CD133+细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.013

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 2066-2072.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.013

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

CD133⁺细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用

后梅¹，张红星²，叶青³，张勇⁴

昆明医科大学第一附属医院，1干疗科，2肿瘤内科，3心内科，4肿瘤放疗科，云南省昆明市 650032

收稿日期:2016-02-16 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: 张红星，副主任医师，昆明医科大学第一附属医院干疗科，云南省昆明市 650032
作者简介:后梅，女，1969年生，主治医师，主要从事老年心血管病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560462)

CD133⁺ cells in combination with human umbilical cord stem cells in mouse heart failure

Hou Mei¹, Zhang Hong-xing², Ye Qing³, Zhang Yong⁴

1Department of Cadre Treatment, 2Department of Medical Oncology, 3Department of Cardiology, 4Department of Tumor Radiotherapy, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Received:2016-02-16 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: Zhang Hong-xing, Associate chief physician, Department of Medical Oncology, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Hou Mei, Attending physician, Department of Cadre Treatment, First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560462

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

CD133⁺：可被3种CD133抗体识别：克隆AC133、293C3和AC141。AC133直接与CD133/1糖基化抗原表位结合，可用于从外周血、骨髓、脐血及其它组织中分析和分选CD133⁺细胞。

脐血间充质干细胞：是以人脐血血清为主体的培养体系的脐血间充质干细胞培养扩增的方法，该细胞分离培养过程中贴壁细胞能表达CD44和CD29，而CD106表达相对较大，并不会表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR，细胞倍增时间为30 h，细胞周期分析表明，G₀-G₁期和G₂-M期所占比例分别为78.84%和11.16%。

背景：目前常规方法治疗心力衰竭效果不佳。

目的：研究CD133⁺细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的效果，为心力衰竭治疗提供依据。

方法：采集足月妊娠顺产婴儿脐血，并利用淋巴细胞分离液法提取CD133⁺细胞和人脐血干细胞。将20只Balb/C裸小鼠随机等分为单个核细胞组和CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组。2组小鼠均建立心力衰竭模型。单个核细胞组经尾注射单个核细胞治疗，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组经尾注射CD133⁺细胞联合人脐血干细胞治疗。

结果与结论：①治疗后14 d时：CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组小鼠体质量及肝脏、心脏和肺脏质量显著大于单个核细胞组(P < 0.05)；②治疗30 d后：CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组小鼠心肌排列整齐，而单个核细胞组小鼠的心肌排列紊乱，CD133₊细胞联合人脐血干细胞组小鼠心肌胶原纤维平均面积显著小于单个核细胞组(P < 0.05)，血清基质金属蛋白酶9浓度显著低于单个核细胞组(P < 0.05)，Masson染色结果显示，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组小鼠蓝色胶原纤维较少，排列相对整齐；单个核细胞组小鼠心内膜出现不同程度胶原纤维增多，排列紊乱；③结果提示：CD133⁺细胞联合人脐血干细胞治疗小鼠心力衰竭效果理想，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3150-5226(后梅)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐血干细胞, CD133+细胞, 心力衰竭, 协同作用, 治疗效果, 单个核细胞, 血清基质金属蛋白酶9, Masson染色, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Currently, conventional treatment methods for heart failure are all ineffective.
OBJECTIVE: To explore the combined effects of human umbilical cord stem cells and CD133+ cells in mice with heart failure, providing a new insight into the treatment of heart failure.
METHODS: Full-term newborn umbilical cord from vaginal delivery was collected to isolate CD133+ cells and human umbilical cord stem cells using lymphocyte separation medium method. Twenty Balb/C nude mice were randomly subjected to mononuclear cell injection (mononuclear cell group) or injection of CD133+ cells combined with human umbilical cord stem cells (combined group) via the tail vein after establishing heart failure models.
RESULTS AND CONCLUSION: Fourteen days after injection, the body weight and liver, heart and lung mass of mice were significantly larger in the combined group than the mononuclear cell group (P < 0.05). After 30 days, myocardial cells arranged regularly in the combined group, but disorderly in the mononuclear cell group; compared with the mononuclear cell group, the average area of myocardial collagen fibers was significantly decreased in the combined group (P < 0.05), and the level of serum matrix metalloproteinase-9 was also significantly lower in the combined group (P < 0.05). Masson staining showed that blue-stained collagen fibers in the combined group were less but arranged neatly; however, in the mononuclear cell group, the number of collagen fibers that arranged irregularly was increased to different extents. To conclude, the combined use of CD133+ cells and human umbilical cord stem cells has desired outcomes in the treatment of heart failure in mice, indicating a higher clinical value.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Heart Failure, Drug Therapy, Myocytes, Cardiac, Tissue Engineering

后梅，张红星，叶青，张勇. CD133⁺细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2066-2072.

