在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.021

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 2117-2122.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.021

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在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化

李平，皇甫春荣，汤春辉，陈一晖

云南省第一人民医院，云南省昆明市 650032

收稿日期:2016-02-12 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: 皇甫春荣，主治医师，云南省第一人民医院，云南省昆明市650032
作者简介:李平，男，1970年生，云南省昆明市人，汉族，1995年昆明医学院毕业，副主任医师，主要从事肾脏研究。
基金资助:
云南省自然科学基金面上项目(2009CD08)

Human umbilical cord mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine: bioactive properties and cardiomyocyte-like differentiation

Li Ping, Huangpu Chun-rong, Tang Chun-hui, Chen Yi-hui

First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2016-02-12 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: Huangpu Chun-rong, Attending physician, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Li Ping, Associate chief physician, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2009CD08

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

成体干细胞：成体干细胞是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能多能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。

人脐带间充质干细胞：是一类特殊的细胞，具备自我更新和自我增殖能力，能向心肌样细胞分化潜力，从而形成肌细胞，能够作为组织工程等领域重要的种子细胞之一。人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力，分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞，并且该细胞能够作为心肌样细胞移植的重要来源，具有较高的临床应用价值。

背景：人脐带间充质干细胞属于一类特殊的干细胞，该类细胞数量有限，且分离、纯化难度系数较大，并且临床上对于该类细胞生物学特性缺乏认识。

目的：研究人脐带间充质干细胞的生物活性特性，探讨人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用。

方法：无菌采集剖宫产新生儿脐带，在胶原酶Ⅱ下进行消化，采用组织块培养法分离人间充质干细胞。利用免疫细胞化学染色检测细胞表面标志，观察细胞形态学特性，并采用MTT法检测细胞增殖绘制其生长曲线，将获得的人脐带间充质干细胞进行培养，待细胞生长到70%-80%融合时，采用10 μmol/L 5-杂氮胞苷进行24 h诱导。

结果与结论：①组织块贴壁法培养1周后：可见人脐带间充质干细胞，去组织块加入培养液培养后，人脐带间充质干细胞集落生长；②第3代及第10代人脐带间充质干细胞接种24 h内：细胞为潜伏期，此后呈对数生长，倍增时间为30 h；③免疫细胞化学染色结果显示：第3代细胞90%以上表达基质细胞相关表面标志物CD44、CD29等，不表达造血及内皮细胞标志物CD28、CD31；④人脐带间充质干细胞诱导3周后：细胞突起消失，出现不规则形状，诱导4周后呈现圆形，且表达心肌特异性免疫标志物。⑤结果提示人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力：分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-杂氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0971-6000(李平)

关键词: 干细胞, 分化, 人脐带间充质干细胞, 心肌样细胞, 组织块培养法, MTT, 生长曲线, 心肌样细胞, 5-杂氮胞苷, 云南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells belong to a special class of stem cells with a limited number, which are difficult to isolate and purify. Importantly, there is a lack of clinical understanding of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To study the bioactive properties and cardiomyocyte-like differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells.

METHODS: Under a sterile collection, umbilical cord blood of newborn from cesarean section was collected to isolate human mesenchymal stem cells by digestion using collagenase II. Immunohistochemical staining was used to detect cell surface markers and observe morphological characteristics, and MTT assay used to detect cell proliferation and draw cell growth curve. Cells grown to 70%-80% confluence were treated with 10 μmol/L 5-azacytidine for 24 hours.

RESULTS AND CONCLUSION: One week after adherent tissue culture, human umbilical cord mesenchymal stem cells were seen, and then the cells cultured in culture medium showed colony growth. Within 24 hours of cell seeding, cells at passages 3 and 10 were at latency period and then grew logarithmically with a doubling time of 30 hours. Immunocytochemical staining showed that passage 3 cells at over 90% confluence expressed CD44 and CD29, rather than CD28 and CD31.Three weeks after induced culture, the cells with the absence of processes grew irregularly; after 4 weeks, the cells were round in shape and expressed cardiac-specific immune markers. Taken together, isolated human umbilical cord mesenchymal stem cells with strong proliferative ability have the basic biological characteristics of mesenchymal stem cells, which are capable of differentiating into cardiomyocyte-like cells induced by 5-azacytidine.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adult Stem Cells, Tissue Engineering

李平，皇甫春荣，汤春辉，陈一晖. 在5-杂氮胞苷诱导下人脐带间充质干细胞生物活性特性及向心肌样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2117-2122.

