical properties, and biomimetic nano-structures. The macroporous size was 250-420 μm. When the ratio of heparin-conjugated gelatin was 0, 20% and 40%, the content of heparin in the scaffolds was 0, (12.82±2.49) and (25.08±3.69) mg/g, respectively, with significant differences; the elastic modulus of the composite scaffolds was (299±38), (286±40) and (236±33) kPa, respectively, with insignificant differences (P > 0.05). With the increase in the content of heparin-conjugated gelatin, the rhBMP-2 adsorption capacity of the nanofibrous heparin/gelatin scaffold is improved, thereby significantly reducing the burst release of rhBMP-2 and prolonging the releasing time.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Bone Morphogenetic Proteins, Heparin, Gelatin, Braces, Delayed-Action Preparations, Tissue Engineering

丁琛，刘浩. 缓释重组人骨形态发生蛋白2仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架的制备及表征[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(16): 2384-2390.

Ding Chen, Liu Hao. A novel biomimetic nanofibrous heparin/gelatin scaffold with sustained-release recombinant human bone morphogenetic protein-2: preparation and characterization[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(16): 2384-2390.

图/表（结果） 3

2.1 肝素化明胶的表征通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺催化、透析、冻干，成功制备了乳白色、絮状的肝素化明胶。肝素、明胶、肝素化明胶的衰减全反射傅里叶变换红外光谱图，见图1。因肝素中含磺酸基而明胶中不含，在1 058 cm^-1及 1 250 cm^-1附近纯肝素图谱及肝素化明胶图谱均出现了磺酸基的特征性吸收峰，而明胶图谱没有出现类似的特征性吸收峰，表明肝素被成功交联到了明胶上。甲苯胺蓝法测得肝素化明胶中肝素的含量为(78.59±3.64) mg/g，证明了该方法高效的将肝素交联到了明胶上。

2.2 复合支架扫描电镜观察结果肝素化明胶含量为0，20%，40%的3组支架微观结构相似，典型扫描电镜图片，见图2，其面积/体积比极大，有很高的孔隙率 (> 96%)。250-420 μm的石蜡微球被选为模板，因为有研究已证明该大孔尺寸有利于成骨细胞的黏附、增殖、分化^[23]。

3组支架均有致孔剂洗出所致的250-420 μm大孔结构(图2A)，每个大孔均有石蜡热处理所致的孔隙与其他大孔联通，整个支架连通度良好(图2B)，为细胞长入提供了空间。大孔壁为致密的纳米纤维结构，纳米纤维直径在50-500 nm之间，与骨组织细胞外基质的纳米纤维结构在相同的尺度范围(图2C)。在实验中发现，当进一步增加支架中肝素化明胶比例至60%及以上时，支架的大孔结构及有序排列的纳米纤维结构均消失。

2.3 支架中肝素含量测定结果用甲苯胺蓝法测得含0、20%、40%肝素化明胶的3组复合支架中肝素的含量分别为0，(12.82±2.49)，(25.08±3.69) mg/g，3组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，说明热致相分离结合致孔剂洗出技术制备支架过程中肝素没有明显丢失。

2.4 支架机械强度测定纯明胶支架的弹性模量为(299±38) kPa，含20%、40%肝素化明胶复合支架的弹性模量分别为(286±40)，(236±33) kPa，与纯明胶支架相比有一定下降，但差异均无显著性意义(P > 0.05)，说明了当肝素化明胶含量为40%时，复合支架的机械强度并没有明显下降。

2.5 各组支架对重组人BMP-2的释放动力学纯明胶支架和含20%、40%肝素化明胶的复合支架吸附等量重组人BMP-2后的体外释放曲线，见图3。

纯明胶支架对重组人BMP-2的释放迅速，第1天的突释率高达(79.1±3.7)%，7 d时已释放(93.9±3.5)%， 14 d之前既已完全释放。含20%肝素化明胶的复合支架，第1天的重组人BMP-2突释率较高，为(50.2±4.0)%，之后释放较为缓慢，第7，14，21天的释放率分别为(75.2±3.5)%、(81.8±4.4)%及(89.1±3.0)%。含40%肝素化明胶的复合支架对重组人BMP-2也有一定的突释，为(19.9±4.4)%，该支架基本实现了对重组人BMP-2缓慢的持续性释放，到21 d时仍有超过20%的重组人BMP-2吸附于支架上。

参考文献

[1] Xu B,Xu H,Wu Y,et al.Intervertebral disc tissue engineering with natural extracellular matrix-derived biphasic composite scaffolds.PLoS One.2015;10(4): e0124774.

