骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.010

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

前列腺癌DU145细胞：DU145是从一位有3年淋巴细胞白血病史的前列腺癌患者的脑部转移灶中建立的。该细胞系未检测到激素敏感性，酸性磷酸酶阳性，单个的细胞可在软琼脂中形成集落。对此细胞和原始肿瘤的亚显微结构分析可见微绒毛、微丝、细胞桥粒、线粒体、发达的高尔基体和异质溶酶体。

克隆形成率：反映细胞群体依赖性和增殖能力2个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

背景：研究表明，骨髓间充质干细胞与肿瘤的发生和发展具有密切关系，不仅表现为对肿瘤有明显的募集作用，还表现在干预肿瘤细胞的生物学行为。

目的：探讨骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞生物学行为的影响。

方法：采集健康成人骨髓间充质干细胞，实验组将前列腺癌Du145细胞和骨髓间充质干细胞分别接种于Transwell小室的上下两室进行共培养，阳性对照组为人真皮成纤维细胞HDF-a细胞与人前列腺癌Du145细胞共培养，阴性对照组为野生型前列腺癌Du145细胞单独培养。培养3 d后，流式细胞仪检测前列腺癌Du145细胞的细胞周期，软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖活性，结晶紫染色观察Du145细胞迁移能力。

结果与结论：①与阳性对照组相比，实验组处于G₂/M+S期的细胞比例、透过滤膜数量和克隆形成数明显减少；②结果表明，骨髓间充质干细胞通过缩短前列腺癌Du145细胞G₂/M+S期，抑制前列腺癌Du145细胞的增殖和侵袭能力，为前列腺癌的治疗提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-7905-7533(刘建军)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 前列腺癌, 骨髓间充质干细胞, Du145细胞, 细胞周期, 细胞增殖, 侵袭能力

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have a close relationship with tumor occurrence and development, which are not only involved in tumor recruitment but impact the biological behavior of tumor cells.

OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the biological behavior prostate cancer cell line.

METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells from healthy adults were collected and cultured in vitro. Cell morphology and cell markers were observed. Using the Transwell technique, human dermal fibroblasts HDF-a were co-cultured with human prostate carcinoma DU145 cells in positive control group, wild-type prostate carcinoma DU145 cells cultured alone in negative control group, and bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with human prostate carcinoma DU145 cells in experimental group. Flow cytometry assay was used to detect the cell cycle of prostate carcinoma DU145 cells, soft agar colony formation assay performed to detect cell proliferative ability, and crystal violet staining used to observe DU145 cell migration at 3 days after culture.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the negative control group, cell proportion at G₂/M+S phase, number of transmembrane cells and colony counting were significantly decreased in the experimental group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells may inhibit the proliferation and invasion of prostate carcinoma DU145 cells by shortening the G₂/M+S phase, thereby providing a new insight into the treatment of human prostate cancer.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Prostatic Neoplasms, Cell Cycle, Cell Proliferation, Tissue Engineering

刘建军，段小雨. 骨髓间充质干细胞对前列腺癌细胞生物学行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2046-2051.

Liu Jian-jun, Duan Xiao-yu. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the biological behavior of prostate cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 2046-2051.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞的形态利用密度梯度离心法从健康成年人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，接种于培养瓶中培养2 d，去除未贴壁细胞，更换细胞培养液，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中继续培养，骨髓间充质干细胞完全贴壁，呈现出三角形或长梭形、多边形等多种形态，细胞内折光性强，颗粒不明显(图1)。

2.2 骨髓间充质干细胞表面标志物表达流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物CD29、CD73、CD90、CD105呈阳性表达，阳性表达率分别为98%，97%，96%，95%；而CD14、CD34、CD45呈阴性表达，阳性表达率分别为0.22%，0.83%，2.11%。