Hou Mei, Zhang Hong-xing, Ye Qing, Zhang Yong. CD133⁺ cells in combination with human umbilical cord stem cells in mouse heart failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2066-2072.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] Go AS, Mozaffarian D, Roger VL, et al. Heart disease and stroke statistics--2013 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 2013;127(1): e6-e245.

[2] Heidenreich PA, Trogdon JG, Khavjou OA, et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 2011;123(8):933-944.

[3] Domanski MJ, Krause-Steinrauf H, Massie BM, et al. A comparative analysis of the results from 4 trials of beta-blocker therapy for heart failure: BEST, CIBIS-II, MERIT-HF, and COPERNICUS. J Card Fail. 2003;9(5): 354-363.

[4] Janssens S, Dubois C, Bogaert J, et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction: double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2006; 367(9505): 113-121.

[5] 中华医学会心血管病学分会.中华心血管病杂志编辑委员会.中国心力衰竭诊断和治疗指南2014[J].中华心血管病杂志,2014,42(2):98-122.

[6] Wollert KC, Drexler H. Cell therapy for the treatment of coronary heart disease: a critical appraisal. Nat Rev Cardiol. 2010;7(4):204-215.

[7] Traverse JH, Henry TD, Pepine CJ, et al. Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. JAMA. 2012;308(22):2380-2389.

[8] Perin EC, Willerson JT, Pepine CJ, et al. Effect of transendocardial delivery of autologous bone marrow mononuclear cells on functional capacity, left ventricular function, and perfusion in chronic heart failure: the FOCUS-CCTRN trial. JAMA. 2012;307(16):1717-1726.

[9] 顾云,辛毅,吴永涛,等.参附注射液抑制大鼠缺血再灌注损伤期间心肌细胞凋亡的作用机制[J].新乡医学院学报, 2012, 29(2):85-88.

[10] 李丹,李蓓,石亚楠,等.心力衰竭与活性氧关系研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2013,27(1):8-10.

[11] Traverse JH, Henry TD, Ellis SG, et al. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. JAMA. 2011;306(19): 2110-2119.

[12] Huang XP, Sun Z, Miyagi Y, et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 2010;122(23):2419-2429.

[13] Hare JM, Fishman JE, Gerstenblith G, et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow–derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 2012;308(22):2369-2379.

[14] 邱小华,戴育成,胡葵葵.脐带间充质干细胞的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2012,6(6):88-91.

[15] Ye L, Zhang S, Greder L, et al. Effective cardiac myocyte differentiation of human induced pluripotent stem cells requires VEGF. PLoS One. 2013;8(1): e53764.

[16] Chachques JC. Cellular cardiac regenerative therapy in which patients? Expert Rev Cardiovasc Ther. 2009; 7(8):911-919.

[17] Cortes-Morichetti M, Frati G, Schussler O, et al. Association between a cell-seeded collagen matrix and cellular cardiomyoplasty for myocardial support and regeneration. Tissue Eng. 2007;13(11):2681-2687.

[18] Perin EC, Willerson JT. CD34+ autologous human stem cells in treating refractory angina. Circ Res. 2011; 109(4):351-352.

[19] Losordo DW, Henry TD, Davidson C, et al. Intramyocardial, autologous CD34+ cell therapy for refractory angina. Circ Res. 2011;109(4):428-436.

[20] Irollo E, Pirozzi G. CD133: to be or not to be, is this the real question? Am J Transl Res. 2013;5(6):563-581.

[21] Mizrak D, Brittan M, Alison M. CD133: molecule of the moment. J Pathol. 2008;214(1):3-9.

[22] Donovan LK, Pilkington GJ. CD133: holy of grail of neuro-oncology or promiscuous red-herring? Cell Prolif. 2012;45(6):527-537.

[23] Fargeas CA, Florek M, Huttner WB, et al. Characterization of prominin-2, a new member of the prominin family of pentaspan membrane glycoproteins. J Biol Chem. 2003;278(10):8586-8596.

