低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.002

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (14): 1989-1998.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.002

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低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

张优¹，严卫亚²，沈振亚²，杨君杰³，惠杰¹

苏州大学附属第一医院，1心内科，2心外科，江苏省苏州市 215000；3苏州大学心血管病研究所，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2016-02-08 出版日期:2016-04-01 发布日期:2016-04-01
通讯作者: Corresponding author: Hui Jie, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Corresponding author: Yang Jun-jie, M.D., Associate professor, Institute of Cardiovascular Disease, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China
作者简介:张优，男，1990年生，江苏省徐州市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事心血管病临床研究。并列第一作者：严卫亚，男，1987年生，江苏省盐城市人，汉族，2015年苏州大学毕业，硕士，主要从事心血管病临床研究。

Hypoxic preconditioning inhibits apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells through overexpressing Pim-1

Zhang You¹, Yan Wei-ya², Shen Zheng-ya², Yang Jun-jie³, Hui Jie¹

1Department of Cardiology, 2Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 3Institute of Cardiovascular Disease, Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2016-02-08 Online:2016-04-01 Published:2016-04-01
Contact: 惠杰，教授，博士生导师，苏州大学附属第一医院心内科，江苏省苏州市 215000 并列通讯作者：杨君杰，博士，副教授，苏州大学心血管病研究所，江苏省苏州市 215000
About author:Zhang You, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Yan Wei-ya, Master, Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Zhaog You and Yan Wei-ya contributed to equally this work.

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

低氧预处理：低氧预处理能激活细胞内的一些保护机制，增强干细胞的抗凋亡和旁分泌功能，促进干细胞的存活和新生血管形成，从而进一步促进组织修复和功能恢复，提高干细胞移植效果，且无致肿瘤形成风险。

Pim-1：最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现，Pim家族还包括另外2个成员，即Pim-2和Pim-3，它们都包含一个被称为ATP锚的活化位点。Pim-1基因产物属于钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶，并在多种细胞组织进化过程中高度保守。Pim-1基因在细胞增殖、分化、凋亡等许多生理病理中起重要作用，此外发现其在心肌梗死局部区域表达明显提高，抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡及心室重构。

背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低，而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖，促进其存活。

目的：探讨Pim-1激酶是否介导缺氧预处理对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。

方法：设置不同低氧处理时间(0，6，12，24 h)处理骨髓间充质干细胞，RT-qPCR及Western blot检测 Pim-1及凋亡相关基因的表达，确定最佳低氧处理时间为12 h。将骨髓间充质干细胞分为3组：正常对照组、低氧组、低氧+Pim-1抑制剂组，分别进行Transwell迁移实验、细胞凋亡流式检测、线粒体膜电位检测评估各组骨髓间充质干细胞的迁移能力及抗凋亡能力；建立心肌梗死模型，1周后按分组在大鼠梗死心肌周围多点注射骨髓间充质干细胞，2周后制备心肌冰冻切片行DiI染色统计骨髓间充质干细胞存活数量；心肌梗死模型建立前后、细胞移植4周行超声心动图检查评估大鼠心脏功能。

结果与结论：①低氧处理12 h时，骨髓间充质干细胞的 Pim-1、p-Akt及Bcl-2 表达量明显升高，Bax、Caspase-3表达量明显降低。②低氧组骨髓间充质干细胞抗凋亡能力明显增强，与正常对照组之间差异有显著性意义(P < 0.01)。③低氧组骨髓间充质干细胞移植1周后存活率明显提高(P < 0.001)；移植4周后，大鼠心功能明显改善(P < 0.05)。上述获益可被Pim-1抑制剂抑制。④结果证实，低氧预处理骨髓间充质干细胞通过激活Akt及上调Pim-1表达抑制细胞凋亡，改善骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病的治疗效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-3721-0971(惠杰)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 低氧, 凋亡, 骨髓间充质干细胞, Pim-1, Akt, 心肌梗死

