自体外周血干细胞局部注射联合腔内介入治疗糖尿病下肢血管病变

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

外周血干细胞：正常情况下，存在于外周血的干/祖细胞的含量占单个核细胞的0.01%-0.1%，相当于骨髓的1%-10%，动员后外周血单个核细胞中CD34⁺细胞数及粒细胞巨噬细胞集落生成单位均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其他部位的造血干/祖细胞进入外周血。

踝肱指数：是血管外科最常用、最简单的一种检查方法，通过测量踝部胫后动脉或胫前动脉以及肱动脉的收缩压，可得到踝部动脉压与肱动脉压之间的比值。正常人休息时踝肱指数的范围为0.9-1.3。

背景：研究表明外周血干细胞具有高度分化潜能，可分化成血管内皮细胞，促进血管再生，改善侧支循环，从而达到治疗肢体缺血的目的。

目的：观察糖尿病下肢血管病变患者腔内治疗结合自体外周血干细胞移植的临床效果。

方法：收集2011年3月至2014年12月住院治疗的糖尿病下肢血管病变患者50例，其中25例采取腔内治疗和自体外周血干细胞移植(联合组)，另外25例只采取腔内治疗(对照组)。所有患者于治疗后1，6，12个月随访，记录患肢疼痛、冷感等主观评分，测定踝肱指数、经皮氧分压、跛行距离等客观指标。

结果与结论：①两组患者治疗后踝肱指数均明显增加，尤其是治疗后1个月时增加显著，治疗后6，12个月有所下降，但与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。治疗后1，6，12个月时两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；②两组患者治疗后经皮氧分压、跛行距离也明显增加，治疗后1，6，12个月与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，治疗后1，6，12个月时联合组经皮氧分压、跛行距离高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③治疗后12个月内患肢痛感和冷感均有不同程度改善，联合组改善更明显；④外周血干细胞采集过程中出现低钙血症3例，移植后出现发热2例，局部渗血3例，对症治疗后好转；⑤结果表明，糖尿病下肢血管病变患者行腔内治疗结合自体外周血干细胞移植加速患肢侧支循环的建立，从而减轻患肢缺血症状，因此能取得比单独采取腔内治疗更好的临床效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3537-6537(顾露)

关键词: 干细胞, 移植, 自体外周血干细胞, 腔内治疗, 糖尿病下肢血管病变, 踝肱指数, 经皮氧分压, 跛行距离

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that peripheral blood stem cells can highly differentiate into vascular endothelial cells to promote blood vessel regeneration, and improve collateral circulation, thereby achieving satisfactory outcomes in the treatment of limb ischemia.

OBJECTIVE: To observe the clinical effect in diabetic lower extremity vascular disease patients undergoing percutaneous transluminal angioplasty combined with autologous peripheral blood stem cell transplantation.

METHODS: Fifty patients hospitalized for diabetic lower extremity vascular disease from March in 2011 to December in 2014 were collected: 25 cases underwent percutaneous transluminal angioplasty as control group; another 25 underwent percutaneous transluminal angioplasty combined with autologous peripheral blood stem cell transplantation as combination group. At 1, 6, 12 months after surgery, subjective scores of affected limb pain and cold sensation were recorded, additionally, objective indicators, including ankle-brachial index, transcutaneous oxygen partial pressure, and claudication distance were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: Ankle-brachial index scores of the two groups were significantly increased, especially at 1 month after surgery, but decreased at 6, 12 months, and there was a significant difference compared with that before treatment (P < 0.05); at 1, 6, and 12 months, there was no significant difference between the two groups (P > 0.05). At 1, 6, and 12 months after surgery, both of transcutaneous oxygen partial pressure and claudication distance in the two groups were significantly increased compared with those before treatment (P < 0.05). Furthermore, compared with the control group, these two indicators in the combination group were significantly increased (P < 0.05). Within 12-month follow-up, affected limb pain and cold sensation were improved in the two groups, especially in the combination group. Inevitably, three cases had hypocalcemia during the collection of peripheral blood stem cells, and two cases developed fever and 3 cases appeared to have local exudation after surgery. All these symptoms were released by symptomatic treatments, respectively. In conclusion, percutaneous transluminal angioplasty combined with autologous peripheral blood stem cell transplantation for diabetic lower extremity vascular lesions can promote the establishment of affected limb collateral circulation, to decrease the risk of limb ischemia, which achieves significant outcomes than percutaneous transluminal angioplasty used alone.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Peripheral Blood Stem Cell Transplantation, Angioplasty, Diabetic Angiopathies, Tissue Engineering

顾露，张姝梅，于翔，杨毅. 自体外周血干细胞局部注射联合腔内介入治疗糖尿病下肢血管病变[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2086-2091.