[24] Barcelos LS, Duplaa C, Kränkel N, et al. Human CD133+ progenitor cells promote the healing of diabetic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling. Circ Res. 2009;104(9):1095-1102.

[25] Pozzobon M, Bollini S, Iop L, et al. Human bone marrow-derived CD133(+) cells delivered to a collagen patch on cryoinjured rat heart promote angiogenesis and arteriogenesis. Cell Transplant. 2010;19(10): 1247-1260.

[26] 赵瑞刚,蔡俊彦,王军力.N端脑钠肽在心力衰竭诊治中的应用进展[J].河北医药,2013,35(2):268-270.

[27] 滕伟,薛永亮,何兆辉,等.磷酸肌酸钠对冠心病并慢性心力衰竭患者B型利钠肽及心功能的影响[J].中国医药导报, 2012,9(18):59-60.

[28] Fosbøl EL, Seibaek M, Brendorp B, et al. Long-term prognostic importance of resting heart rate in patients with left ventricular dysfunction in connection with either heart failure or myocardial infarction: the DIAMOND study. Int J Cardiol. 2010;140(3):279-286.

[29] Schroten NF, Ruifrok WP, Kleijn L, et al. Short-term vitamin D3 supplementation lowers plasma renin activity in patients with stable chronic heart failure: an open-label, blinded end point, randomized prospective trial (VitD-CHF trial). Am Heart J. 2013;166(2): 357-364. e2.

[30] Gheorghiade M, Böhm M, Greene SJ, et al. Effect of aliskiren on postdischarge mortality and heart failure readmissions among patients hospitalized for heart failure: the ASTRONAUT randomized trial. JAMA. 2013;309(11):1125-1135.

[31] 王辉,张知翠,罗晓菊,等.人脐血干细胞移植建立人鼠嵌合体动物模型实验研究[J].实用医院临床杂志,2008,5(4): 40-43.

[32] Strauer BE, Brehm M, Zeus T, et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation. 2002;106(15):1913-1918.

[33] 李丽,王明元,程根林,等.流式细胞术在成分血残留白细胞检测中的应用[J].临床输血与检验,2004,6(3):177-179.

[34] Romanic AM, Harrison SM, Bao W, et al. Myocardial protection from ischemia/reperfusion injury by targeted deletion of matrix metalloproteinase-9. Cardiovasc Res. 2002;54(3):549-558.

[35] Li YY, McTiernan CF, Feldman AM. Interplay of matrix metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and their regulators in cardiac matrix remodeling. Cardiovasc Res. 2000;46(2):214- 224.

[36] 徐赤裔,周建庆,方建江,等.干细胞移植治疗实验犬心肌梗死后心力衰竭的作用[J].浙江医学,2007,29(9):931-934.

[37] Qiao H, Zhang H, Zheng Y, et al. Embryonic stem cell grafting in normal and infarcted myocardium: serial assessment with MR imaging and PET dual detection. Radiology. 2009;250(3):821-829.

[38] 郝牧,漆佩静,李刚,等.人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响[J].中国医学科学院学报,2010,32(1):71.

[39] 毛平,彭盘俐,许力.人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD/SCID小鼠重建多系造血[J].中华器官移植杂志, 2006,27(4):231-234.

[40] 谭玲,陈勇华,张春明,等.人脐血CD133细胞的分离及其体外扩增的研究[J].现代生物医学进展,2007,7(6): 853-856.

[41] 车京津,张承宗,陈元禄,等.缬沙坦、苯那普利及合用时对心肌梗死后心室重构影响的比较[J].中国心血管杂志, 2002,7(6):381-384.

[42] 张军霞,李瑞,赵鹏,等.CD133免疫磁珠分选脐血内皮祖细胞的培养及鉴定[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2008, 15(2):159-162.

[43] Beier D, Hau P, Proescholdt M, et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Res. 2007;67(9):4010-4015.

[44] 吴计生,段淑云,郝建平.免疫组化抗原修复的应用进展[J].实用医技杂志,2006,13(20):3592-3593.

[45] 康文慧,马元,罗明.两种剂量异丙肾上腺素制备心衰大鼠模型心功能的比较[J].同济大学学报(医学版),2009,30(4): 50-53.

[46] 冯清华,张晶.心理干预联合药物治疗老年慢性心力衰竭患者疗效观察[J].中国循证心血管医学杂志,2011,3(4): 295-296.