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have a low survival rate after implanted into the ischemic myocardium. However, hypoxia preconditioning (HPC) may enhance bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and promote its survival rate.
OBJECTIVE: To explore whether Pim-1 is involved in HPC protecting against apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells and the relevant mechanism.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were respectively subjected to HPC for 0, 6, 12, and 24 hours. The expression of Pim-1 and apoptosis-related genes were detected by RT-qPCR and western blot. Then, the best hypoxic preconditioning time was determined as 12 hours. Then, bone marrow mesenchymal stem cells were assigned to one of the following groups: control (without HPC), 12-hour HPC, 12-hour HPC+Pim-1 inhibitor groups. Flow cytometry analysis was used to detect the cell apoptosis, Transwell assay to analyze the cell migration ability in each group, and JC-1 kit to detect mitochondrial membrane potential. Animal models of myocardial infarction were established. One week after modeling, bone marrow mesenchymal stem cells were given via multi-point injection around the infarct zone of rats. Two weeks after modeling, heart tissues of rats were taken and sliced followed by DiI staining to calculate the survival rate of bone marrow mesenchymal stem cells. Additionally, rat cardiac function was assessed by echocardiography prior to and after modeling as well as at 4 weeks after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: At 12 hours after HPC, the expression of Pim-1, p-Akt and Bcl-2 gene in the infarct region was significantly increased, but the expression of caspase-3 and Bax was significantly decreased. Compared with the control group, cell viability in the 12-hour HPC group was increased very significantly at 1 week after cell transplantation (P < 0.001), the migration and anti-apoptosis ability were enhanced significantly (P < 0.01) and the cardiac function of rats was significantly improved in the 12-hour HPC group (P < 0.05). All of these protective effects were blocked by the Pim-1 inhibitor. These findings indicate that HPC can protect bone marrow mesenchymal stem cells from apoptosis through activating Akt and up-regulating Pim-1, and thereby improve the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on ischemic heart diseases.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Hypoxia, Apoptosis, Myocardial Infarction, Tissue Engineering

张优，严卫亚，沈振亚，杨君杰，惠杰. 低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 1989-1998.

Zhang You, Yan Wei-ya, Shen Zheng-ya, Yang Jun-jie, Hui Jie. Hypoxic preconditioning inhibits apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells through overexpressing Pim-1[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(14): 1989-1998.

图/表（结果） 13

2.1 骨髓间充质干细胞培养、扩增和鉴定原代培养24 h后有少量细胞贴壁，呈短梭形，椭圆形，三角形等。5-7 d后可见集落形成，呈漩涡状。传代后细胞形态趋于一致，以长梭形多见。流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表面标记，CD34、CD45表达阴性，CD29、CD90表达阳性。

2.2 RT-PCR检测Pim-1及凋亡相关基因在低氧条件下的表达随着低氧处理时间的延长，Pim-1表达量在低氧处理12 h最高，Bax表达量最低，与其他组比较差异均有显著性意义(图1)；低氧处理12 h时，骨髓间充质干细胞的Bcl-2表达量明显升高，Caspase-3明显降低(图2)，与低氧处理24 h组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，与低氧处理0 h组及低氧处理6 h组比较差异均有显著性意义。

2.3 Western blot检测Pim-1及其上游Akt激酶在低氧条件下的表达 Western blot结果见图3，统计分析灰度值后，可见Pim-1及p-Akt在不同低氧时间下变化趋势一致，均在低氧处理12 h时表达量最高，与其他组之间差异有显著性意义(图4)；低氧不影响骨髓间充质干细胞t-Akt的表达(P > 0.05)。

2.4 不同条件下骨髓间充质干细胞迁移功能的变化低氧处理12 h组骨髓间充质干细胞迁移细胞数量明显多于正常对照组(P < 0.01)，且增强的迁移功能可部分被Pim-1抑制剂所抑制(P < 0.05)，见图5，6。

2.5 不同条件下骨髓间充质干细胞的凋亡率低氧 12 h组骨髓间充质干细胞的凋亡率明显少于正常对照组和低氧12 h+Pim-1抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而低氧12 h+Pim-1抑制剂组和正常对照组之间细胞凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7，8。

