立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

神经干细胞的治疗作用：①细胞替代：补充缺失神经元和胶质细胞，促进神经环路重建。②递质补充：分泌多巴胺递质。③营养支持：分泌多种神经营养因子，改善局部微环境并启动再生相关基因的表达，完成神经修复。④细胞动员：脑室室管膜下区细胞、海马结构部位内源性干细胞增生。⑤结构整合：整合到宿主移植部位，实现真正神经再生。

立体定向技术：在立体定向仪的引导下，将特制的射频电极、干细胞针等手术器械准确送到颅内的特定部位或靶点，成为治疗疾病或诊断疾病的一种方式。现代立体定向技术是在传统立体定向技术的基础上，借助于先进的CT、MRI图像融合技术和立体定向图谱匹配系统进行定位治疗的一种崭新的技术，使治疗更安全更有效。

背景：细胞替代治疗是重建受损神经系统组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略，具有极为广阔的应用前景。

目的：探讨立体定向脑内移植神经干细胞对颅脑损伤大鼠神经运动功能的影响。

方法：将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只，应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，伤后1 d研究组大鼠脑实质内移植胚胎神经干细胞，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。在脑损伤前1 d、伤后1 d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能。移植后2周，取脑组织分别行苏木精-伊红染色、抗BrdU、胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶免疫组化染色。

结果与结论：伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P < 0.05)。研究组大鼠受损脑组织中有较多的BrdU阳性神经干细胞，一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶阳性表达，对照组大鼠受损脑组织中未见有BrdU阳性细胞。实验结果表明，立体定向脑内移植神经干细胞可以在颅脑损伤灶中增殖分化，进而显著改善大鼠的神经运动功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-2828-950X(刁新峰)

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 立体定向脑内移植, 颅脑损伤, 增殖, 分化

Abstract:

BACKGROUND: Cell replacement therapy as an effective strategy for reconstruction of the central nervous system has very broad application prospects.
OBJECTIVE: To investigate the effect of stereotactic transplantation of neural stem cells into the brain on the neuromotor function of craniocerebral trauma rats.
METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into study and control groups. Animal models of craniocerebral trauma were made using the improved free-fall method in the rats. Then, model rats in the study and control groups were given parenchymal transplantation of embryonic neural stem cells and the same volume of culture medium with no stem cells at 1 day after injury, respectively. Neuromotor function of rats was assessed based on the neurological severity scores. At 2 weeks after transplantation, brain tissues were taken for hematoxylin-eosin staining, anti-BrdU, glial fibrillary acidic protein, β-tubulin III and tyrosine hydroxylase immunohistochemistry staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The neurological severity scores in the study group were significantly lower than those in the control group at 1 and 2 weeks after injury (P < 0.05). In the study group, there were many BrdU-positive neural stem cells in the brain tissues, some of which were positive for glial fibrillary acidic protein, β-tubulin III and tyrosine hydroxylase; while in the control group, there was no BrdU-positive cell in the brain tissues. Experimental findings show that neural stem cells stereotactically transplanted into the brain can proliferate and differentiate in the brain lesion, and thereby notably improve the neuromotor function of rats with craniocerebral trauma.

刁新峰，程立敏，薛咏，胡成旺，蔡中立. 立体定向脑内移植神经干细胞改善颅脑损伤大鼠的神经运动功能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1446-1451.

Diao Xin-feng, Cheng Li-min, Xue Yong, Hu Cheng-wang, Cai Zhong-li. Stereotactic transplantation of neural stem cells into the brain improves motor function of craniocerebral trauma rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1446-1451.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] 高伟东,李晓冬.胚胎神经干细胞对脑损伤治疗作用的实验研究[J].解剖学研究,2010,32(1):39-42.

[2] 韩志桐,苏宁,吴日乐,等.GFP 转基因小鼠神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病的实验研究[J].临床神经外科杂志, 2012,9(3):139-142.

[3] 杨忠旭,张颖,历俊华,等.神经干细胞移植治疗颞叶癫痫的近期效果研究[J].中国神经外科疾病研究杂志,2010,9(4): 304-307.

[4] 牛光清,郭镔容,常晓燕,等.神经干细胞移植治疗脑梗死后遗症临床分析[J].中国医药,2010,5(7):615-616.

[5] 温慧娟.护理路径在重型颅脑外伤患者急救中的应用[J].护理实践与研究,2011,8(16):45-46.