Gu Lu, Zhang Shu-mei, Yu Xiang, Yang Yi. Autologous peripheral blood stem cell transplantation combined with percutaneous transluminal angioplasty for diabetic lower extremity vascular disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2086-2091.

图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析纳入50例2型糖尿病下肢血管病变患者均进入结果分析，中途无脱落。

2.2 两组患者基线资料比较两组患者间各参数差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 两组患者踝肱指数比较两组患者治疗后踝肱指数均明显增加，尤其是治疗后1个月时增加显著，治疗后6，12个月有所下降，但与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，治疗后6个月与12个月比较差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后1，6，12个月时两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 两组患者经皮氧分压(TcPO₂)比较两组患者治疗后经皮氧分压也明显增加，治疗后1，6，12个月与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，联合组治疗后各时间点两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，对照组治疗后各时间点两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后1，6，12个月时联合组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.5 两组患者跛行距离比较两组患者治疗后跛行距离也明显增加，治疗后1，6，12个月与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，联合组治疗后各时间点两两比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)，对照组治疗后各时间点两两比较差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗后1，6，12个月时联合组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4。

2.6 两组主观感觉比较治疗后早期大部分患者出现皮温升高、疼痛缓解表现。治疗后12个月内患肢痛感和冷感均有不同程度改善，联合组显效、有效、无效患者分别为19例(76%)，5例(20%)，1例(4%)，对照组显效、有效、无效患者分别为15例(60%)，8例(32%)，2例(8%)，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 溃疡和坏疽愈合情况所有合并溃疡患者经换药后逐渐愈合，合并坏疽8例患者中有5例明显改善，其中治疗组4例，对照组1例。8例坏疽患者行截趾或膝下截肢处理，术后一期愈合。

2.8 并发症及不良反应随访期间无死亡病例，外周血干细胞采集过程中出现低钙血症3例，考虑枸橼酸盐中毒反应，及时处理后缓解。外周血干细胞移植过程中无明显不良反应，移植后出现发热2例，局部渗血3例，对症治疗后好转。

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引言

材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点 2011年3月至2014年12月在四川省人民医院完成。

1.3 对象收集内分泌科住院的2型糖尿病下肢血管病变患者50例，其中男36例，女14例；按Fontaine分期，Ⅱ期2例，Ⅲ期40例，Ⅳ期8例；糖尿病病程(11.24±9.44)年，患者平均年龄(64.06±7.13)岁，糖化血红蛋白(9.23±2.24)%，空腹血糖(8.22±3.34) mmol/L，餐后血糖(12.40±4.22) mmol/L。入组的50例患者按治疗方法分为2组，联合组采取腔内治疗和自体外周血干细胞移植，对照组只采取腔内治疗，两组患者间各参数差异无显著性意义(P > 0.05)。

纳入标准：①所选病例均符合1999年WHO发布关于2型糖尿病诊断标准。②经CTA/MRA/DSA/CDU等检查，明确诊断为下肢动脉硬化或闭塞。③所有患者均有不同程度的患肢静息痛、末端肢体发凉麻木以及严重间歇性跛行等临床表现，以及下肢动脉搏动减弱或消失，皮温低，缺血性溃疡，肢端坏疽等体征。④随访资料完整。⑤所有患者均签署知情同意书并经医学伦理委员会论证通过。

