人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.018

摘要/Abstract

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文题释义：

蜕膜组织：是子宫内膜间质受蜕膜化诱导因子刺激而增殖和再分化形成的一种特殊组织，它对于妊娠的建立和维持至关重要。

上皮细胞：是位于皮肤或腔道表层的细胞。上皮细胞根据器官的不同而有所不同：尿常规的上皮细胞，是衰亡、脱落的皮细胞，没有很特定的指向意义。

背景：蜕膜组织是重要的子宫内膜干细胞来源之一，从蜕膜组织中可分离出间充质干细胞。通过对其进行一定的诱导，可分化为不同的细胞类型。

目的：从人早孕蜕膜组织中分离得到子宫内膜间质干细胞，对其进行诱导分化，观察其向子宫内膜上皮细胞分化的情况。

方法：获得人早孕蜕膜组织，进行子宫内膜间质干细胞分离培养和鉴定。对子宫内膜间质干细胞进行定向分化诱，进行实验分组，分别为实验组(子宫内膜条件培养液)和对照组(含胎牛血清的正常培养基)，利用免疫荧光法检测角蛋白表达情况。并进行Western bolt检测，检测实验组与对照组细胞的角蛋白相对表达量。

结果与结论：①从人早孕蜕膜组织中成功分离培养获得子宫内膜间质干细胞，细胞体外生长曲线呈“S”形，接种后1-48 h，曲线平缓上升，细胞处于适应期。接种48 h之后，曲线陡峭上升，细胞增殖速度加快，进入对数期；接种60 h之后，细胞生长速度下降，曲线平稳上升；②经流式细胞仪检测，子宫内膜间质干细胞可以表达CD73、CD90，不表达CD34、CD45、细胞角蛋白；③经免疫荧光检测，角蛋白表达方面，对照组不表达，实验组大部分细胞均呈阳性表达；④经Western bolt检测，实验组细胞的角蛋白相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)；⑤实验结果表明，从人早孕蜕膜组织中可以分离获得子宫内膜间质干细胞，通过对细胞进行定向诱导，可以使其向子宫内膜上皮细胞发生分化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8634-1310(陈波)

关键词: 干细胞, 培养, 子宫内膜干细胞, 子宫, 子宫内膜, 干细胞, 间质干细胞, 蜕膜组织, 细胞分化, 上皮细胞

Abstract:

BACKGROUND: Decidua tissue is one of the most important sources of endometrial stem cells, from which stromal stem cells can differentiate into various kinds of cells under contain inductions.

OBJECTIVE: To observe the differentiation of endometrial stromal stem cells isolated from early-pregnancy decidua into endometrial epithelial cells.

METHODS: Endometrial stromal stem cells from early-pregnancy decidua were cultured, identified and directionally induced. Then induced cells were randomized into test group cultured in conditioned medium and control group cultured in normal culture medium containing fetal bovine serum. Expression of keratin was detected by immunofluorescence assay and western bolt assay in the two groups.

RESULTS AND CONCLUSION: The endometrial stromal stem cells from early-pregnancy decidua were successfully isolated and cultured, and presented with a S-shaped curve. Within 1-48 hours after inoculation, cultured cells were in the adaptation phase; then, the cells proliferated rapidly and began to grow logarithmically at 48 hours after culture; after 60 hours of culture, the cell growth rate decreased, with a steady rise in the cell curve. Results from the flow cytometry detection showed that the endometrial stromal stem cells could express CD73 and CD90, but not express CD34, CD45 and cytokeratin. Immunofluorescence findings showed the expression of keratin negative in the control group, and mostly positive in the test group. Besides, the relative expression of keratin in the test group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). These results suggest that the endometrial stromal stem cells can be isolated from the human decidua in early pregnancy, and differentiate into endometrial epithelial cells by directional induction.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Uterus, Stem Cells, Decidua, Tissue Engineering

陈波. 人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2098-2103.

Chen Bo. Endometrial stromal stem cells from early-pregnancy decidua differentiate into endometrial epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2098-2103.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] 何泓.Notch1对子宫内膜异位症内膜干细胞增殖分化的调控[D].华中科技大学,2012.