[2] 马新芳,张静莹.骨组织工程支架材料的研究现状与应用前景[J].中国组织工程研究,2014, 18(30):4895-4899.

[3] Holzwarth JM, Ma PX.Biomimetic nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 2011;32(26):9622-9629.

[4] Ruiz-Hitzky E,Darder M,Aranda P,et al.Advances in biomimetic and nanostructured biohybrid materials. Adv Mater.2010;22(3):323-326.

[5] Xie J,Peng C,Zhao Q,et al.Osteogenic differentiation and bone regeneration of iPSC-MSCs supported by a biomimeticnanofibrous scaffold.Acta Biomater.2016;29: 365-379.

[6] Qu T,Liu X.Nano-structured gelatin/bioactive glass hybrid scaffolds for the enhancement of odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells.J Mater Chem B Mater Biol Med.2013;1(37):4764-4772.

[7] Liu X,Ma PX.Phase separation, pore structure, and properties of nanofibrous gelatin scaffolds. Biomaterials. 2009;30(25):4094-4103.

[8] Liu X,Smith LA,Hu J,et al.Biomimetic nanofibrous gelatin/apatite composite scaffolds for bone tissue engineering.Biomaterials.2009;30(12):2252-2258.

[9] Rey-Rico A,Silva M,Couceiro J,et al.Osteogenic efficiency of in situ gelling poloxamine systems with and without bone morphogenetic protein-2. Eur Cell Mater.2011; 21(4):317-340.

[10] Lieberman JR,Daluiski A,Einhorn TA.The role of growth factors in the repair of bone. Biology and clinical applications.J Bone Joint Surg Am. 2002; 84-A(6):1032-1044.

[11] Bouxsein ML,Turek TJ,Blake CA,et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 accelerates healing in a rabbit ulnar osteotomy model.J Bone Joint Surg Am.2001; 83-A(8): 1219-1230.

[12] Vo TN,Kasper FK,Mikos AG,et al.Strategies for controlled delivery of growth factors and cells for bone regeneration.Adv Drug Deliv Rev. 2012;64(12):1292- 1309.

[13] 马立坤,叶鹏,黄文良,等.骨形态发生蛋白2/聚乳酸缓释微球的制备及表征[J].中国组织工程研究, 2014,18(3): 395-400.

[14] 王玮,尹庆水,张余.负载重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖纳米微球的制备及异位成骨活性研究[J].中华创伤骨科杂志,2012,14(2):147-152.

[15] Carreira AC,Lojudice FH,Halcsik E,et al.Bone morphogenetic proteins: facts, challenges, and future perspectives.J Dent Res.2014;93(4):335-345.

[16] Lee J,Yoo JJ,Atala A,et al.The effect of controlled release of PDGF-BB from heparin-conjugated electrospun PCL/gelatin scaffolds on cellular bioactivity and infiltration.Biomaterials.2012;33(28):6709-6720.

[17] Seib FP, Herklotz M, Burke KA, et al. Multifunctional silk-heparin biomaterials for vascular tissue engineering applications.Biomaterials. 2014;35(1): 83-91.

[18] Zuo Q,Guo R,Liu Q,et al.Heparin-conjugated alginate multilayered microspheres for controlled release of bFGF. Biomed Mater.2015;10(3):035008.

[19] Lu Q,Li M,Zou Y,et al. Delivery of basic fibroblast growth factors from heparinized decellularized adipose tissue stimulates potent de novo adipogenesis.J Control Release. 2014;174:43-50.