2.6 不同条件下线粒体膜电位变化情况由图9，10可见，阳性对照组细胞全部呈绿色荧光，低氧12 h组骨髓间充质干细胞红色荧光较正常对照组及低氧12 h+ Pim-1抑制剂组明显增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；低氧12 h+Pim-1抑制剂组与正常对照组骨髓间充质干细胞存活数量差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.7 各组骨髓间充质干细胞移植后成活率骨髓间充质干细胞移植至梗死心肌周围1周后，制作心肌冰冻切片、染色(每组取6张切片，每张取1个视野)，计算骨髓间充质干细胞的成活数；统计分析结果如图11，12所示，低氧12 h组存活细胞明显多于正常对照组及低氧12 h+ Pim-1抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.001)，而低氧12 h+Pim-1抑制剂组与正常对照组细胞存活数量差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.8 心肌梗死模型建立及骨髓间充质干细胞移植前后超声心动图改变如表1所示，造模前及造模后各组射血分数值差异无显著性意义(P > 0.05)；而干细胞移植后4周低氧12 h组大鼠射血分数值明显增加，与其他两组之间差异有显著性意义(P < 0.05)；各组之间左室舒张末期内径、左室收缩末期内径差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计分子水平、细胞水平体外观察及随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年10月在苏州大学附属第一医院心血管病研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄SD大鼠数只，雌雄不限，体质量80 g左右，用于提取骨髓间充质干细胞；雌性SD大鼠30只，6-8周龄，体质量300-350 g，用于体内实验，均由苏州大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(苏) 2011-0005。所有动物的喂养、观察、操作均按照非临床研究管理规范规定执行。

1.3.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，2-巯基乙醇(美国Amresco公司)，Quercetagetin(美国Callbiochem公司)，DAPI染色液、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、β-actin/ GAPDH羊抗鼠多克隆抗体、辣根酶标记山羊抗鼠IgG抗体(中国碧云天生物技术研究所)，DiI染色液、PureLink^TM RNA Mini Kit(美国Invitrign公司)，Anti-rat Pim-1抗体(美国Santa Cruz公司)，Anti-rat t-Akt抗体、Anti-rat p-Akt抗体(美国Signaling公司)，垂直流洁净工作台YJ-1450B(苏州宏伟净化设备有限公司)，倒置荧光显微镜、倒置光学显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪FACS Caliber(美国BD公司)，37 ℃恒温细胞培养箱HERA cell 150(德国Heaaeus公司)，心脏超声诊断仪(美国GE公司)，TKY-BMB型石蜡包埋机(湖北泰康医疗设备有限公司)，Stepone Plus 荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，凝胶成像仪(美国Thermo公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、体外扩增及鉴定 SD大鼠颈椎脱臼法处死，体积分数为75%乙醇全身浸泡10 min。无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，置于一个预先加入DMEM培养基的培养皿中，去除两端骨骺，以无血清培养基反复冲洗骨髓腔至骨髓腔发白，收集骨髓悬液，4 ℃离心(1 500 r/min×5 min)，弃上清液，加入培养基(L-DMEM、体积分数为10%胎牛血清、5%青/链霉素)吹打成悬液，接种于培养皿中，24 h后首次半量换液，以后每隔3 d换液1次，并按1∶2比例传代。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化和扩增。应用流式细胞仪检测大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达进行鉴定^[20]。以下实验用第3-5代骨髓间充质干细胞。

1.4.2 RT-PCR检测Pim-1及凋亡相关基因表达设置不同低氧处理时间(0，6，12，24 h)处理骨髓间充质干细胞，即用低氧培养箱模拟低氧环境(体积分数为1%氧气、体积分数为5%二氧化碳、体积分数为94%氮气)，在0，12，18 h时分别将骨髓间充质干细胞放入低氧培养箱，24 h后取出，其分别表示低氧处理24，12，6 h，低氧0 h表示未低氧处理细胞。RNA的抽提由RNA抽提试剂盒(PureLink^TM RNA Mini Kit)完成，以18 S为内参照，按说明书建立20 μL反应体系进行反转录，然后进行荧光定量PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，共进行40个循环。扩增结束后，以目的基因β-actin、Pim-1、bcl-2、caspase-3、bax表达的相对定量值进行统计学分析。

用primer 5.0软件设计引物序列如下：β-actin 上游：5’-CCA CCA TGT ACC CAG GCA TT-3’，下游：5’-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC-3’；Pim-1上游：5’-CCG TGG ATG CAG GAT GTT CT-3’，下游：5’-AGC TCT CTC TTC CCT GGA GG-3’；Caspase-3上游：5’-CAC ACG GGA CTT GGA AAG CA-3’，下游：5’-GAG AGC CAG CGA TGA CTC AG-3’；bax上游：5’-CAT CAT GGG CTG GAC ACT GG-3’，下游： 5’ -GTG AGT GAG GCA GTG AGG AC-3’。