[2] Gargett CE, Chan RW, Schwab KE.Endometrial stem cells.Curt Opin Obstet Gyneeol.2007;9(4):377-383.

[3] DuH, Taylor HS.Stem cells and female reproduction. Repred Sci.2009;6(2):126-139.

[4] Gargelt BE,Chan RW.Endometrial stem/progenitor cells and proliferative disorders ofthe endometrium.Minerva Ginecol.2006;58(6):51l-526.

[5] 高绿芬,高雪松,麦浩山,等.人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞向子宫内膜上皮细胞定向分化的研究[J].暨南大学学报:自然科学与医学版,2014,35(5):463-467.

[6] Schwab KE,Hutchinson P,Gargett CE,et al. Identification of surface markers for prospective isolation of human endometrial stromal colony-forming cells.Human Reproduction.2008;23(4):934-943.

[7] Ebrahimi-Barough S, Massumi M, Kouchesfahani HM, et al.Derivation of pre-oligodendrocytes from human endometrial stromal cells by using overexpression of MicroRNA 338. J Mol Neurosci. 2013;51(2):337-343.

[8] 杨新园,李旭,陈葳,等.子宫内膜基质干细胞的体外成骨诱导和成脂诱导分化[J].西安交通大学学报:医学版,2012, 33(1):95-98.

[9] 马颖,何援利.两种方法分离子宫内膜干细胞的比较[J].中国组织工程研究,2013,16(6):1089-1093.

[10] 杨新园,王伟,陈葳,等.子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究[J].南方医科大学学报,2011,31(9): 1488-1492.

[11] Spitzer TL, Rojas A, Zelenko Z, et al. Perivascular human endometrial mesenchymal stem cells express pathways relevant to self-renewal, lineage specification, and functional phenotype. Biol Reprod. 2012 ;86(2):58.

[12] 康康,王蔼明,尹善德,等.评估无血清培养子宫内膜间充质干细胞的可行性[J].解放军医学院学报,2015,36(6):563- 567.

[13] 龙行涛,王冬,田桂兰,等.Importin13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义[J].中国癌症杂志,2012, 22(1):10-14.

[14] 张倩媚,马颖.子宫内膜干细胞体外诱导及定性分化的研究[J].山西医药杂志,2013,42(13):770-771.

[15] Kadalmani B,Taylor HS,Krikun G,et al.Atypical expression of COX-2, StAR, CYP19A1 and apoptotic regulators in CD90 positive endometrial stromal cells from women with endometriosis.J Endometriosis. 2013;5(2):77-85.

[16] 王姝,郎景和.子宫内膜异位症——一种干细胞疾病?[J].现代妇产科进展,2008,17(10):721-724.

[17] 牛婧雅,袁瑞.干细胞在子宫内膜损伤修复中的研究进展[J].现代妇产科进展,2014,(11):920-922.

[18] 杨新园,陈葳,李旭,等.子宫内膜基质干细胞培养方法的比较研究[J].山西医科大学学报,2011,42(8):624-628.

[19] Chan RW,Gargerit CE.Identification of label retaining cells in mouse endometrium.Stem Cells.2006; 24(6): 1529-1538.

[20] 丛青.小鼠骨髓间充质干细胞向子宫内膜腺上皮分化的蛋白质组学研究[D].复旦大学,2012.

[21] Yang XY, Wang W, Li X. et al.In vitro hepatic differentiation of human endometrial stromal stem cells.In Vitro Cell Dev Biol Anim Animal.2014;50(2): 162-170.

[22] Zemel'ko VI, Grinchuk TM, Domnina AP, et al.[Multipotent mesenchymal stem cells of desquamated endometrium: isolation, characterization and use as feeder layer for maintenance of human embryonic stem cell lines]. Tsitologiia. 2011;53(12): 919-929.

[23] 丁晓静.子宫内膜干细胞和子宫内膜癌肿瘤干细胞的研究进展[J].医学综述,2013,19(14):2546-2548.