[20] Bhakta G,Rai B,Lim ZX,et al.Hyaluronic acid-based hydrogels functionalized with heparin that support controlled release of bioactive BMP-2. Biomaterials. 2012;33(26): 6113-6122.

[21] 刘秀英,张超灿,徐卫林,等.甲苯胺蓝分光光度法测定肝素钠的研究[J].化学试剂,2009, 31(4):271-274.

[22] Lin H,Zhao Y,Sun W,et al.The effect of crosslinking heparin to demineralized bone matrix on mechanical strength and specific binding to human bone morphogenetic protein-2. Biomaterials. 2008;29(9): 1189-1197.

[23] Karageorgiou V,Kaplan D.Porosity 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 2005;26(27): 5474-5491.

[24] Banwart JC,Asher MA,Hassanein RS.Iliac crest bone graft harvest donor site morbidity. A statistical evaluation. Spine (Phila Pa 1976).1995;20(9): 1055-1060.

[25] Florczyk SJ,Leung M,Li Z,et al.Evaluation of three-dimensional porous chitosan–alginate scaffolds in rat calvarial defects for bone regeneration applications. J Biomed Mater Res. 2013;101(10): 2974-2983.

[26] De Long Jr WG,Einhorn TA,Koval K,et al.Bone grafts and bone graft substitutes in orthopaedic trauma surgery. A critical analysis.J Bone Joint Surg A. 2007; 89(3): 649-658.

[27] Xiao W,Fu H,Rahaman MN,et al.Hollow hydroxyapatite microspheres: a novel bioactive and osteoconductive carrier for controlled release of bone morphogenetic protein-2 in bone regeneration.Acta Biomater. 2013; 9(9): 8374-8383.

[28] Hollister SJ. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater.2005;4(7): 518-524.

[29] Bueno EM,Glowacki J.Cell-free and cell-based approaches for bone regeneration. Nat Rev Rheumatol. 2009;5(12):685-697.

[30] 谢兴文,姜徽,李宁,等.重组人骨形态发生蛋白2诱导骨修复的应用及前景[J].中国组织工程研究, 2013,17(7): 1319-1323.

[31] Galimberti F,Lubelski D,Healy AT,et al.A systematic review of lumbar fusion rates with and without the use of rhBMP-2.Spine (Phila Pa 1976). 2015;40(14):1132-1139.

[32] Zhao B,Katagiri T,Toyoda H,et al.Heparin potentiates the in vivo ectopic bone formation induced by bone morphogenetic protein-2.J Biol Chem.2006;281(32): 23246-23253.

[33] Li Z,Qu T,Ding C,et al.Injectable gelatin derivative hydrogels with sustained vascular endothelial growth factor release for induced angiogenesis.Acta Biomater. 2015;13:88-100.

[34] 李娟,吴英锋,杨新林.肝素功能化生物材料的研究进展[J].有机化学,2010,30(3):359-367.

[35] 马寅孙,蔡玉荣,刘琳,等.肝素化丝素支架作为骨形态发生蛋白-2缓释载体的研究[J].化学学报,2012, 70(4): 479-484.

[36] Jeon O,Song SJ,Kang SW,et al.Enhancement of ectopic bone formation by bone morphogenetic protein-2 released from a heparin-conjugated poly(L-lactic-co-glycolic acid) scaffold.Biomaterials. 2007;28(17):2763-2771.

[37] Xu X,Jha AK,Duncan RL,et al.Heparin-decorated, hyaluronic acid-based hydrogel particles for the controlled elease of bone morphogenetic protein 2.Acta Biomater.2011; 7(8):3050-3059.

[38] Sachar A,Strom TA,Serrano MJ,et al.Osteoblasts responses to three-dimensional nanofibrous gelatin scaffolds.J Biomed Mater Res A. 2012;100(11): 3029-3041.

[39] Sun Y,Jiang Y,Liu Q,et al.Biomimetic Engineering of Nanofibrous Gelatin Scaffolds with Noncollagenous Proteins for Enhanced Bone Regeneration.Tissue Eng Part A.2013; 19(15-16):1754-1763.

[40] Ma PX,Zhang R.Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. J Biomed Mater Res. 1999;46(1):60-72.