1.4.3 Western blot检测Pim-1及Akt蛋白表达设置不同时间段(0，6，12，24 h)低氧处理骨髓间充质干细胞，并在6，12，24 h设置Pim-1抑制剂处理组，分别收集各组细胞，裂解液提取蛋白，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转染至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入羊抗鼠Pim-1/t-Akt/p-Akt抗体(1∶100-1∶1 000)结合，洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶1 000)结合，再次洗膜后加入Western blot显影液曝光，分析灰度值。

1.4.4 实验分组根据RT-PCR检测结果，确定最佳低氧处理时间为12 h，然后将骨髓间充质干细胞分为正常对照组、低氧12 h组及低氧12 h+Pim-1抑制剂组。低氧12 h+Pim-1抑制剂组在低氧处理前，给予细胞换液，向细胞培养基中加入一定量Pim-1抑制剂六羟黄酮(Quercetagetin)，使其维持在工作浓度(10 μmol/L)，随后进行低氧处理。

1.4.5 Transwell迁移实验收集3组骨髓间充质干细胞，消化、计数，L-DMEM重悬并调整细胞浓度为1×10⁸L^-¹备用；将Transwell小室(膜的微孔直径为8 μm)放入培养板中，在培养板中加入500 μL含有10%胎牛血清的培养基，小室加入200 μL备用细胞悬液，培养箱中培养4 h，弃培养基，去除小室及室壁表面多余细胞，小室置于多聚甲醛固定5 min，PBS洗2遍，DAPI染色液暗室染色15 min，荧光显微镜观察。

1.4.6 Annexin V-FITC流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的凋亡准备1×Annexin V稀释液，准备100 mg/L的PI工作液，消化离心3组骨髓间充质干细胞，Annexin V稀释液重悬细胞，计数调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，每100 μL细胞悬液加入2 μL Annexin V稀释液+1 μL PI工作液并充分混匀，室温放置15 min后，加入400 μL× Annexin V稀释液，冰上放置，流式细胞检测仪检测。

1.4.7 细胞线粒体膜电位检测(JC-1) 将骨髓间充质干细胞分为4组：阳性对照组、正常对照组、低氧12 h组、低氧12 h+Pim-1抑制剂组；将碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP) (1∶1 000)加入阳性对照组细胞培养基中处理 20 min，使细胞线粒体膜电位全丧失(呈绿色荧光)；取50 μL JC-1(200 ×)加入8 mL超纯水中，剧烈振荡混匀后加入2 mL JC-1染色缓冲液(5×)混匀即为JC-1染色工作液；去除24孔板中细胞培养基，PBS洗1次，加入250 μL细胞培养液，加入250 μL JC-1染色工作液，混匀后培养箱中孵育20 min；蒸馏水稀释JC-染色缓冲液至1×，孵育结束后，去除培养基，用1×JC-1缓冲液清洗细胞2次，置于冰上，荧光显微镜下观察。

1.4.8 大鼠心肌梗死模型建立取体质量300-350 g SD雄性大鼠，10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔麻醉，呼吸机正压辅助呼吸；于大鼠左侧第4肋间横切口开胸，暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1.0-2.0 mm处用5.0无损伤线结扎左冠脉前降支，造成心肌梗死^[21]。筛选成功心肌梗死模型大鼠24只，随机分成3组，正常对照组、低氧12 h组、低氧12 h+Pim-1抑制剂组，每组8只。

1.4.9 DiI染色液细胞标记用Hank’s按1∶1 000稀释CM-DiI原液(1 g/L)，分别将正常对照组、低氧12 h组、低氧12 h+Pim-1抑制剂组细胞消化计数重悬至浓度为1×10⁸ L^-¹，将CM-DiI稀释液和细胞悬液按照1∶8混匀，培养箱培养5 min，然后4 ℃放置15 min，PBS清洗并重悬至细胞浓度1×10⁹ L^-¹，冰上放置。

