骨髓基质干细胞移植阿尔茨海默病模型大鼠：改善学习及记忆能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.012

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 2059-2065.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.012

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骨髓基质干细胞移植阿尔茨海默病模型大鼠：改善学习及记忆能力

高明龙，张英东，李娜，乔君，余明

河北医科大学第一医院精神科，河北省石家庄市 050031

收稿日期:2016-02-23 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: 余明，硕士，副主任医师，河北医科大学第一医院精神科，河北省石家庄市 050031
作者简介:高明龙，男，1978年生，汉族，山东省茌平县人，2003年齐齐哈尔医学院毕业，硕士，主治医师。
基金资助:
河北省计生委员会2014年度医学科学研究课题(ZL20140099)

Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into a rat model of Alzheimer’s disease: improvement in the learning and memory ability

Gao Ming-long, Zhang Ying-dong, Li Na, Qiao Jun, Yu Ming

Department of Psychiatry, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China

Received:2016-02-23 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: Yu Ming, Master, Associate chief physician, Department of Psychiatry, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
About author:Gao Ming-long, Master, Attending physician, Department of Psychiatry, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
Supported by:
the Medical Science Research Project of Hebei Health and Family Planning Commission in 2014, No. ZL20140099

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

阿尔茨海默病模型大鼠：给大鼠注射β淀粉样蛋白可引起大鼠脑组织神经元功能丧失，导致学习记忆能力下降，最终使β淀粉样蛋白沉积，可构建阿尔茨海默病模型。学习记忆的损伤与海马神经再生障碍有关，β淀粉样蛋白沉积引起痴呆会导致海马功能受损，进而导致新生神经元下降。

阿尔茨海默病：又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。阿尔茨海默病的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。

背景：临床上通过药物治疗阿尔茨海默病患者虽然在一定程度上可以减轻和延缓阿尔茨海默病的进展，但单药治疗只有30%的患者达到临床治愈，而且并不能完全康复。
目的：观察大鼠骨髓基质干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠的治疗作用。
方法：将大鼠海马区注射β淀粉样蛋白建立阿尔茨海默病模型大鼠，并在模型大鼠的海马区进行大鼠骨髓基质干细胞移植。
结果与结论：①行为学变化：造模2周后，与对照组比，模型组和实验组大鼠逃避潜伏期均明显较长 (P < 0.05)，表明阿尔茨海默病模型大鼠建造成功。细胞移植4周后，与模型组比，实验组大鼠平均逃避潜伏期迅速下降(P < 0.05)，大鼠在平台象限滞留时间明显延长(P < 0.05)；②胆碱乙酰化酶：细胞移植4周后，脑组织检测结果显示，实验组大鼠胆碱乙酰化酶的表达与模型组相比显著提高(P < 0.05)。③结果显示：骨髓基质干细胞可在阿尔茨海默病大鼠海马区分化及存活，对其学习及记忆能力具有一定的改善作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3083-5271(余明)

关键词: 干细胞, 移植, 阿尔茨海默病, β淀粉样蛋白, 骨髓基质干细胞, 大鼠, 干细胞移植, 海马, 胆碱乙酰化酶, 水迷宫, 逃避潜伏期, 滞留时间

Abstract:

BACKGROUND: Drug therapy can partly reduce and delay the progress of Alzheimer’s disease, but only 30% with the single drug treatment obtain clinical cure.
OBJECTIVE: To study the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation for rats with Alzheimer’s disease.
METHODS: Amyloid β-protein was injected into the hippocampus of Sprague-Dawley rats to construct the model of Alzheimer’s disease. And bone marrow stromal stem cells were transplanted into the hippocampus of the rat models.
RESULTS AND CONCLUSION: At 2 weeks after modeling, compared with the control group, the escape latency in the model and experimental groups was significantly longer (P < 0.05), which indicating that Alzheimer’s disease models were successfully established. At 4 weeks after cell transplantation, compared with the model group, the average escape latency in the experimental group was significantly decreased, but retention time on the platform quadrant was significantly prolonged (P < 0.05). Besides, at 4 weeks after cell transplantation, expression of choline acetyltransferase in the experimental group was significantly higher than that in the model group (P < 0.05). In conclusion, bone marrow mesenchymal stem cells cannot only differentiate and survive in the hippocampus of rats with Alzheimer’s disease, but also improve the learning and memory ability.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Alzheimer Disease

高明龙，张英东，李娜，乔君，余明. 骨髓基质干细胞移植阿尔茨海默病模型大鼠：改善学习及记忆能力[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2059-2065.