引言

作为种子细胞和生长因子的载体，合适的支架材料在骨组织工程中发挥关键作用。骨组织工程支架应具有良好的生物相容性、生物可降解性、三维多孔结构、适当的机械强度等特点^[1-2]。除此之外，仿生，即模仿天然细胞外基质的组成和结构，也是优良骨组织工程支架应具备的重要特征之一^[3-5]。之前有文献报道利用热致相分离结合致孔剂洗出技术，成功制备了三维纳米纤维明胶支架，其表面积大、孔隙率高、大孔之间连接良好，且大孔壁具有纳米纤维结构^[6-7]。该支架材料模拟了天然细胞外基质的化学组成和微观结构，且已被证明是骨再生的优良支架^[8]，但是该支架不具备骨诱导能力。

骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)在骨再生的多个阶段起重要作用，它能够刺激细胞增殖，成骨细胞分化并诱导骨基质形成，被认为是骨诱导能力最强的生长因子之一^[9-11]。但BMP-2在体内环境中的半衰期较短，容易被体液酶解稀释，若大剂量应用则易导致全身并发症，所以研究者们致力于采用合适的载体搭载BMP-2，以控制其释放，从而提高它的生物效应^[12-15]。肝素是一种硫酸化多糖，对多种生长因子具有较强的结合能力，共价结合了肝素的支架材料已被证明能实现生长因子的缓释，且生长因子的生物活性得到了很好的保留^[16-19]。目前已有研究报道肝素修饰的支架材料，搭载BMP-2很好地促进了骨再生^[20]，但尚没有关于结合肝素明胶材料促进成骨的报道。

实验利用催化反应使肝素与明胶共价结合，制备肝素化明胶，然后将普通明胶与肝素化明胶以不同比例混合，利用热致相分离结合致孔剂洗出技术，制备出纳米纤维肝素/明胶复合支架，期待该材料在模拟骨组织细胞外基质纳米纤维结构的同时，能实现对BMP-2的缓释，从而更好地促进骨缺损修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至10月在四川大学华西医院骨科实验室完成。

1.3 材料

支架制备及表征实验用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
肝素钠、B型明胶、2-(N-吗啉)乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、BMP-2 ELISA试剂盒	美国Sigma公司
100%乙醇、二氧六环、环己烷、磁力搅拌器	美国Fisher Scientific公司
重组人BMP-2	美国Biologics公司
甲苯胺蓝	美国Amresco公司
-80 ℃超低温冰箱	日本Sanyo公司
冷冻干燥机	美国Labconco公司
衰减全反射傅立叶变换红外光谱仪(ATR-FTIR)、Nanodrop 2000 c分光光度计	美国Thermo Scientific公司
JSM-6010LA分析型扫描电子显微镜(SEM)	日本JEOL公司
TestResources力学实验系统	美国TestResources公司

1.4 实验方法

肝素化明胶的制备及表征：将0.98 g 2-(N-吗啉)乙磺酸及1.17 g NaCl加入100 mL蒸馏水中，配制2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液100 mL，2-(N-吗啉)乙磺酸和NaCl的浓度分别为50 mmol/L、0.2 mol/L。将该缓冲液平均分成2份，其中1份加入2 g明胶，加热溶解后恢复至室温；称取0.5 g肝素钠溶于另一份2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，溶解后加入0.55 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，5 min后加入0.13 g N-羟基丁二酰亚胺，充分搅拌10 min，使肝素的羧基(-COOH)活化。将上述两份溶液混合，室温下搅拌过夜。在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的作用下，明胶上活化的氨基(-NH₂)和肝素上活化的-COOH充分反应，形成稳定的酰胺键，肝素即被交联到明胶上。溶液经透析并冷冻干燥后，即得到肝素化明胶。对肝素、明胶、肝素化明胶行ATR-FTIR光谱分析。用文献报道的甲苯胺蓝法测定复合材料中的肝素含量^[21-22]。