1.4.10 心肌内细胞注射 1周后再次开胸，直视下于梗死心肌周围用微量注射器分4点(各个点相距90°)分别注射各组骨髓间充质干细胞，关胸，维持辅助呼吸至自主呼吸恢复，送回笼中精心饲养。

1.4.11 大鼠超声心动图检查心肌梗死模型建立前后、细胞移植后4周(每组剩余5只)分别用水合氯醛腹腔注射麻醉、左侧胸部备皮，用15 MHz探头行超声心动图检查，主要测量左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVEDs)及左室射血分数(LVEF)，测量至少重复3个心动周期，取平均值。

1.4.12 心肌冰冻切片制备及染色心肌内细胞注射1周后，每组随机抽取3只，麻醉后开胸取心脏，肝素水冲洗心脏后置于体积分数为4%甲醛溶液中固定24 h，修剪心脏，保留结扎线至心尖部心肌组织，10%蔗糖溶液中浸泡24 h，取出心脏，O.C.T.Compound包埋剂包埋心肌组织，-20 ℃冰箱中冻存，第2天取出冰冻的心肌组织在石蜡切片机中切片；将制备好的心肌组织切片置于多聚甲醛中浸泡20 min，PBS清洗×3，每次5 min，取出晾干，用含有DAPI的封固液30 μL封固，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①不同低氧时间处理后骨髓间充质干细胞中Pim-1、凋亡相关基因及Akt表达变化。②Transwell迁移实验、Annexin V-FITC凋亡实验、JC-1实验分别观察各组细胞迁移功能、凋亡率及细胞线粒体膜电位变化。③心肌组织切片染色观察各组细胞移植后的存活情况。④心脏超声观察心肌梗死及细胞移植后大鼠心功能变化。

1.6 统计学分析由第一作者应用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以x(_)±s表示，组间比较，方差齐采用 One Way ANOVA，方差不齐采用多组独立样本的秩和检验，两两组间比较采用Least Significant Difference Test及Bonfferoni法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，骨髓间充质干细胞移植作为急性心肌梗死的新疗法为其带来了一片曙光，然而移植后骨髓间充质干细胞的存活率低成为人们面临的困难和挑战；Qu等^[22]研究发现，心肌梗死后局部恶劣的微环境，包括缺血、缺氧以及强烈的炎症反应，导致移植干细胞大量凋亡。骨髓间充质干细胞移植前预处理是目前提高其移植后成活率和改善治疗效果的主要方式。近年来，有研究证明，适当的低氧(0.1%-3%)可通过诱导HIF-1α表达抑制骨髓间充质干细胞的自噬作用而增强细胞的存活能力，改善其治疗作用^[23]；实验结果发现，低氧预处理可通过激活Akt/Pim-1信号通路抑制骨髓间充质干细胞凋亡，提高移植后存活率，并能进一步提高骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死的治疗效果。