Gao Ming-long, Zhang Ying-dong, Li Na, Qiao Jun, Yu Ming. Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into a rat model of Alzheimer’s disease: improvement in the learning and memory ability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2059-2065.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析大鼠30只全部纳入结果分析，无脱落。

2.2 体外培养的骨髓基质干细胞形态第1代骨髓基质干细胞细胞成纤维状，见图1A；第2代干细胞已经充分贴壁生长，呈长梭形，见图1B；第3代骨髓基质干细胞呈漩涡样分布，生长旺盛，折光性好，形态饱满，见图1C。第4代体外培养干细胞经免疫化学染色可见骨髓基质干细胞表达显阳性，干细胞胞核呈现为蓝色，而胞浆呈现为棕褐色，阳性细胞比例在99%以上，见图1D。

2.3 大鼠行为学变化 Morris水迷宫测定结果显示：造模前各组大鼠连续5 d的逃避潜伏期测试，各组SD大鼠平均逃避潜伏期差异无显著性意义(P > 0.05)；造模2周后，与对照组比，模型组和实验组SD大鼠逃避潜伏期均明显较长(P < 0.05)。细胞移植4周后，与模型组相比，实验组大鼠平均逃避潜伏期迅速下降(P < 0.05)，但长于对照组大鼠的水平，见表1。

造模前，3组大鼠在平台象限滞留时间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；造模后2周，与对照组比较，模型组与实验组SD大鼠滞留时间明显缩短(P < 0.01)；骨髓基质干细胞移植4周后，与对照组相比，模型组与对照组大鼠在平台象限滞留时间明显较短(P < 0.01)，而与模型组相比，实验组大鼠在平台象限滞留时间明显延长(P < 0.05)，但延长时间尚达不到对照组大鼠滞留时间的水平(P < 0.01)。见表2。

2.4 SD大鼠海马移植部位形态学变化胆碱乙酰化酶在大鼠脑内的阳性表达率分别为对照组(13.84± 3.53)%，模型组(6.18±2.55)%，实验组(10.48±2.06)%，3组差异有显著性意义(P < 0.05)。此外，由图片可以看出，模型组脑切片病理组织混乱，结构参差不齐；而实验组在病理结构上有所改善(图2)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年5月至2015年4在河北医科大学第一医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选取SPF级体质量(230±20) g的健康SD雄性大鼠30只，采购于河北省实验动物中心，饲养温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%下适应性喂养1周，其中20只用于干细胞治疗实验。

另选10只4周龄体质量(25±5) g的雄性大鼠用于分离骨髓基质干细胞，同样由上海交通大学医学院实验动物中心提供，用于大鼠骨髓基质干细胞的分离及培养。

实验对SD大鼠和大鼠的处置均符合2006年中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准^[14]。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓基质干细胞的分离、培养和鉴定取10只大鼠，麻醉后断颈法处死，在体积分数75%乙醇中浸泡5 min杀菌，在无菌操作台上解剖大鼠双侧后肢，取出股骨及胫骨(已经除去了软组织及表面的肌肉)。用DMEM培养液冲洗3次，剪刀剪去骨骺端，用标准培养液冲洗，冲出后的细胞悬浮液于低温条件下，以2 000 r/min离心 5 min，除去上清液，轻轻加入淋巴细胞分离液上层，以3 000 r/min离心15 min，取界面单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液润洗2次，以2 000 r/min，离心5 min，弃去上清液，加入培养液制成悬液。调整细胞浓度约3.0×10⁶ L^-¹接种于培养瓶(含高糖DMEM培养基+体积分数为10%胎牛血清)，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培育箱，观察细胞形态变化，培育2 d，用体积分数0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成单细胞悬液，以细胞数约为3.0×10⁶ L^-¹接种进行传代。第3代细胞培养到第3天时，接种后在培育箱中继续培养72 h，使用胰蛋白酶消化，以1 500 r/min，离心 5 min，细胞计数仪调整细胞浓度约为1.0×10¹⁰ L^-¹移植备用。培养好后，对细胞进行CD44免疫组织化学染色鉴定。具体方法为，取培养好的细胞加入FITC-CD44标记抗体，显微镜观察，如大部分细胞有染绿色荧光，则细胞为目标细胞。