[6] 陈涛,田增民,尹丰,等.神经干细胞移植治疗帕金森病的临床研究[J].中国微侵袭神经外科杂志,2012,17(10): 452-453.

[7] 邱英,邢智伟,曹冉华,等.神经干细胞治疗难治性癫痫临床研究[J].内蒙古医学院学报,2010,34(5):387-391.

[8] 张化明,杨海,马江红,等.神经干细胞移植并手术治疗重型颅脑损伤的疗效分析[J].中国实用神经疾病杂志,2013, 16(13):52-53.

[9] 马兴才.手术治疗73 例重症颅脑外伤的临床研究[J].中国中医药咨询,2011,3(16):421-422.

[10] 包晓群,宋亚彬,李松涛,等.神经干细胞移植治疗帕金森病[J].中国老年学杂志,2013,33(8):3591-3592.

[11] 杨春,周辉,白琳琳,等.神经干细胞移植对阿尔茨海默病大鼠海马突触素表达和学习记忆能力的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(10):1803-1807.

[12] 娄永利.神经干细胞移植治疗脊髓损伤的临床研究[J].中外医疗,2012,31(2):22.

[13] 姜颢,张连东,葛燕萍,等.无框架立体定向钻孔引流术治疗高血压性脑出血并发症的临床分析[J].中国急救医学, 2010,30(6):537-539.

[14] 吴长山,郭志强.28 例双额叶挫裂伤手术干预及预后分析[J].中外医学研究,2012,10(21):114-115.

[15] 常志田,郭丹.神经干细胞脑内移植治疗中枢神经损伤21例临床观察[J].中国医药导刊,2010,12(5):891.

[16] 谭德瑜,潘淳,黎浩然.弥漫性轴索损伤52例临床分析[J].广西医科大学学报,2013,30(4):631-632.

[17] 黄旅黔,龚明,王忠安,等.立体定向联合显微手术治疗丘脑高血压脑出血临床预后分析[J].中华神经医学杂志,2012, 11(8)815-818.

[18] 孔令霞,常永霞,许津莉.肌内注射神经生长因子联合早期干预对缺血缺氧脑病的疗效研究[J].河北医药,2014, 36(2):185-186.

[19] 王鹏,邢红伟,周志武.脑外伤致持续性植物状态的催醒治疗研究进展[J].疑难病杂志,2014,13(1):99-101,107.

[20] 路丕周,张维涛,张剑宁,等.微侵袭立体定向引导颅内小病灶手术治疗60例[J].陕西医学杂志,2013,42(5): 549-550.

[21] Cooper DJ, Rosenfeld JV, Murray L, et al. Decompressive craniectomy in diffuse traumatic brain injury. N Engl J Med. 2011;364(16):1493-1502.

[22] Gempt J, Buchmann N, Ryang YM, et al. Frameless image-guided stereotaxy with real-time visual feedback for brain biopsy. Acta Neurochir (Wien). 2012;154(9): 1663-1667.

[23] Leibson CL, Brown AW, Hall Long K, et al. Medical care costs associated with traumatic brain injury over the full spectrum of disease: a controlled population-based study.J Neurotrauma. 2012;29(11): 2038-2049.

[24] Waldau B, Hattiangady B, Kuruba R, et al. Medial ganglionic eminence-derived neural stem cell grafts ease spontaneous seizures and restore GDNF expression in a rat model of chronic temporal lobe epilepsy. Stem Cells. 2010;28(7):1153-1164.

[25] Chen X, Xu BN, Meng X, et al. Dual-room 1.5-T intraoperative magnetic resonance imaging suite with a movable magnet: implementation and preliminary experience. Neurosurg Rev. 2012;35(1):95-109.

[26] Lowry N, Goderie SK, Adamo M, et al. Multipotent embryonic spinal cord stem cells expanded by endothelial factors and Shh/RA promote functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 2008; 209(2):510-522.

[27] Wang F, Zhu Y. The interaction of Nogo-66 receptor with Nogo-p4 inhibits the neuronal differentiation of neural stem cells. Neuroscience. 2008;151(1):74-81.

[28] Brenneman MM, Wagner SJ, Cheatwood JL, et al. Nogo-A inhibition induces recovery from neglect in rats. Behav Brain Res. 2008;187(2):262-272.

[29] Guo X, Guo Y. Expression of Nogo-A mRNA after injury of the rat central nervous system.Neural Regen Res. 2008;3(12):1368-1371.