Pim-1和Akt均为细胞程序性死亡的相关蛋白激酶，Pim-1作为Akt信号通路下游基因已被证实可通过各种途径保护心脏^[16^，²⁴^，^16]；Akt是一种影响多种细胞新陈代谢、细胞周期、细胞生长和凋亡的信号激酶^[25-26]，其可通过上调Pim-1表达发挥心脏保护作用，抑制急性心肌梗死后心肌细胞凋亡、心脏重塑，保护心脏结构，改善心脏功能^[16-17^，^27-28]。在骨髓间充质干细胞中，Pim-1已被证实可联合血清信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖^[29]；实验首次发现，低氧预处理可促进骨髓间充质干细胞中Pim-1和p-Akt的表达，并且两者的表达均呈时间依赖性、且趋势相同；进一步研究发现，低氧可调节Bcl-2家族表达，促进抗凋亡因子Bcl-2表达，抑制促凋亡因子Bax的表达；此外，低氧还可降低细胞质中凋亡蛋白酶Caspase-3的水平，减轻线粒体损伤，抑制细胞凋亡。
线粒体是细胞凋亡发生的核心^[30]，也被认为是急性心肌梗死后心脏保护的重要靶点^[15，31]。受到压力信号刺激后，线粒体将在形态上发生剧烈的变化并释放一些促凋亡因子(如细胞色素C)，最终Caspase级联引起细胞凋亡^[32]；而此类凋亡途径受到Bcl-2家族蛋白调节，Bcl-2家族蛋白被激活后，促凋亡因子Bax和Bak被释放到线粒体膜外，触发线粒体膜外透明化(MOMP)，释放细胞色素C^[32]；因此，线粒体膜的稳定性主要由Bcl-2家族蛋白决定。Pim-1是JAK/STAT和Akt信号通路的下游基因^[16，33]，它能够调节Bcl-2家族基因增强细胞生存能力^[34-35]；Pim-1既促进抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL的表达，又能够抑制促凋亡因子Bax/Bak凋亡的表达和释放，从而保护线粒体完整性，抑制细胞凋亡^[36]；此外，实验研究发现，在细胞质中，Bcl-2可直接干预Bak，抑制其释放到线粒体中^[37]；实验结果发现，低氧预处理后，骨髓间充质干细胞中Pim-1表达呈时间依赖性，其趋势与Bcl-2相同而与Bax相反，与既往研究结果一致。Akt亦可通过保护心肌细胞线粒体完整性、抑制细胞凋亡，发挥保护心脏作用^[38-39]；除了调节Bcl-2家族基因之外，Akt还可通过抑制GSK-3β或促进已糖激酶的表达等途径保护线粒体完整性，发挥心脏的保护作用^[21]。然而，低氧及Pim-1抑制剂共同处理后的骨髓间充质干细胞抗凋亡能力与正常对照组无差异(P > 0.05)，表明Akt是通过诱导Pim-1的表达发挥细胞保护作用，与既往研究一致^[14-16^，^40-41]。

Akt/Pim-1可诱导Bcl-2的表达，Bcl-2除了通过抑制Bcl-2家族之外，还可通过调节线粒体膜电位阻止细胞色素C的释放^[42]。线粒体膜电位的下降被认为是细胞早期不可逆凋亡事件^[43]。线粒体膜电位的下降可以促进细胞色素C的释放，从而促进其下游Caspase的激活，从而刺激凋亡的细胞死亡。实验结果表明低氧12 h组骨髓间充质干细胞中Pim-1及Bcl-2表达较对照组明显升高、Caspase表达明显降低，且JC-1检测提示低氧预处理可延缓骨髓间充质干细胞膜电位下降；故推测细胞色素C与Pim-1必存在相关性，有待于进一步研究。此外，还有研究证实，Pim-1可通过阻止线粒体裂解蛋白移位保护线粒体完整性，抑制细胞凋亡^[44]。

低氧预处理可增强骨髓间充质干细胞的迁移能力^[45-50]，其机制被广泛研究；目前已证实低氧可通过KV2.1通道和FAK激酶激活^[45]、RhoA信号通路激活^[46-47]、诱导HIF-1α^[47-48]、改变整合素表达^[49]、激活SDF-1/CXCR4通路等途径提高骨髓间充质干细胞的迁移能力^[50]；通过迁移实验发现低氧预处理后可增强骨髓间充质干细胞的迁移能力，然而低氧12 h+Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞迁移能力并未明显改变，与对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，这说明Pim-1在低氧增强骨髓间充质干细胞的迁移能力中起着重要作用，其可能通过与上述骨髓间充质干细胞迁移机制之间相互作用共同发挥调节骨髓间充质干细胞的迁移。

实验观察了正常对照组、低氧12 h组及低氧12 h+ Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的效果及移植1周后心肌中骨髓间充质干细胞的存活状况，发现低氧预处理组骨髓间充质干细胞移植4周后存活率最高，心功能较其他两组明显改善；而低氧12 h+ Pim-1抑制剂组骨髓间充质干细胞存活率及大鼠心功能均较对照组无明显差异，进一步证明低氧可上调Pim-1表达进而抑制骨髓间充质干细胞凋亡，改善移植后治疗急性心肌梗死的效果。
总之，低氧预处理可激活骨髓间充质干细胞的Akt/Pim-1信号通路，保护线粒体完整性，促进骨髓间充质干细胞迁移，抑制骨髓间充质干细胞凋亡，进一步改善骨髓间充质干细胞移植后大鼠心功能；丰富了对低氧预处理后骨髓间充质干细胞功能改变的理论，对骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死提供指导意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

Hypoxic preconditioning inhibits apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells through overexpressing Pim-1

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