排除标准：①DSA对比剂过敏。②严重的凝血机制功能障碍。③病变处既往行介入或手术史。④严重心、肺、肾功能疾病不能耐受腔内手术和干细胞移植者。⑤失访。

1.4 方法

1.4.1 下肢腔内治疗技术两组患者入院后均行下肢腔内治疗，在局麻或全身麻醉下，运用Seldinger’s穿刺技术逆行穿刺患者健侧股动脉，置入4-6 F动脉鞘，行患肢远端血管造影，观察靶血管病变情况，然后给予全身肝素化，导管在导丝引导下进入病变血管并小心轻柔通过病变，应用不同球囊逐行扩张病变血管。对于腘动脉及以下动脉狭窄患者一般仅用球囊扩张(一般为直径4-6 mm)，对于股浅动脉及以上动脉狭窄患者使用球囊扩张后回缩明显则植入球囊扩张型支架或自膨式支架。术后患者卧床制动12 h，同时静脉滴注肝素盐水5-7 d，严密监测患者凝血功能。出院后长期口服阿司匹林100 mg/d，硫酸氯吡格雷75 mg/d×6个月，以预防术后血栓形成。

1.4.2 自体外周血干细胞动员和采集联合组术后7 d左右根据患者自身情况每天分2次皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子 5-10 μg/(kg•d)进行外周血单个核细胞的动员，连续4-7 d，计数外周血单个核细胞和CD34⁺细胞数达到高峰时，开始采集外周血干细胞。用采血针穿刺肘正中静脉采血，经血细胞分离机过滤得到外周血干细胞混悬液约60 mL[细胞总数(6-10)×10⁹个]供移植用。

1.4.3 自体外周血干细胞移植外周血干细胞采集后 3 h内行移植手术，行腰麻或硬膜下麻醉后，消毒患肢皮肤，按3.0 cm×3.0 cm间距将外周血干细胞悬液多点注射到患侧下肢栓塞血管周围，每点1.0-2.0 mL，移植后对患肢进行加压包扎，并给予抗感染及对症支持治疗。

1.4.4 Buerger运动法所有患者于围手术期在床上行Buerger运动，每日4次。具体操作如下：①患者取仰卧位，抬高患肢45°以上，并持续1.0-2.0 min。②取坐位，双下肢自然下垂，足跟触地。弯曲足背并左右摆动，先上翘足趾后尽量展开，再缓慢收拢足趾。尽量使每组动作维持2.0-3.0 min。③再次取仰卧位，双下肢平放，休息2.0-3.0 min。④尽量抬高足趾、足跟10次，完成整套运动约10 min，3次/d。运动过程中由于体力限制不能坚持完成者可由护士或家属协助。术后根据患者自身情况继续行Buerger运动，至术后30 d结束。

1.5 主要观察指标所有患者于治疗后1，6，12个月随访。①踝肱指数测定：采用ES-1000 SPM多普勒血流探测仪测定踝肱指数(按心血管病和腔内放射治疗协会2002年的标准)。患者取仰卧位，测双侧前臂血压，并取高值作肱动脉压(两次血压差值小于10 mm Hg，1 mm Hg = 0.133 kPa)；双侧胫后动脉和足背动脉的收缩压为踝动脉压，分别除以肱动脉压，其值为踝肱指数。②经皮氧分压(TcPO₂)检测：用丹麦经皮氧分压监测仪TCMTM400检测。③跛行距离：从走路开始到出现疼痛时的行走距离。④主观感觉：根据患肢疼痛、冷感等指标进行评分，分别为0，1，2，3，4分，评分越低说明临床症状明显改善。治疗前后分数减少2分以上为显效，分数减少1-2分为有效，分数无变化或增加为无效。⑤溃疡愈合情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，采用两独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

糖尿病是目前影响人类健康的最常见的疾病之一，由于糖尿病下肢病变导致的严重下肢缺血通常认为与下肢截肢关系密切，一项回顾性研究显示2003至2006年20 464名未进行血管腔内治疗或外科血管再通手术的严重下肢缺血的患者，1年内截肢率高达54%^[9]，严重影响患者生活质量。糖尿病下肢动脉血管病变形成可能为持久的高血糖状态使血管壁的结构蛋白发生变化，同时使体内氧自由基水平升高，脂质的过氧化和对血管内皮的直接损伤导致和加速了粥样斑块的形成，造成血管腔的阻塞，导致下肢发凉、疼痛，甚至组织的坏死、溃烂^[10]。血管腔内治疗已是糖尿病下肢动脉病变血管再通的主要方法，同时由于膝下动脉专用的腔内器材的开发和应用，腔内治疗的远期通畅性及临床疗效不断提升，入组所有患者腔内治疗主要采用膝下专业球囊行血管成形术。