1.4.2 阿尔茨海默病大鼠模型的建立及干预参考以往文献方法^[44]，建模用SD大鼠30只，给大鼠以10 mL/kg腹腔注射体积分数3%水合氯醛，麻醉后，在无菌操作台面上，固定大鼠，参照大鼠脑立体定位图谱，切开大鼠头皮，用微型钻在大鼠颅骨上打空。在建模用大鼠双侧海马区内注射β淀粉样蛋白10 μL。同样方法在对照组大鼠双侧海马区域内注射等量的生理盐水。于造模2周后，采用Morris水迷宫方法检测各组SD大鼠的学习记忆改变情况，检测大鼠是否造模成功，阿尔茨海默病SD大鼠模型建立成功之后再进行分组。

1.4.3 分组及干细胞移植建模后将全部30只大鼠分为3组，对照组、模型组、实验组，每组各10只。对照组不做任何处理，正常饲料喂养，给予蒸馏水饮用；实验组大鼠，造模成功第3周，进行骨髓基质干细胞移植，移植部位依照《大鼠脑立体定位图谱》，用微量注射器(量程10 μL)，将含骨髓基质干细胞约1.0×10⁵个细胞的悬乳液立体定位注入SD大鼠双侧海马区，两侧各移植细胞数约为1.0×10⁵(10 μL)，慢慢注射，注射针停留4 min；移植成功后，给予普通大鼠饲料正常喂养4周；模型组造模后第5天，在SD大鼠海马脑区注入等量的生理盐水。Morris水迷宫行为学检测后，乙醚麻醉，眼内眦采取静脉血，之后采取颈椎脱臼法处死所有大鼠，在冰上解剖，剥离出双侧海马组织，置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，以备后期制备石蜡切片。

1.4.4 Morris水迷宫大鼠行为学测试^[18] 分别于移植后第1，3，7周，进行水迷宫实验。实验测试包括2部分：空间探索试验和定位航行试验。

定位航行试验：按照随机的原则分别从不同的象限将SD大鼠从池壁放入，记录SD大鼠从入水到寻找到平台的轨迹线路、以及花费的时间即为逃避潜伏期。寻找到平台休息20 s后，进行下一步的测试。如果大鼠在100 s内未找到平台，将大鼠牵引至平台，并停留30 s，则大鼠逃避潜伏期记录为100 s。

空间探索试验：SD大鼠从池壁放入水中，记录大鼠在2 min内的运行轨迹以及在平台象限滞留时间。

1.4.5 大鼠脑组织病理学检查最后1次水迷宫检测完成后，麻醉处死各组SD大鼠，于碎冰上及时分离出SD大鼠脑组织，一部分脑组织及时置于含有40 g/L多聚甲醛的PBS的标本储存瓶中，在固定液中放置24 h以上，再进行完全脱水处理，石蜡包埋，病理切片机切片。苏木精-伊红红染色处理：切片预处理完成后，浸泡于苏木精染液中，泡置4 min，用蒸馏水冲洗，再分化约1 min，用蒸馏水冲洗3 min，用氨水返蓝3 min，浸泡于伊红中大约1 min，蒸馏水冲洗约1 min，之后脱水干燥，透明后，封固，于光学显微镜下观察每张切片海马区细胞的变化。

1.4.6 胆碱乙酰化酶免疫组织化学染色最后1次水迷宫检测完成后，取大脑组织进行免疫组化检测。切片免疫组织化学染色过程，第1步：阻断过氧化物酶活性(把切片用体积分数3%过氧化氢-甲醇溶液处理15 min)；第2步：阻断非特异性反应，切片用体积分数1%聚乙二醇辛基苯基醚-体积分数5%羊血清封闭30 min，同时使细胞膜的通透性增加；第3步：放入1∶500的胆碱乙酰化酶抗体，置于37 ℃培养箱中培育2 h，再用PK9000处理后，再继续培育2 h，最后用DAB显色。荧光显微镜下观察移植的骨髓基质干细胞在阿尔茨海默大鼠海马区域内的存活情况，并进行免疫组织化学染色，交由病理医生做组织评价。

1.5 主要观察指标骨髓基质干细胞的鉴定，Morris水迷宫大鼠行为学测试，大鼠脑组织病理学检查及胆碱乙酰化酶免疫组织化学染色。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，组间差异比较釆用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

阿尔茨海默病是一种与年龄密切相关，且表现为不可逆性的退行性神经系统疾病^[1]。国内外研究显示，阿尔茨海默病患者通常伴有行为学障碍，主要集中在执行、注意力等下降，以及记忆功能减退，精神运动学障碍和信息处理障碍，导致患者不能正常思考和判断，必须由家属照料日常生活等。随着社会的老龄化进程，阿尔茨海默病患者会越来越多，使阿尔茨海默病症成为21世纪成为对人类健康造成严重威胁的疾病之一，与此同时也必将给社会及患者家属带来沉重的社会和经济负担。此病的主要临床症状为记忆障碍、失认、视空间技能损伤、执行功能障碍以及人格和行为改变等，随着病情的不断恶化，最终会导致行为紊乱和个性的全面性痴呆，对于此的病因病机目至今尚不清楚。因此，临床寻找一种新的治疗方法，且治疗效果明显的治疗方法一直是科学工作者努力的方向。