2.3 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞周期的影响 G₂/M+S期细胞百分比是评价体外培养细胞增殖能力和水平的重要指标之一，各组细胞培养3 d后，流式细胞仪检测各组Du145细胞周期变化。阴性对照组G₂/M+S细胞百分比为(45.73±3.54)%，实验组G₂/M+S期细胞百分比为(25.33±2.01)%，阳性对照组G₂/M+S期细胞百分比为(58.22±2.58)%。与阳性对照组相比，实验组G₂/M+S期细胞百分比显著减少，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.4 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞增殖的影响细胞克隆形成数是评价细胞增殖能力的重要指标，各组细胞培养3 d后，通过软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力。与阴性对照组克隆形成率(78.09± 15.36)%相比，实验组克隆形成率明显减少(31.44± 11.37)%，差异有显著性意义(P < 0.01)；阳性对照组克隆形成率(120.82±19.16)%明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。与阳性对照组相比，实验组克隆形成率显著减少，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.5 骨髓间充质干细胞对前列腺癌Du145细胞侵袭能力的影响各组细胞培养3 d后，通过Transwell实验检测穿过滤膜的细胞数量，与阴性对照组穿过滤膜的细胞数量[(36.33±5.71)个]相比，实验组穿过滤膜的细胞数量明显减少[(16.32±4.07)个]，差异有显著性意义(P < 0.01)；阳性对照组穿过滤膜的细胞数量明显增加[(47.85±5.34)个]，差异有显著性意义(P < 0.01)。与阳性对照组相比，实验组穿过滤膜的细胞数量显著减少，差异有显著性意义(P < 0.01)。

参考文献

[1] Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 2002;418(6893):41-49.

[2] Kögler G, Sensken S, Airey JA, et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med. 2004;200(2):123-135.

[3] Zvaifler NJ, Marinova-Mutafchieva L, Adams G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res. 2000;2(6):477-488.

[4] Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, et al. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp Hematol. 2002; 30(8):896-904.

[5] Gregory CA, Gunn WG, Peister A, et al. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction.Anal Biochem. 2004;329(1):77-84.

[6] Hayashi O, Katsube Y, Hirose M, et al. Comparison of osteogenic ability of rat mesenchymal stem cells from bone marrow, periosteum, and adipose tissue. Calcif Tissue Int. 2008;82(3):238-247.

[7] Planat-Benard V, Silvestre JS, Cousin B, et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 2004;109(5):656-663.

[8] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.Tissue Eng. 2001;7(2):211-228.

[9] Safford KM, Safford SD, Gimble JM, et al. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. Exp Neurol. 2004;187(2):319-328.

[10] Dhar S, Yoon ES, Kachgal S, et al. Long-term maintenance of neuronally differentiated human adipose tissue-derived stem cells. Tissue Eng. 2007;13(11):2625-2632.

[11] Safford KM, Hicok KC, Safford SD, et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294(2):371-379.

[12] Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999;284(5411):143-147.

[13] Kamishina H, Farese JP, Storm JA, et al. The frequency, growth kinetics, and osteogenic/adipogenic differentiation properties of canine bone marrow stromal cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2008;44(10): 472-479.

[14] Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 2007; 25(6):1384-1392.

[15] Yamaguchi S, Kuroda S, Kobayashi H, et al. The effects of neuronal induction on gene expression profile in bone marrow stromal cells (BMSC)--a preliminary study using microarray analysis. Brain Res. 2006;1087(1):15-27.

[16] Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 1997;276(5309): 71-74.

[17] Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol. 1976;4(5): 267-274.

[18] Castro-Malaspina H, Gay RE, Resnick G, et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood. 1980;56(2):289-301.

[19] Bab I, Ashton BA, Gazit D, et al. Kinetics and differentiation of marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo. J Cell Sci. 1986;84:139-151.

[20] Vellasamy S, Sandrasaigaran P, Vidyadaran S, et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells derived from human placenta tissue. World J Stem Cells. 2012;4(6):53-61.

[21] Wang CH, Cherng WJ, Yang NI, et al. Late-outgrowth endothelial cells attenuate intimal hyperplasia contributed by mesenchymal stem cells after vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008;28(1): 54-60.

[22] Loebinger MR, Kyrtatos PG, Turmaine M, et al. Magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells homing to pulmonary metastases using biocompatible magnetic nanoparticles. Cancer Res. 2009;69(23):8862-8867.

[23] Sasportas LS, Kasmieh R, Wakimoto H, et al. Assessment of therapeutic efficacy and fate of engineered human mesenchymal stem cells for cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(12): 4822-4827.

[24] Patel SA, Meyer JR, Greco SJ, et al. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 2010;184(10): 5885-5894.

[25] Menon LG, Picinich S, Koneru R, et al. Differential gene expression associated with migration of mesenchymal stem cells to conditioned medium from tumor cells or bone marrow cells. Stem Cells. 2007; 25(2):520-528.

[26] Studeny M, Marini FC, Champlin RE, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta delivery into tumors. Cancer Res. 2002;62(13):3603-3608.

[27] Bergfeld SA, DeClerck YA. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the tumor microenvironment. Cancer Metastasis Rev. 2010;29(2):249-261.