自体外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢缺血性疾病的技术近年来发展迅速，大量的基础和临床试验显示该方法可有效改善患者下肢血液循环，促进血管再生^[11-14]。研究表明，干细胞参与血管再生的机制可能是通过其迁移、归巢到受损部位，可以直接分化为血管细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞，使病变区域新生毛细血管，以及通过分泌血管生成因子等促进血管新生^[15-17]。高雪等^[18]研究显示干细胞源性新生血管量及其供给组织的持久有效的血流灌注量是主导和完善缺血态组织二次血流重建效应的主要生物学机制。干细胞移植的途径有局部缺血区肌肉注射和动脉腔内注入等，其中临床较常见的移植方法是局部缺血区肌肉注射，陈明卫等^[19]比较自体外周血干细胞局部肌肉注射、动脉腔内注射和自体骨髓干细胞局部肌肉注射、动脉腔内注射治疗糖尿病缺血性下肢血管病变的临床疗效。结果显示移植后第2，4，12，24，48周临床症状主观指标和仪器检查客观指标数据各组差异无显著性意义，说明不同来源和移植途径的自体干细胞治疗糖尿病缺血性下肢血管病变疗效相当。张会峰等^[20]研究也表明自体骨髓干细胞和外周血干细胞移植治疗糖尿病下肢动脉闭塞症都是一种简便、安全、有效的治疗方法，疗效基本相当。

该研究对糖尿病下肢血管病变患者在行腔内治疗基础上联合应用自体外周血干细胞移植治疗，旨在探讨外周血干细胞移植作为腔内治疗后的辅助治疗是否存在合理性。研究结果显示两组患者治疗后踝肱指数均明显增加，尤其是治疗后1个月时增加显著，治疗后6，12个月有所下降，但与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。治疗后1，6，12个月时两组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，可见干细胞因素对患者踝肱指数改善不明显，其原因可能是踝肱指数主要反映下肢主干动脉的血液灌注情况，对侧支循环改善程度不敏感。两组患者治疗后经皮氧分压(TcPO₂)也明显增加，治疗后1，6，12个月与治疗前比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。治疗后1，6，12个月时联合组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，可见外科腔内治疗手术联合外周血干细胞移植治疗对经皮氧分压的改善疗效优于单纯腔内治疗，腔内治疗手术初期可明显改善下肢主干动脉的缺血症状，随着时间延长，主干动脉会发生不同程度再狭窄，而外周血干细胞移植后通过建立新生侧支循环来改善缺血部位血供，表现在临床上就是跛行距离延长、患肢痛感和冷感改善，可见移植的干细胞起到促进血管新生作用。

研究表明，应用粒细胞集落刺激因子动员外周血干细胞是一种常见的方法，可以促进粒系祖细胞增殖分化，使其大量释放到外周血中，但是存在一定的风险^[21-24]，主要的不良反应有骨痛、周身肌肉酸痛、乏力、头痛、失眠、食欲下降、恶心呕吐、低热，尤其是下肢缺血性疾病患者中绝大多数为中老年人，潜伏在心脑血管系统中的危险因素最为引人关注。在动员期间应密切观察病情变化，监测血象及凝血3项，控制动员剂的剂量，动员的同时应用低分子肝素钙。入组患者在干细胞动员期间未发生心脑血管并发症，外周血干细胞采集过程中出现低钙血症3例，考虑枸橼酸盐中毒反应，及时处理后缓解，如何更好加以预防还有待于今后工作中进一步研究。

综上所述，作者认为可能是通过腔内治疗确定的改善了下肢的动脉供血，同时结合外周血干细胞移植加速了患肢侧支循环的建立，改善了病变血管远端的组织供血，从而减轻患肢缺血症状，因此结合外周血干细胞移植，能取得比单独采取腔内治疗更好的临床效果。

由于目前尚缺乏大样本及远期疗效研究，腔内治疗结合外周血干细胞移植对糖尿病下肢血管病变患者短期治疗效果令人满意，但其长期效应还有待确认，相信随着对糖尿病下肢血管病变的不断深入研究，新技术及多种方法结合治疗糖尿病下肢血管病变将具有更广阔的前景。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程