[47] 中国康复医学会心血管病专业委员会,中国老年学学会心血管病专业委员会.慢性稳定性心力衰竭运动康复中国专家共识[J].中华心血管病杂志,2014,42(9):714-720.

[48] Freyssin C, Verkindt C, Prieur F, et al. Cardiac rehabilitation in chronic heart failure: effect of an 8-week, high-intensity interval training versus continuous training. Arch Phys Med Rehabil. 2012;93(8):1359-1364.

[49] 沈玉芹,蒋金法,王乐民,等.有氧运动康复对慢性心力衰竭患者运动心排血量及相关参数的影响[J].中华心血管病杂志,2011,39(8):700-705.

[50] 陈巍,林平,李玲.中文版心力衰竭患者自我护理行为量表的信效度检测[J].中华护理杂志,2013,48(7):629-631.

[51] 党海舟,李明凯,徐明,等.主动脉弓缩窄术和腹腔注射IPH致小鼠慢性心衰两种模型的比较和评价[J].心脏杂志, 2012,24(2):168-172.

[52] 孙晓靖.他汀类药物对异丙肾心衰大鼠心肌细胞凋亡影响的研究[D].乌鲁木齐:新疆医科大学,2009.

[53] Koutna I, Peterkova M, Simara P, et al. Proliferation and differentiation potential of CD133+ and CD34+ populations from the bone marrow and mobilized peripheral blood. Ann Hematol. 2011;90(2):127-137.

[54] 谢亚序,康大伟,李秀华.慢性心力衰竭心肌纤维化大鼠模型的建立[J].承德医学院学报,2011,28(1):10-12.

[55] To LB, Haylock DN, Dowse T, et al. A comparative study of the phenotype and proliferative capacity of peripheral blood (PB) CD34+ cells mobilized by four different protocols and those of steady-phase PB and bone marrow CD34+ cells. Blood. 1994;84(9):2930-2939.

[56] Freund D, Oswald J, Feldmann S, et al. Comparative analysis of proliferative potential and clonogenicity of MACS-immunomagnetic isolated CD34+ and CD133+ blood stem cells derived from a single donor. Cell Prolif. 2006;39(4):325-332.

[57] Charrier S, Boiret N, Fouassier M, et al. Normal human bone marrow CD34(+)CD133(+) cells contain primitive cells able to produce different categories of colony-forming unit megakaryocytes in vitro. Exp Hematol. 2002;30(9):1051-1060.

[58] Menasche P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(2):258-265.

[59] Minami I, Yamada K, Otsuji TG, et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell Rep. 2012;2(5):1448-1460.

[60] Fonoudi H, Ansari H, Abbasalizadeh S, et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. 2015; 4(12):1482-1494.

[61] Willems E, Spiering S, Davidovics H, et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 2011;109(4): 360-364.

[62] Lian X, Hsiao C, Wilson G, et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(27):E1848-1857.

[63] Lian X, Zhang J, Azarin SM, et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 2013;8(1): 162-175.

[64] Frank S, Zhang M, Schöler HR, et al. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PLoS One. 2012;7(7):e41958.

引言

心力衰竭属退行性疾病^[1]，每年患者达到2 000万例次，并且每年用于失代偿心衰的费用达到1 200亿美元，5年死亡率高达50%^[2-3]。目前心力衰竭常以药物治疗，如：血管紧张素转换酶抑制剂、硝酸甘油片等，药物虽然能改善患者症状，但是多数方法难以治根，且多数损伤细胞难以修复再生，影响患者治疗预后^[4-5]。