[28] Ishii G, Sangai T, Oda T, et al. Bone-marrow-derived myofibroblasts contribute to the cancer-induced stromal reaction. Biochem Biophys Res Commun. 2003;309(1):232-240.

[29] Nakamizo A, Marini F, Amano T, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas. Cancer Res. 2005;65(8): 3307-3318.

[30] Lu YR, Yuan Y, Wang XJ, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Biol Ther. 2008;7(2):245-251.

[31] Secchiero P, Zorzet S, Tripodo C, et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PLoS One. 2010;5(6):e11140.

[32] Zhu Y, Sun Z, Han Q, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 2009;23(5):925-933.

[33] Fukuchi Y, Nakajima H, Sugiyama D, et al. Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/ progenitor cell potential. Stem Cells. 2004;22(5): 649-658.

[34] Ilancheran S, Moodley Y, Manuelpillai U. Human fetal membranes: a source of stem cells for tissue regeneration and repair. Placenta. 2009;30(1):2-10.

[35] Pevsner-Fischer M, Levin S, Zipori D. The origins of mesenchymal stromal cell heterogeneity. Stem Cell Rev. 2011;7(3):560-568.

[36] 李鲁生,张涵,王成俊,等.骨髓间充质干细胞的分离方法和生物学特性[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(10):1869-1873.

[37] 韩立赤,胡静,戚孟春,等.密度梯度离心和贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨功能比较[J].现代口腔医学杂志,2005,19(3):287-290.

[38] 武海军,银和平,李树文,等.密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察[J].中华临床医师杂志:电子版,2012,6(22):7261-7269.

[39] 曾瑞霞,单伟,房艳,等.密度梯度离心法结合贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞[J].解剖科学进展,2012, 18(5):438-441.

[40] 张才龙,夏长所,蒋正尧.应用密度梯度离心和贴壁筛选法分离免骨髓间充质干细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(6):1181-1184.

[41] 徐金霞,李家锋,韩建国,等.大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究[J].中国医药科学,2012,2(9):37-39.

[42] 赵继学,王广义,张海玉,等.小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定[J].中国实验诊断学,2012,16(1): 11-13.

引言

材料方法

1.1 设计随机细胞学分组实验。

1.2 时间及地点于2014年2至7月在河南省人民医院实验室完成。

1.3 材料无菌条件下采集3名健康成人骨髓各 10 mL，年龄20-30岁。标本采集前均获得供者的知情同意，研究方案得到河南省人民医院伦理委员会批准。人前列腺癌肿瘤细胞株Du145釆购于上海酶研生物科技有限公司(产于USA)。

骨髓间充质干细胞干预前列腺癌细胞实验所用主要试剂及设备：超洁净实验操作台(苏州净化设备公司)；IX71倒置显微镜、090-135.001型荧光显微镜(日本Olympus公司)；0.22 μm针式滤菌器(美国Millipore公司)；EPICS-XL型流式细胞仪(Beckman Corlter公司)；无菌磷酸盐缓冲液(上海麦莎生物科技有限公司)；低糖培养基(美国Gibco公司)；标志物各抗体(BD公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclon公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 前列腺癌肿瘤细胞的培养将人前列腺癌肿瘤细胞株Du145细胞置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度细胞培养箱中孵育，倒置显微镜观察肿瘤细胞株的生长状态，及时更换细胞培养基，取对数生长期细胞进行三维培养以及其他相关实验。

1.4.2 人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定无菌条件下采集健康者骨髓各10 mL，置于含有肝素的EP管中，再加入等量的无菌磷酸盐缓冲液(含体积分数为2%胎牛血清)。细胞悬液于低温条件下，以2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，轻轻加入淋巴细胞分离液上层，以3 000 r/min离心15 min，取界面单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液润洗2次，以2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度约3.0×10⁶ L^-¹接种于培养瓶(含DMEM培养基+体积分数为10%胎牛血清)，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱培养2 d，0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，以细胞浓度约为3.0×10⁶ L^-¹接种进行传代。

1.4.3 骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定取第5代骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化，以1 500 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，分别加入CD45、CD14、CD29、CD34、CD105、CD73、CD90荧光标记抗体培养30 min，无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，40 g/L多聚甲醛溶液固定，流式细胞仪检测细胞表面标志物抗原表达。