[24] Tiede S, Bohm K, Meier N, et al.Endocrine controls of primary adult human stem cell biology: Thyroid hormones stimulate keratin 15 expression, apoptosis, and differentiation in human hair follicle epithelial stem cells in situ and in vitro. Eur J Cell Biol. 2010;89(10): 769-777.

[25] Wolff EF,Uchida N,Donahue RE. et al.Peripheral blood stem cell transplants do not result in endometrial stromal engraftment.Fertil Steril. 2013;99(2):526-532.

[26] Santamaria X,Massasa EE,Feng Y. et al.Derivation of insulin producing cells from human endometrial stromal stem cells and use in the treatment of murine diabetes. Mol Ther. 2011;19(11):2065-2071.

[27] Yang X,Zhang M,Zhang Y,et al.Mesenchymal stem cells derived from Wharton jelly of the human umbilical cord ameliorate damage to human endometrial stromal cells.Fertil Steril. 2011;96(4):1029-1036.

[28] Ebrahimi-Barough S,Kouchesfehani HM,Ai J,et al. Programming of human endometrial-derived stromal cells (EnSCs) into pre-oligodendrocyte cells by overexpression of miR-219. Neurosci Lett. 2013;537: 65-70.

[29] 袁华.子宫内膜干细胞在子宫内膜异位症发病中意义[J].国际妇产科学杂志,2010,37(5):347-350.

[30] 张晓磊,卢美松.骨髓间充质干细胞与子宫内膜再生[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2015,(5):433-436,440.

[31] Aghajanova L,Horcajadas JA,Esteban FJ,et al.The bone marrow-derived human mesenchymal stem cell: potential progenitor of the endometrial stromal fibroblast. Biol Reprod. 2010;82(6):1076-1087.

[32] 钱坤.卵裂期发育停滞胚来源的人胚胎干细胞系的建立及其体外自发分化过程中子宫内膜发育相关基因、子宫内膜样细胞的检测[D].华中科技大学,2005.

[33] Morelli SS, Rameshwar P, Goldsmith LT. et al.Experimental evidence for bone marrow as a source of nonhematopoietic endometrial stromal and epithelial compartment cells in a murine model. Biol Reprod. 2013; 89(1):7.

[34] Kato K, Takao T, Kuboyama A,et al.Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage. Am J Pathol. 2010;176(1):381-392.

[35] Schuring AN,Schulte N,Kelsch R,et al.Characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells obtained by endometrial biopsy during routine diagnostics. Fertil Steril. 2011 Jan;95(1):423-426.

[36] 张倩媚.子宫内膜细胞及干细胞分离培养和鉴别方法的研究进展[J].中国医师杂志,2013,15(4):569-571.

[37] Zhang WB,Cheng MJ,Huang YT,et al.A study in vitro on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into endometrial epithelial cells in mice. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2012;160(2):185-190.

[38] Piltonen TT, Chen J, Erikson DW, et al.Mesenchymal stem/progenitors and other endometrial cell types from women with polycystic ovary syndrome (PCOS) display inflammatory and oncogenic potential.J Clin Endocrinol Metab. 2013;98(9):3765-3775.

[39] 张雯碧,程明军,徐丛剑,等.小鼠骨髓间充质干细胞向子宫内膜上皮细胞方向分化的体外实验[J].现代妇产科进展, 2010,19(4):257-260.

[40] 曲军英,王燕华,吕一帆,等.子宫内膜细胞诱导胚胎干细胞修复小鼠受损子宫内膜[J].生殖与避孕,2013,33(10): 647-651.

引言

材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月在菏泽市立医院完成。

1.3 材料从菏泽市立医院妇产科手术室收集10例蜕膜组织，年龄20-30岁，一般情况良好，无阴道炎等妇科炎症，无传染病及内外科疾病，正常妊娠6-8周，未服用保胎药物，患者及其家属均知情同意。此次研究相关方案均提交菏泽市立医院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 子宫内膜间质干细胞分离培养^[7] PBS清洗标本，于无菌的培养皿中，利用眼科剪将标本剪为小碎块。在培养皿中添加Ⅰ型胶原酶，振荡消化50 min后，添加DMEM-F12培养基终止消化。离心后去掉上清液，添加适量DMEM-F12培养液制备细胞悬液，并进行过滤。收集滤过液，添加到培养瓶中，置于CO₂培养箱中进行培养，每3 d换液1次。观察细胞生长情况，待细胞融合达到80%之后进行传代培养。