[30] Wannier-Morino P, Schmidlin E, Freund P, et al. Fate of rubrospinal neurons after unilateral section of the cervical spinal cord in adult macaque monkeys: effects of an antibody treatment neutralizing Nogo-A. Brain Res. 2008;1217:96-109.

[31] Yu P, Huang L, Zou J, et al. Immunization with recombinant Nogo-66 receptor (NgR) promotes axonal regeneration and recovery of function after spinal cord injury in rats. Neurobiol Dis. 2008;32(3):535-542.

[32] Zhan R, Chen SJ. Effects of Nogo-neutralizing antibody and neurotrophin-3 on axonal regeneration following spinal cord injury in rat.Neural Regen Res. 2008;3(12):1319-1323.

[33] Parr AM, Kulbatski I, Wang XH, et al. Fate of transplanted adult neural stem/progenitor cells and bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in the injured adult rat spinal cord and impact on functional recovery. Surg Neurol. 2008;70(6):600-607.

[34] Jiang W, Xia F, Han J, et al. Patterns of Nogo-A, NgR, and RhoA expression in the brain tissues of rats with focal cerebral infarction.Transl Res. 2009;154(1):40-48.

[35] Gu S, Huang H, Bi J, et al. Combined treatment of neurotrophin-3 gene and neural stem cells is ameliorative to behavior recovery of Parkinson's disease rat model. Brain Res. 2009;1257:1-9.

[36] Mothe AJ, Tator CH. Transplanted neural stem/progenitor cells generate myelinating oligodendrocytes and Schwann cells in spinal cord demyelination and dysmyelination. Exp Neurol. 2008; 213(1):176-190.

[37] Duan X, Kang E, Liu CY, et al. Development of neural stem cell in the adult brain. Curr Opin Neurobiol. 2008; 18(1):108-115.

[38] Delcroix GJ, Jacquart M, Lemaire L, et al. Mesenchymal and neural stem cells labeled with HEDP-coated SPIO nanoparticles: in vitro characterization and migration potential in rat brain. Brain Res. 2009;1255:18-31.

[39] Tian ZM, Chen T, Zhong N, et al. Clinical study of transplantation of neural stem cells in therapy of inherited cerebellar atrophy. Beijing Da Xue Xue Bao. 2009;41(4):456-458.

[40] Chen W, Xu ZM, Wang G, et al. Non-motor symptoms of Parkinson's disease in China: a review of the literature. Parkinsonism Relat Disord. 2012;18(5):446-452.

引言

当前颅脑损伤已经成为威胁人类健康的重大疾病，由于神经细胞的不可再生性而使疾病对人体的损害不可逆转。传统的治疗方法也往往无法获得理想的效果。随着干细胞技术的不断发展，人们开始通过干细胞移植方式治疗疾病。干细胞具有很强的多向分化能力，可以在一定条件下发生定向分化。1992 年，学者Reynolds与Weiss通过研究发现，在成年中枢神经系统的室管膜下以及胚胎中存在一群特殊的细胞，这种细胞具有一定的自我增殖能力和干细胞特性，并提出了“神经干细胞”这一概念。神经干细胞属于一种多能干细胞，来源于中枢神经系统，具有自我更新能力，在特定条件诱导下，能够分化为神经胶质细胞或特定类型神经元，参与修复神经损伤。神经干细胞在胚胎时期的分布主要集中在胚胎发育的中轴部位，如脑室、脑室下区、中脑导水管周围。侧脑室附近的室管膜下区和海马是哺乳动物神经系统中神经干细胞最为集中的部位，近年的研究发现，位于室管膜前下区的神经干细胞具有特殊的迁移分化特性。首先，室管膜前下区神经干细胞是出生后嗅球中间神经元终身更新的来源，室管膜前下区神经干细胞产生后，沿着一条高度局限的迁移通道——嘴侧迁移流以首尾相连的链式模式朝嗅球迁移，到达嗅球中央后，朝周边的颗粒细胞层和球周细胞层迁移而到达迁移终点，分化形成颗粒细胞和球周细胞，大约30%的球周细胞属于γ-氨基丁酸能神经元，70%的球周细胞属于多巴胺能神经元，它们是中枢神经系统中最大的多巴胺能神经元细胞群之一。近年来，脑实质内干细胞移植疗法已经成为一种新策略^[1]。但是，关于神经干细胞移植后在颅脑损伤局部的增殖和分化情况尚不清楚。为此，实验制备重型颅脑损伤大鼠模型，并向脑损伤部位注射神经干细胞，观察移植后大鼠神经功能恢复以及脑组织中神经元数量变化，以了解神经干细胞在损伤灶中的增殖和分化情况。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年4至7月在南阳医学高等专科学校第一附属医院完成。