1.4.4 骨髓间充质干细胞与前列腺癌Du145细胞共培养取第5代骨髓间充质干细胞与人前列腺癌肿瘤细胞株Du145细胞，分别接种于6孔板的Transwell上下两室中，上室骨髓间充质干细胞为2×10⁵个，下室前列腺癌Du145细胞为3×10⁵个。阳性对照组为人真皮成纤维细胞HDF-a细胞与人前列腺癌Du145细胞共培养，阴性对照组为野生型前列腺癌Du145细胞。

1.4.5 细胞侵袭实验培养3 d后，取对数生长期各组细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含牛血清白蛋白的培养基重新悬浮，计数后调整细胞浓度为2×10⁸ L^-¹。取0.2 μL细胞悬液接种于Transwell小室，于培养箱中培养48 h，40 g/L多聚甲醛固定2 h，然后用0.5%考马斯亮蓝染色20 min，显微镜观察和计数。

1.4.6 细胞增殖能力细胞克隆形成数是评价细胞增殖能力的重要指标，各组细胞培养3 d后，通过软琼脂克隆形成实验法检测细胞增殖能力。

1.4.7 细胞周期检测培养3 d后，取对数生长期各组细胞，0.25%胰酶消化，以2 000 r/min低温离心10 min，弃上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入预冷的无水乙醇，于4 ℃低温条件下固定24 h，以2 000 r/min低温离心10 min，弃上清液，用1 mL无菌磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，再加入含碘化丙啶50 mg/L、RNA酶A 100 mg/L、0.2%Triton X-100的磷酸盐缓冲液0.5 mL，避光于4 ℃低温条件下培养30 min。按照流式细胞仪检测程序检测各组细胞周期。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态及标志物鉴定。②共培养前列腺癌Du145细胞周期、细胞增殖、细胞侵袭能力。

1.6 统计学分析实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较釆用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞自身增殖能力强、分化范围广，具有免疫调节和修复损伤组织等功能，且不涉及伦理道德方面的问题。此外，它们还具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，骨髓间充质干细胞已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破。国内外研究显示，间充质干细胞具有抑制癌细胞生长、侵袭和转移的能力^[20]，在炎症或损伤组织中，间充质干细胞会迁移到特定组织^[21-26]。越来越多的证据表明，骨髓间充质干细胞在癌症治疗中具有明显的优势^[27-32]。骨髓间充质干细胞的分离方法众多，目前为止尚未发现一个特定的细胞标记可以鉴定骨髓间充质干细胞，而且骨髓间充质干细胞在不同的生长时期和不同的生长条件下具有较大的差异。骨髓间充质干细胞低密度培养在添加表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中。结果显示，骨髓间充质干细胞在无血清的基础培养基中培养时表达nestin和胶原纤维酸性蛋白的细胞数量明显增多，同时Oct4、SOX2、klf4和c-myc等基因的表达也明显上调。去除血清后导致了整个细胞群体的增殖显著降低，尽管在这一过程中细胞会坏死、凋亡，但是还是有一小部分细胞存活下来，并且在重新添加血清后它们又开始增殖。

实验成功利用密度梯度离心法从健康成年人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞^[33-42]，骨髓间充质干细胞完全贴壁生长，呈现出三角形或长梭形、多边形等多种形态，细胞内折光性强，颗粒不明显，细胞标记物CD29、CD73、CD90、CD105呈阳性表达，CD14、CD34、CD45呈阴性表达。

实验分为3组，分别为阳性对照组、阴性对照组及实验组。阳性对照组为人真皮成纤维细胞HDF-a细胞与人前列腺癌Du145细胞共培养，阴性对照组为野生型前列腺癌Du145细胞，实验组接种骨髓间充质干细胞与人前列腺癌Du145细胞共培养。流式细胞仪检测细胞周期：与阴性对照组相比，实验组G₂/M+S期细胞比例明显减少，阳性对照组G₂/M+S期细胞比例明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力：与阴性对照组相比，实验组克隆形成率明显缩短，阳性对照组克隆形成率明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。Transwell实验检测细胞穿过滤膜的细胞数量：与阴性对照组相比，实验组穿过滤膜的细胞数量明显减少，阳性对照组穿过滤膜的细胞数量明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。

通过骨髓间充质干细胞与人前列腺癌Du145细胞的体外共培养实验显示，骨髓间充质干细胞通过缩短前列腺癌Du145细胞G₂/M+S期，抑制前列腺癌Du145细胞的增殖和侵袭能力，为临床前列腺癌的治疗提供新的思路和方法，但其作用机制还需要进行后续实验进行探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程