人子宫内膜间质干细胞培养分化实验用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
PBS	上海万疆生物技术有限公司
Ⅰ型胶原酶	上海研晶生物科技有限公司
DMEM-F12培养液	上海飞轩生物科技有限公司
胎牛血清	湖南威恒生物技术有限公司
青霉素	博研(上海)生物技术有限公司
链霉素	山东东兴汇智生物科技有限公司
两性霉素	北京达科为生物技术有限公司
CCK-8溶液	上海鑫乐生物科技有限公司
胰蛋白酶	上海常斤生物技术有限公司
重组人转化生长因子β1 (TGF-β)	北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
表皮生长因子(EGF)	南京斯拜科生化实业有限公司
重组人血小板源性生长因子BB(Human PDGF-BB)	北京海之润生物技术有限公司
鼠抗人CD45-PC5，CD90-PC5，CD73-PE，CD34-FITC，CKPE抗体	上海天呈医流科技股份有限公司
角蛋白抗体	上海丰寿生物科技有限公司
β-actin抗体	上海江莱生物科技有限公司
TBST	武汉艾美捷科技有限公司
流式细胞仪	上海高创化学科技有限公司
倒置显微镜	北京碧橙蓝生物科技有限责任公司
二氧化碳培养箱	北京百普赛斯生物科技有限公司

1.4.2 子宫内膜间质干细胞体外生长曲线^[8] 选取生长状态良好的间质干细胞，添加 DMEM高糖培养基(含胎牛血清、青/链霉素、两性霉素)制备单细胞悬液，并接种在96孔板上，置于培养箱中进行培养，连续培养6 d，每天设置5个复孔，添加 CCK-8溶液，检测450 nm波长吸光度值，记录结果，并根据结果描绘细胞体外生长曲线。

1.4.3 子宫内膜间质干细胞鉴定^[9-11] 收集生长状态良好的细胞，利用PBS进行洗涤，胰蛋白酶消化后离心，制备单细胞悬液，添加鼠抗人CD45-PC5，CD90-PC5，CD73-PE，CD34-FITC，CKPE抗体，置于室温条件下进行孵育。孵育20 min后利用PBS进行洗涤，常规离心制备细胞悬液，并上流式细胞仪进行检测。

1.4.4 子宫内膜间质干细胞分化诱导^[12] 收集P2细胞，制备细胞悬液，接种在24孔板上。进行实验分组，分为实验组(子宫内膜条件培养液)和对照组(含胎牛血清的正常培养基)。利用不同的培养基进行细胞培养，定向诱导后，按照上述方法进行标志物细胞角蛋白检测，并进行免疫化学染色，观察染色结果。

1.4.5 Western bolt检测取P2子宫内膜间质干细胞，按照上述分组方法，培养7 d添加细胞裂解液，进行总蛋白提取。两组均取等量蛋白样品进行凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2 h之后添加角蛋白抗体和β-actin抗体，孵育过夜后进行TBST清洗，添加二抗，室温孵育，TBST清洗，ECL荧光底物显色，曝光显影。

1.5 主要观察指标观察子宫内膜间质干细胞培养结果和鉴定结果，利用免疫荧光法检测角蛋白表达情况。并进行Western bolt检测，检测实验组与对照组细胞的角蛋白相对表达量。

1.6 统计学分析对研究过程中获得的数据进行收集，使用的统计学软件为SPSS公司的SPSS 18.0。两组细胞的角蛋白相对表达量Western bolt检测结果予以t检验，并对P值进行计算，两组结果有统计学差异的标准为P < 0.05。

讨论

子宫内膜是一种特殊的组织，具有强大的再生能力。受到疾病或者手术操作以及月经周期等因素的影响，会出现不同程度的子宫内膜受损、脱落等现象^[13]。在受损之后，子宫内膜可以迅速完全再生。但是，如果一些宫腔操作不当导致对子宫内膜基底层等造成损伤，便会导致较为严重的子宫内膜损伤^[14]。随着感染发病率的增加，人流以及其他宫腔操作的增加，导致不同程度子宫内膜损伤患者的出现。