1.3 材料孕14-16 d SD大鼠3只，3个月龄雄性SD大鼠20只，体质量200-250 g，平均体质量为(225±25) g，均由同济医学院动物中心提供。将20只雄性SD大鼠随机分为研究组和对照组，每组10只。研究组大鼠颅脑损伤后进行神经干细胞脑实质内移植治疗，对照组大鼠注射等量不含干细胞的培养液。

1.4 实验方法

1.4.1 颅脑损伤模型制作应用改良的自由落体方法制备脑损伤模型，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)麻醉，将其固定在立体定向仪上，常规消毒铺巾，沿中线矢状切开头皮，剥离骨膜，显露右侧颅骨，用牙科钻在冠状缝和人字缝之间钻一直径5 mm骨窗，保持硬膜完整，使用自由落体装置将50 g打击锤从 40 cm高度自由落下撞击硬脑膜。撞击后大鼠出现四肢抽搐，呼吸暂停数秒钟，说明致伤成功。术后用双氧水及生理盐水清洗创口，止血、缝合头皮，动物清醒后分笼喂养^[2]。

1.4.2 胚胎神经干细胞培养孕鼠静脉注射50 mg/kg BrdU标记神经干细胞。腹腔注射10%水合氯醛 (3.2 mL/kg)麻醉后将其处死，取出胎鼠大脑，解剖显微镜下仔细分离出皮质组织及海马组织，采用机械吹打结合胰蛋白酶消化的方法获得单细胞悬液，800 r/min离心5 min，弃去上清液，加入神经干细胞培养液，吹打均匀成单细胞悬液。将5×10⁵个细胞接种到培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中悬浮培养。观察约50%神经球大小在100 μm以上时进行传代，每5-7 d机械分离克隆传代1次。严格依据细胞生长速度及培养液pH变化每3-5 d半量换液1次。免疫细胞化学法鉴定BrdU标记的神经干细胞，免疫荧光染色检测神经干细胞巢蛋白的表达^[3]。

1.4.3 脑实质内移植伤后1 d再次对大鼠进行麻醉，打开原先骨窗，立体定向注射神经干细胞悬液。研究组大鼠损伤脑组织内注射6 μL神经干细胞悬液，于骨窗边缘分3点注入，每点2 μL，深度达硬膜下3.0 mm，留针5 min，缓慢退针，缝合头皮。对照组同法注射等量的不含干细胞的培养液^[4]。

1.4.4 神经功能评估在脑损伤前1 d、伤后1 d、1周、2周运用神经学缺损评分法评价大鼠运动神经功能，评分标准：大鼠无显著的神经功能缺失，评定为0分；大鼠对侧前肢屈曲，评定为1分；大鼠在提尾时对侧前肢抓力下降，评定为2分；大鼠能够在各方向自主运动，但是提尾时向左侧旋转，评定为3分；大鼠自发性向左侧旋转，评定为4分。大鼠运动神经功能评分越高，表示运动神经功能恢复越差^[5]。

1.4.5 免疫组化染色移植后2周，处死大鼠取其脑组织，进行常规石蜡切片，分别行苏木精-伊红染色、抗BrdU、胶质纤维酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶免疫组化染色^[6]。

1.5 主要观察指标 ①大鼠运动神经功能评分。②神经干细胞移植后脑内损伤灶的胶质纤维酸性蛋白、BrdU、β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计分析所有数据，计量资料用x(_)±s表示，两两比较予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经干细胞具有多项分化潜能，能够向神经系统大部分类型细胞分化，并长期自我更新，维持稳定的神经细胞数量，保持未分化或低分化的特性^[7-10]。神经干细胞的增殖方式包括不对称分裂和对称分裂，对称性分裂是指由一个神经干细胞经过一次分裂产生两个完全相同的子代神经干细胞，主要发生于胚胎神经管形成期神经干细胞数量急剧增加时；非对称性分裂是指一个神经干细胞经过一次分裂产生两个不同的子代细胞，一个神经干细胞和一个神经前体细胞，后者在外界刺激因子的作用下最终向多个细胞系的终末期分化，包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等^[11-18]。具有多种分化潜能是神经干细胞的一个基本属性，在体外培养体系中，神经干细胞的分化类型包括两种形式，一种形式为神经干细胞的诱导分化，另一种形式为神经干细胞的自然分化^[19-25]。