阿尔茨海默病所涉及的复杂病理、生理目前还没有彻底研究清楚。动物模型是研究阿尔茨海默病的关键。由于阿尔茨海默病的发病过程与衰老有密切相关，而患者的病理生理变化及发生发展的过程，动物是不能完全取代的。所以阿尔茨海默病动物模型只能模拟部分特征，常见的动物模型有自然衰老模型、β淀粉样蛋白注射诱导模型^[19-20]、基底前脑胆碱能系统损伤模型(包括手术损伤模型、化学损毁模型)^[21]、慢性缺血痴呆模型^[22]、铝中毒模型、与Tau蛋白过度磷酸化有关的痴呆动物模型^[23-24]、复合动物模型及转基因动物模型^[25-26]。

β淀粉样蛋白沉积是神经元损害及记忆力丧失的重要原因。研究显示，β淀粉样蛋白有神经毒性和营养的双重作用^[27]。实验证明高浓度β淀粉样蛋白对神经元只有毒性效果。高浓度β淀粉样蛋白对大鼠记忆能力可造成损害，导致大鼠海马区和胆碱乙酰化酶活性降低，最终形成老年斑和神经元丢失^[28-30]。β淀粉样蛋白注射建造阿尔茨海默病大鼠模型被认为一种较理想的建造动物模型，目前应用广泛。实验采用在SD大鼠海马区注射β淀粉样蛋白建造老年痴呆模型，造模2周后，与对照组比，模型组和实验组SD大鼠逃避潜伏期均明显较长，而实验组与模型组相比，大鼠逃避潜伏期无显著差异，表明老年痴呆阿尔茨海默病大鼠模型建造成功。

海马是大脑边缘系统的一部分，可分为齿状回、海马及内嗅皮质等。与学习、记忆、情绪及行为学等有密切的关系，所以在阿尔茨海默病研究中，海马是被研究最多的对象之一。研究发现，海马神经元前体神经纤维可应对刺激增加神经的再生^[31-34]。而给大鼠注射β淀粉蛋白可引起大鼠脑组织神经元功能丧失，导致学习记忆能力下降，最终使β淀粉样蛋白沉积^[35-36]。通过动物研究发现，学习记忆的损伤与海马神经再生障碍有关，β淀粉样蛋白沉积会引起的痴呆会导致海马的受损，进而导致新生神经元下降。在临床阿尔茨海默病患者研究中，发现患者海马数量明显减少^[37-39]。

研究表明骨髓基质干细胞具有分化成神经组织的能力，可修复神经组织^[40-41]。而且研究证实，干细胞移植可以为治疗神经系统损伤和神经退行性疾病提供理想和丰富的细胞来源^[42-43]。实验显示：造模2周后，与对照组比，模型组和实验组大鼠逃避潜伏期均明显较长，而实验组与模型组相比，大鼠逃避潜伏期无显著性差异，表明阿尔茨海默病大鼠模型建造成功。骨髓基质干细胞移植4周后，与模型组相比，实验组大鼠平均逃避潜伏期迅速下降，但实验组与对照组比，实验组大鼠逃避潜伏期长于对照组；经方差分析检测发现，与对照组在平台象限滞留时间相比，模型组与对照组大鼠在平台象限滞留时间明显较短，而模型组与实验组组间相比，实验组大鼠在平台象限滞留时间明显延长，但延长时间达不到对照组大鼠滞留时间的水平。大鼠脑组织检测结果显示，胆碱乙酰化酶在大鼠脑内的阳性表达率在3组间均差异有显著性意义。

实验结果显示，骨髓基质干细胞不仅能在阿尔茨海默病大鼠海马区内分化存活，而且对学习及记忆能力具有一定的改善作用。基于实验的结果，结合药效和毒理学实验，可以初步为干细胞临床用于阿尔茨海默病的治疗奠定基础。但实验只进行了药效学部分的探讨，未进行免疫排斥反应相关的研究，因此干细胞临床使用还需要更多的实验来给及支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓基质干细胞移植阿尔茨海默病模型大鼠：改善学习及记忆能力

Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into a rat model of Alzheimer’s disease: improvement in the learning and memory ability

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