研究显示骨髓干细胞能产生新的心肌细胞，并且能改善小鼠的心脏功能^[6-7]。干细胞属于是一类比较特殊的细胞，细胞类型较多，如造血干细胞、造血祖细胞、内皮前体细胞等，该类细胞和其他细胞相比来源更加丰富、方便，对供者不会产生损害，移植后急、慢性移植物抗宿主病的发生率较低，并且该细胞受到胎盘的过滤保护，从而降低了感染率^[8-9]。干细胞移植心衰的首篇文章于2001年在《Nature》发表，纽约医学院学者将骨髓干细胞移植到心梗小鼠心脏中，使其能产生新的心肌细胞，从而能改善心功能，文章揭开了干细胞治疗心衰的序幕。目前，细胞再生治疗的主要目的在于增加标准治疗基础上的获益，且细胞治疗集中在两大领域^[10-11]：急性心肌梗死心脏恢复治疗和慢性缺血性心脏病心脏恢复治疗。心脏保护治疗的目的主要是限制心肌缺血损伤，对于心衰患者，细胞再生治疗旨在保留正常的心肌功能^[12-13]。CD133属一种糖蛋白，是长效五羟淀粉跨膜糖蛋白成员之一，能定位细胞突起^[14-15]。动物研究显示，CD133不仅只表达在造血干细胞、内皮祖细胞等干细胞表面，还能作用于肿瘤细胞中^[16-19]。CD133能在不同的原始细胞中发挥重要的作用和效果，使得在脐血中分离原始干细胞成为可能^[20]。作者拟观察CD133⁺细胞联合人脐血干细胞治疗心力衰竭小鼠模型的效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年10月至2015年12月在昆明医科大学第一附属医院干疗科、心内科完成。

1.3 材料清洁级Balb/C裸小鼠20只，体质量23.5- 25.6 g，雌雄不限，由昆明医科大学第一附属医院动物实验中心提供，许可证号：SYXK(滇)2013-0012。实验动物均由昆明医科大学第一附属医院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养^[21-24]。对Balb/C裸小鼠进行等条件喂养，对Balb/C裸小鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导下意见》中相关规则。将20只Balb/C裸小鼠随机分为单个核细胞组和CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组，每组10只。

婴儿脐血均采集于昆明医科大学第一附属医院产科新生儿中，实验符合相关医学伦理学要求，获得婴儿家属批准同意，且实验经过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准同意。

CD133⁺细胞联合人脐血干细胞治疗心力衰竭小鼠模型使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
异丙肾上腺素(国药准字H31021344)	上海禾丰制药有限公司
庆大霉素	山西兆益生物有限公司
小鼠基质金属蛋白酶9酶联免疫试剂盒	武汉博士德生物工程公司
超微磁珠	美国 Beckman Coulter公司
细胞计数板显微镜	日本 Macroplat 公司
天平	上海嘉展仪器设备有限公司

1.4 方法

1.4.1 人脐血干细胞和CD133⁺细胞的分离

人脐血干细胞分离：采集100 mL产科足月分娩婴儿脐血，排除传染性疾病及各种家族遗传病，采用EDTA抗凝，出生后3 h分离脐血^[25-26]。脐血2 000 r/min离心20 min，取上、中层界面白色云雾层狭窄带，即单个核细胞(包括淋巴细胞核单核细胞核干细胞及血小板)，利用毛细血管插入云雾层，吸取单个细胞，置入另一个短管中，用体外贴壁生长的方法以DMEM/F12培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层，采用定向诱导分化方法检测鉴定获得的脐血干细胞^[27-28]。

CD133⁺细胞分离：向单个核细胞中加入少量PBE孵育液，充分混悬细胞，加入一抗，PBS冲洗一次，制备悬液细胞后加入超微磁珠，充分混合后孵育10-15 min，加入0.5 mL PBS，收集首次流下细胞。从磁场中去除分离柱，插入试管，加入PBS，利用针芯用力推，收集细胞，获得CD133⁺细胞^[29-30]。

1.4.2 小鼠心力衰竭模型的建立所有小鼠以体积分数3.6%水合氯醛进行全身麻醉，仰卧固定在手术台上，向小鼠腹腔镜注入异丙肾上腺素进行造模，每天注射 5 mg/kg，连续注射5 d，建立心力衰竭模型^[31-32]。测定小鼠心功能，造模后立即肌肉注射庆大霉素，连续肌注3 d，常规饲养。

1.4.3 细胞移植两组小鼠造模2周后进行细胞移植，单个核细胞组小鼠经尾静脉注射2×10⁵个单个核细胞治疗，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组经尾静脉注射2×10⁵个CD133⁺细胞联合2×10⁵个人脐血干细胞治疗，1次/d，Balb/C裸小鼠治疗后经过耳静脉注射160×10⁴ U青霉素^[33-34]。小鼠治疗后进行常规饲养。