近年来，细胞替代治疗中枢神经系统损伤或病变已经发展成为治疗神经系统疾病的策略，具有极为广阔的应用前景。细胞移植修复受损脑组织是一种有效的治疗方法。在移植部位，神经干细胞分裂增殖，在局部微环境作用下，神经干细胞分化为相应的细胞，进而替代受损细胞，从而有效恢复中枢神经系统功能。神经干细胞移植修复神经功能的可能机制^[26-33]：①向神经细胞直接分化填补缺损区。②神经干细胞能够分泌大量的营养物质，显著减少神经细胞凋亡，提供适宜的微环境，能够促进机体损伤神经功能的修复。实验结果表明，在体外环境下培养胚胎神经干细胞，利用立体定向移植方式将神经干细胞悬液注射至脑损伤大鼠病灶内，可以显著改善大鼠脑损伤。研究还发现，大鼠脑组织切片中神经元数量显著增加，经BrdU免疫组化检测观察到移植的神经干细胞在大鼠颅内损伤区发生了存活和分化、迁移。依据移植部位，脑实质内移植又可以分为损伤中心移植和损伤边缘移植等其他类型。脑实质内移植的优越性：移植细胞直接进入脑实质内，血脑屏障等因素不会对其造成直接而深刻的影响^[34-38]。实验向研究组大鼠受损脑组织移植大鼠神经干细胞，发现有标记的神经干细胞存在于大鼠脑组织损伤灶中。抗BrdU免疫组化染色表明，移植损伤灶中心区域BrdU阳性细胞最多，同时损伤灶的远隔部位也有较多的BrdU阳性细胞，细胞为圆形、呈棕褐色，同时可见损伤灶一部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性；对照组大鼠没有BrdU阳性细胞，从这里可以看出，神经干细胞移植后能够发生一定的迁移。

大脑内神经组织中包含多种细胞类型，例如星形胶质细胞和神经元细胞等。大脑功能依赖于神经元并通过各种神经信号传导来实现。脑内神经元可发挥出不同的功能，例如胆碱能神经元和多巴胺能神经元以及5-羟色胺能神经元等，与多种神经中枢疾病之间存在十分密切的联系。神经发生持续于整个生命过程，对认知功能、脑损伤修复等起到重要作用。神经干细胞则可以在一定的情况下发生分化，形成不同的神经元。其中，微管蛋白是广泛分布的一类球状蛋白质，是细胞内微管的基本结构单位，在细胞的运动和分裂中都发挥着重要作用^[30]。实验选择β微管蛋白Ⅲ和酪氨酸羟化酶免疫荧光染色，研究组神经干细胞分化为神经元(β微管蛋白Ⅲ染色阳性)和多巴胺神经元(酪氨酸羟化酶染色阳性)。上述结果表明，大鼠胚胎脑组织神经干细胞可以分化为神经元以及少突胶质细胞。同时，研究组大鼠的损伤灶脑组织BrdU阳性细胞数显著多于对照组；组内比较，两组大鼠伤后1 d、1周、2周的神经学缺损评分均显著高于伤前1 d(P < 0.05)，伤后随着时间的延长神经学缺损评分逐渐降低；组间比较，伤前1 d、伤后1 d两组大鼠的神经学缺损评分差异均无显著性意义(P > 0.05)，但伤后1，2周研究组大鼠的神经学缺损评分均显著低于对照组(P < 0.05)，说明神经干细胞移植后大鼠神经功能恢复显著优于对照组。实验结果表明，立体定向脑内移植神经干细胞在大鼠脑损伤灶中会增殖分化，进而显著改善大鼠的神经运动功能。

神经干细胞移植主要存在以下问题：①神经干细胞的定向诱导分化。干细胞具有不同的来源及分化程度，最终会对治疗效果造成极大程度的影响。②神经干细胞有效的生长控制，体内环境等很多因素均直接影响着神经干细胞生长，致瘤性会在无限制生长的情况下发生，而坏死凋亡则会在生长停滞的情况下发生。③将神经干细胞和宿主细胞的功能有效发挥出来，采取相关措施对相关影响因素进行有效控制仍然需要进一步深入研究，如物种、内环境变化等^[39-40]。