临床对不同原因子宫内膜损伤进行治疗的时候，可以积极的采用子宫内膜干细胞修复方式^[15]。干细胞作为具有自我更新和分化潜能的细胞，能够分化成其他细胞，相比成体干细胞，胚胎干细胞更具全能性，经正确诱导，能分化为人体细胞的任意一种^[16-18]。子宫内膜干细胞来源广泛，其中，蜕膜组织取材方便，应用十分广泛。以往有学者通过研究发现，人类子宫内膜干细胞可以分为两种类型^[19]，分别为子宫内膜间质干细胞和子宫内膜上皮干细胞，其中，间质干细胞具备良好的多向分化能力。

在此次实验中，从人早孕蜕膜组织中分离得到子宫内膜间质干细胞，对其进行诱导分化，观察其向子宫内膜上皮细胞分化的情况，从而为临床不同类型子宫内膜损伤的修复治疗提供参考依据。实验过程中，描绘子宫内膜间质干细胞体外生长曲线，细胞呈“S”形曲线生长。接种后1-48 h，曲线平缓上升，细胞处于适应期。接种48 h之后，细胞增殖速度加快，进入对数期；接种60 h之后，曲线平稳上升。即提示，所获得细胞在体外环境下正常生长，实验从人早孕蜕膜组织中成功分离培养获得子宫内膜间质干细胞。在对细胞进行表面标志物鉴定的时候，目前尚缺乏明确的标志物^[20-23]。此次实验选择以CD73、CD90为标志物进行检测。经流式细胞仪检测得到，子宫内膜间质干细胞可以表达CD73、CD90，不表达CD34、CD45、细胞角蛋白，表明细胞为间充质来源，属于实验所需的间充质干细胞。在干细胞的分化过程中，其分化方向会受到所处局部微环境的重要影响^[24]。

转化生长因子β属于生长因子超家族，可以对多种生物学过程产生十分重要的影响，包括细胞生长和细胞死亡以及干细胞的多系分化等^[25-27]。重组人血小板源性生长因子BB(human PDGF-BB)与转化生长因子β一样，也是一种重要的生长因子。重组人血小板源性生长因子BB可以对干细胞的分化产生有效的调节，通过复合物信号传递对细胞生理学的多个方面产生影响^[28-30]。表皮生长因子也是一种重要的生长因子，其信号通路可以对蛋白调节细胞周期产生影响，进而对细胞的增殖和分化产生影响。实验即选择对获得的子宫内膜间质干细胞进行定向诱导^[31]。所使用的诱导液中含有重组人转化生长因子β1、表皮生长因子以及重组人血小板源性生长因子BB，实验结果显示，成功诱导细胞分化。

在对定向诱导结果观察实验选择以角蛋白为观察对象。角蛋白是一种特殊的蛋白类型，是上皮细胞的结构蛋白质，也是上皮细胞的特征性标记物，可以特异性地表达于上皮细胞中^[32]。因此，通过对这一蛋白类型的检测，可以实现对上皮细胞以及间质细胞的有效区分^[33-35]。如果对细胞进行一定的定向诱导，可正常表达角蛋白，则可以较为直观的表明，细胞经诱导向上皮细胞分化^[36-40]。实验结果显示，经免疫荧光检测，角蛋白表达方面，对照组不表达，实验组大部分细胞均呈阳性表达。经Western bolt检测，实验组细胞的角蛋白相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)。上述结果表明，通过对人早孕蜕膜组织子宫内膜间质干细胞进行定向诱导，可以使其向子宫内膜上皮细胞发生分化。

综上所述，实验初步证实从人早孕蜕膜组织中可以分离获得子宫内膜间质干细胞，并经过一定的定向诱导，可以使其向子宫内膜上皮细胞发生分化。相关结果与结论，也为内膜干细胞用于修复损伤内膜寻找理想治疗方法提供了一定的参考。但是，关于临床应用效果等问题，尚需大量研究进行分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程