1.4.4 体质量及器官质量检测两组小鼠造模后14 d杀死小鼠，采用天平测定两组小鼠实验后体质量情况及各器官质量^[35-36]。

1.4.5 病理观察观察两组小鼠实验后14 d苏木精-伊红染色检测心肌组织病理变化^[37]，计算心肌胶原纤维平均面积。

1.4.6 血清基质金属蛋白酶9质量浓度的分析检测两组小鼠治疗后血清基质金属蛋白酶9质量浓度，后者采用免疫ELISA方法进行测定。

1.4.7 Masson染色取2组小鼠心肌组织切片，甲醛固定，自来水洗，苏木精染色5-10 min，充分水洗，用Masson丽春红酸性复红液染色5-10 min，以冰醋酸水溶液浸洗片刻，磷钼酸水溶液分化3-5 min，苯胺蓝染色5 min，冰醋酸水溶液浸洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固^[38-39]。

1.5 主要观察指标小鼠心肌病理变化、心肌胶原纤维平均面积与血清基质金属蛋白酶9质量浓度变化。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，LSD法进行两两比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心衰属于是一种进展性疾病，近年来该疾病发生率随着中国人口老龄化的加剧出现上升趋势^[40]。而失代偿心衰则成为患者多数入院治疗的主要原因之一^[41-42]。因此，临床上建立小鼠心衰模型，研究其发病机制及治疗方法具有重要的意义^[43-44]。在正常生理情况下，β-肾上腺素受体对于机体心肌收缩和舒张活动会产生明显的影响，但是当机体出现心衰后容易引起心肌细胞肥大、凋亡等^[45-46]。研究显示一次性注射大剂量异丙肾上腺素能造成小鼠弥散性心肌坏死、纤维化，并且容易引起心力衰竭，该建模方法操作简单，容易控制^[47-48]。此次实验每天腹腔注入5 mg/kg异丙肾上腺素建立小鼠模型。

近年来，CD133⁺联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中得到应用，且效果理想^[49-50]。实验中，两组小鼠实验前体质量接近(P > 0.05)；CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组治疗后体质量显著大于单个核细胞组(P < 0.05)；CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组治疗后肝脏质量、心脏质量以及肺脏质量显著大于单个核细胞组(P < 0.05)。CD133⁺是最早用于骨髓和外周血中的造血干细胞和内皮祖细胞，后来随着研究的不断深入该细胞在血管内皮细胞、皮肤、肌肉等中均有发现^[51-52]。目前，CD133单独使用作为干细胞的表面特异性抗原已经得到公认，并且将其运用于治疗急性心肌梗死及慢性缺血性心脏病中，并取得阶段性进。由于CD133⁺在机体中表达相对特殊，使得CD133⁺具备成为移植用干细胞条件，使得从脐血中分离原始干细胞成为可能。苏木精-伊红染色显示，治疗30 d后，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组小鼠心肌排列整齐，而单个核细胞组小鼠心肌排列紊乱。当小鼠植入CD133⁺后，细胞由于具备原始幼稚细胞特定，能够发挥其诱导分化作用和旁分泌机制，能够在心肌微环境中分泌出多种促进血管新生的细胞因子，能增加梗死区内血管密度，并且该细胞还能分泌抗凋亡的细胞因子，能够促进损伤的心肌细胞进行修复，更好的保护心肌细胞^[53-57]。实验中，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组心肌胶原纤维平均面积，显著小于单个核细胞组(P < 0.05)；CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组血清血清基质金属蛋白酶9浓度，显著低于单个核细胞组(P < 0.05)。此外，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞能够植入机体后能分泌一些具备免疫调节活性的蛋白因子，从而能调节机体免疫，延缓心室重构，促进心肌损伤的早期恢复^[58-64]。Masson染色结果显示，治疗30 d后，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞组小鼠肺部蓝色胶原纤维较少，排列相对整齐；单个核细胞组小鼠心内膜出现不同程度胶原纤维增多，排列紊乱。

综上所述，CD133⁺细胞联合人脐血干细胞治疗小鼠心力衰竭效果理想，能改善心衰小鼠心肌间质纤维化，且治疗时动态监测基质金属蛋白酶9能反映心肌纤维花程度，为心衰治疗提供新的思路和方法，具有较高的临床应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

CD133⁺细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用

CD133⁺ cells in combination with human umbilical cord stem cells in mouse heart failure

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.

CD133+细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用

CD133+ cells in combination with human umbilical cord stem cells in mouse heart failure

PDF

可视化

引用本文

使用本文

CD133⁺细胞联合人脐血干细胞在心力衰竭小鼠中的作用

CD133⁺ cells in combination with human umbilical cord stem cells in mouse heart failure