Li Ping, Huangpu Chun-rong, Tang Chun-hui, Chen Yi-hui. Human umbilical cord mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine: bioactive properties and cardiomyocyte-like differentiation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2117-2122.

图/表（结果） 5

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引言

间充质干细胞是一类具有显著的自我更新、多向分化能力的细胞，其来源丰富，主要存在于骨髓、脂肪、胎盘以及其他器官间质内，具有自我更新及增殖能力，并且能够在一定的条件下诱导为骨细胞、心肌样细胞等，是组织工程领域比较重要的种子细胞之一^[1]。脐带作为分娩弃物，其来源相对广泛，取材方便。研究显示脐带中富含间充质干细胞，容易获得，分离成功率较高，具有多项分化能力。而人脐带间充质干细胞容易分离、培养，体外增殖能力较强，能运用于干细胞移植治疗人类疾病，且不会存在组织配型、医学伦理及免疫排斥等问题，成为组织工程以及再生医学领域使用较多的种子细胞。同时，人脐带间充质干细胞能在机体内长期传代并保持其原有的干细胞表型和分化特性，但是临床上对于该特性尚存在较大的争议^[2]。

心血管疾病类型较多，包括高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化等，患者发病后如果得不到及时有效的治疗，将会诱发其他疾病，严重者将威胁患者生命。常规治疗方法以药物、介入或手术治疗为主，这些方法虽然能延长患者生存期，但医疗费用较高，患者治疗后并发症发生率较高，难以在临床上推广应用。随着组织工程学的不断发展，细胞移植在心血管疾病中得到应用，而心肌样细胞移植作为一种全新的治疗方法，能有效的改善患者治疗预后，促进患者早期恢复^[3-4]。为了使人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化，多数学者采用5-杂氮胞苷作为诱导剂进行心肌样细胞特异性标志物的表达，结果显示，干细胞能在特定环境下向心肌样细胞分化，能为心血管疾病的治疗提供依据和参考^[5-6]。因此作者拟对人脐带间充质干细胞的生物活性及分化的心肌样细胞的效果进行分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学研究。

1.2 时间及地点实验于2015年2至7月在云南省第一人民医院完成。

1.3 材料健康、足月且均行剖宫产分娩婴儿40人，其中男25例，女15例。产妇艾滋病、乙型肝炎抗体、支原体等均为阴性。产妇及家属对实验方法、实验目的知情同意，且自愿签署知情同意书，实验经过云南省第一人民医院伦理委员会批准同意。

人脐带间充质干细胞活性剂分化相关研究使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
多聚甲醛	广州斯佳生物科技公司
SABC试剂盒	Sigma公司
倒置显微镜	日本OLYMPUS公司
酶标仪	美国Gibco公司

1.4 方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养取长约1 cm的脐带组织(图1)，无菌条件下浸入L-DMEM培养基中，采用PBS充分洗涤，采用20 mL注射器分别插入2根脐静脉及1根脐动脉内，反复冲洗，去除血管中的残存积血，将获得的标本放置在温度为4 ℃下进行保存。向标本中加入含有青霉素以及链霉素的Hanks溶液，40 g/L多聚甲醛固定1周，梯度乙醇脱水过夜，二甲苯透明，行常规石蜡包埋，将标本中的残余血液清除，并将脐带剪碎(1.0-2.0 mm³)。将组织块接种在含人脐带间充质干细胞培养基(含1×10⁵ U/L青霉素，100 mg/L链霉素）的明胶包被的塑料培养皿中，置于37 ℃下体积分数5%的CO₂饱和湿度培养箱中，1周后，去除组织块更换培养基，以后每3 d换液一次，采用倒置显微镜观察细胞生长情况。待细胞融合80%时，采用0.25%胰蛋白酶消化分散细胞，根据1∶3比例进行传代培养，每3 d传代一次。细胞冻存与复苏。冻存前24 h换液，换存液为浓度为70% L-DMEM、体积分数20%胎牛血清和10% DMSO，冻存细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，冻存细胞复苏隔日换液一次，观察细胞状态和增殖情况^[7-8]。

1.4.2 细胞生长活性测定取脐带间充质干细胞调整细胞浓度为5×10³ L^-¹，将其接种在96孔板内，并且在细胞接种后的1，3，5，7 d采用MTT法进行检测，在 490 nm处采用分光光度计检测细胞的吸光度值，并描绘生长曲线。