纳米纤维肝素/明胶复合支架的制备：利用热致相分离结合致孔剂洗出技术制备纳米纤维肝素/明胶复合支架^[7-8]。将肝素化明胶及普通明胶共1 g(肝素化明胶的比率分别为0、20%、40%)，在50 ℃条件下同时溶于10 mL乙醇/水(体积比1∶1)混合溶液中。称取0.4 g直径为250-420 μm的石蜡微球，放入特氟龙涂层模具中，按压平整后置于37 ℃烘箱中40 min，取出后冷却至室温。在每个有石蜡微球的模具中逐滴加入约0.35 mL上述溶液，使其均匀分布于石蜡微球间隙。将装有溶液/石蜡微球复合体的模具放入-76 ℃冰箱内至少4 h进行相分离。取出后经二氧六环溶剂置换及冻干，复合体被切成直径17 mm、厚度1.5 mm的圆片，并浸入环己烷中洗出石蜡微球。再次冻干24 h，即得到了含不同比例肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架。该支架在使用前须化学交联(于4 ℃含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中进行)，以提高其热力学和机械特性^[7-8]。

1.5 主要观察指标

复合支架表面形貌观察：样本喷金后，扫描电镜观察支架的表面形貌，包括大孔大小、连通度、孔壁纳米纤维结构等，加速电压设为20 kV。

支架中肝素含量测定：甲苯胺蓝法测定各组支架中肝素含量，以判断支架制备过程中肝素有无丢失。

支架机械强度测定：用TestResources力学实验系统测试干燥状态下支架的弹性模量^[7]。肝素化明胶含量分别为0，20%，40%的支架各3个，交联时间8 h。样本以0.5 mm/min的速度加载，绘制应力-应变曲线，线性部分斜率用来计算弹性模量，用x(_)±s形式代表各组支架的弹性模量。

支架对重组人BMP-2的释放动力学：重组人BMP-2体外释放实验采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)测定。含0、20%、40%肝素化明胶含量的支架各取3个，直径 5 mm，厚度1.5 mm。消毒后用真空箱将气泡从材料中排出。PBS浸泡3次，每次30 min。每个支架均匀注入100 mg/L的重组人BMP-2溶液10 μL，小心操作防止重组人BMP-2溶液渗出，每个支架上均含1 μg重组人BMP-2。密封并置入4 ℃冰箱中过夜，使各支架充分吸附重组人BMP-2。其后将各支架用1 mL PBS浸泡，置于37 ℃烘箱内。分别在第1，3，7，14，21天定时，吸出尽可能多的浸泡液，放置于-80 ℃超低温冰箱，并补充等量新鲜PBS。采集完各时间点的样本后，行ELISA蛋白定量分析，以时间为横坐标、重组人BMP-2累计释放量为纵坐标描绘其释放曲线。

1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据以x(_)±s表示，组间差异采用方差分析(ANOVA)进行比较，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

讨论

严重创伤、恶性肿瘤、先天性疾病等原因导致的大量骨缺损修复，是骨科临床常见的问题，且尚未得到很好的解决。自体骨移植因其良好的成骨、骨诱导、骨传导特性，是目前骨缺损修复的金标准，但也有取材有限、供骨区并发症等缺点^[24-25]。同种异体骨移植容易引起免疫排斥反应，修复效果差，并有传染疾病的危险，而且取样、处理、存储的成本高^[26-27]。近30年来，骨组织工程研究迅速发展，开发出了大量骨移植替代材料，为解决传统植骨材料的缺点提供了新的思路^[28-29]，其3要素包括种子细胞、促进组织再生的生长因子及支架材料。