1.4.3 诱导分化取人脐带间充质干细胞接种在12孔板内，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-¹，待细胞生长融合到70%-80%后，加入DMEM培养基、肝细胞生长因子 (20 μg/L)、成纤维细胞生长因子4(10 μg/L)、5-杂氮胞苷(10 μmol/L)、地塞米松(0.5 μmol/L)下进行10 d培养，加入DMEM培养基、抑瘤素M(50 mg/L)、地塞米松 (0.5 μmol/L)、5-杂氮胞苷(10 μmol/L)培养18 d，共培养28 d，观察细胞形态，每2 d进行1次换液^[9]。

1.4.4 表面分子标志物的测定取培养脐带间充质干细胞，采用CD105、Vimentin、CD34、CD31 mAb对脐带间充质干细胞进行免疫细胞化学染色，根据SABC试剂盒相关要求进行操作，在显微镜下观察染色情况，并对结果进行拍照^[10-11]。同时，取人脐带间充质干细胞经过胰酶消化后，充分吹打制备单细胞选择加入待检测指标^[12]。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞形态特征。②第3代及第10代人脐带间充质干细胞增殖能力。③人脐带间充质干细胞表面分子标志物。④脐带间充质干细胞向心肌细胞分化。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示。采用SPSS 18.0软件进行分析。

讨论

间充质干细胞属于是基础医学、组织工程等学科领域相对比较重要的种子细胞之一，探寻便捷、丰富的组织来源、建立长期、稳定的培养扩增条件，研究间充质干细胞的生物学特性，建立稳定的培养扩增条件能够更加满足临床研究需要。胎盘在剖宫产产妇中比较常见，胎盘及其附属物在产妇分娩后常作为废弃物处理，其资源比较丰富，更加易于运输而引起众多学者关注^[9^，^13]。脐带从结构组成来说包括1条静脉以及2条动脉，在动脉和静脉之间有一种特殊的组织，从该组织中能成分提取、分离间充质干细胞。研究显示人脐带间充质干细胞属于一类特殊的细胞，该细胞具有较强的多向分化潜力，在一定的条件下能下其他细胞进行分化^[14-15]。

利用组织块贴壁法以及酶消化发能够获得完整的人脐带间充质干细胞。组织块直接培养方法相对比较简单，对细胞具有较好的保持作用，并且传代所需要的时间也相对角度。而酶消化法获得细胞速度更快，但是操作比较复杂，价格也比较昂贵^[16-17]。实验中，利用组织块贴壁法培养1周获得的人脐带间充质干细胞在显微镜下能观察短杆状细胞从组织块中生长出。去组织块加入培养液培养后，人脐带间充质干细胞集落生长^[18-19]。目前，体外分离培养人脐带间充质干细胞的鉴定尚缺乏统一的标准，其判断方法更多的是根据其形态学、增殖特性、免疫表型以及多向诱导分化功能进行综合判定。同时，人脐带间充质干细胞属于一种非胚胎干细胞和非成体干细胞，通过不同代数的细胞增殖特性能够了解细胞多向分化综合性能^[20-21]。作者获得的第3代及第10代人脐带间充质干细胞生长曲线总体呈现上升趋势，接种24 h内视为潜伏期，此后呈现对数生长，倍增时间为30 h，由此看出：人脐带间充质干细胞优良的增殖能力^[22-23]。实验采用流式细胞术对人脐带间充质干细胞表面标志进行测定，结果显示免疫细胞化学染色结果显示，第3代细胞90%以上表达基质细胞相关表面标志物CD44和CD29等，不表达造血及内皮细胞标志物CD28和CD31。说明实验获得的细胞属于是一类非造血、非内皮的基质细胞，具有多向分化潜能^[24-25]。研究显示，人脐带间充质干细胞在浓度为10 μmol/L的5-氮胞苷诱导下能够成功分化获得心肌样细胞^[26-27]。实验中，人脐带间充质干细胞在一定条件下诱导分化为心肌样细胞，显微镜下心肌样细胞从第3周细胞突起消失，细胞出现不规则形状，诱导4周后呈现圆形，能表达心肌特异性的标志。说明人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞分化。从结果可以看出：采用组织块培养法能获得体外培养的人脐带间充质干细胞，并且经过对细胞周期和生长曲线的分析显示实体外培养的人脐带间充质干细胞具有旺盛的增殖能力，适合大规模培养，并且能在一定条件下向其他细胞增殖分化，随着医疗技术的飞速发展，有理由相信人脐带间充质干细胞将会在临床发挥巨大的作用。

综上所述，人脐带间充质干细胞具备较强的增殖能力，分离的细胞具备充质干细胞的基本生物学特性，能够在5-氮胞苷诱导下分化为心肌样细胞，并且该细胞能够作为心肌样细胞移植的重要来源，具有较高的临床应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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