BMP-2属于转化生长因子β超家族，具有很强的骨诱导能力且已被用于临床^[30-31]。但因其在人体内半衰期短、大剂量应用易导致并发症等缺点，应用BMP-2时选择合适的材料作为其载体，已成为被广泛接受的方法。肝素是1916年首先在肝脏中发现的，故称之为肝素，其分子量在5 000-40 000之间，平均分子量14 000，含硫量为9%-12.9%。作为高度硫酸化的蛋白多糖，肝素的基本结构是由糖醛酸和葡萄糖胺组成的二糖单元，葡萄糖胺的C-1和糖醛酸的C-4之间由1-4糖苷键连接。一个典型的肝素二糖单元含有3个磺酸基团(SO₃^-)，该基团带有大量负电荷，对多种生长因子的带正电荷的氨基酸残基具有很强的亲和性^[32-35]。因此，近年来肝素修饰的载体系统已被用于BMP-2等多种生长因子的可控释放，并被证明在持续释放生长因子的同时保留了生长因子的生物活性^[16-20]。Jeon等^[36]用肝素修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为BMP-2的缓释载体，发现其持续释放BMP-2长达14 d，而未经肝素修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物携带的BMP-2在4 h内即完全释放，肝素修饰的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架携带BMP-2，能更好地刺激成骨细胞分化及促进异位成骨。Xu等^[37]用肝素修饰的透明质酸水凝胶颗粒，成功吸附了更多的BMP-2，与未经肝素修饰的颗粒相比，该载体能显著降低BMP-2的突释并保留其生物活性。此次实验利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺的催化作用，使明胶中的氨基(-NH2)和肝素中的羧基(-COOH)充分反应，形成稳定的酰胺键，制备出了肝素化明胶，并证明了明胶中交联的肝素量较高，可能具有较强吸附生长因子的能力。假设将合适比例的普通明胶与肝素化明胶混合，利用热致相分离结合致孔剂洗出技术，能制备出既有仿生特性又能缓释生长因子的纳米纤维肝素/明胶复合支架。

之前已有研究通过热致相分离结合致孔剂洗出技术制备出了仿生纳米纤维明胶支架，并证明了该支架在骨组织工程中的优良效果^[38-39]。热致相分离的原理是利用聚合物溶液在特定温度条件下的热力学不稳定，它主要有5个基本步骤：聚合物溶解、相分离和凝胶化、溶剂置换、低温冷冻、真空冻干。例如明胶、聚乳酸等聚合物溶液在低温条件下发生相分离，溶剂置换除去富溶剂相后，富聚合物相形成纳米纤维结构^[40]。其中相分离和溶剂置换是形成纳米纤维结构的关键。实验中发现，若低温处理时间不够(< 4 h)，即相分离不充分，则支架不可能形成纳米纤维结构；溶剂置换时间不足24 h，或置换过程中没有更换二氧六环，纳米纤维结构均不佳。而其他条件变化，如溶剂种类、聚合物种类、聚合物浓度等都会对支架的形貌产生影响。为了在支架中形成利于细胞浸润和组织长入的大孔，利用了石蜡微球致孔剂，可通过调整致孔剂的形状和大小控制支架内大孔的大小、形状和连通性^[7]。实验还发现，当支架中肝素化明胶含量≥60%时，支架的大孔结构不能维持，变成无序排列的纤维状，分析出现这种现象的原因是随着肝素化明胶含量的逐渐增加，纳米纤维肝素/明胶在水/乙醇混合溶液中溶解性越来越好，低温处理时更难发生相分离和凝胶化，导致大孔结构和纳米纤维结构均消失。

由于肝素化明胶含量过高时，支架不能形成仿生纳米纤维结构，故选择肝素化明胶含量为0、20%及40%的3组支架来观察肝素化对支架缓释BMP-2能力的影响，发现随着肝素含量的增加，支架对BMP-2的吸附能力增强，BMP-2的突释显著降低且释放BMP-2的时间延长。肝素化明胶含量为40%的支架对BMP-2的突释率仅约20%，且释放时间持续到21 d后，具有较强的缓释能力。

实验证实了将适当比例的普通明胶与肝素化明胶混合，可以制备出有仿生特性及一定机械强度且能缓释生长因子的纳米纤维肝素/明胶复合支架，为下一步在动物体内验证该类支架的骨缺损修复能力奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

缓释重组人骨形态发生蛋白2仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架的制备及表征

A novel biomimetic nanofibrous heparin/gelatin scaffold with sustained-release recombinant human bone morphogenetic protein-2: preparation and characterization

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[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[3]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[4]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[5]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[6]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[7]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[8]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[9]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[10]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[11]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[12]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1550-1554.
[13]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.
[14]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.
[15]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.