骨髓间充质干细胞移植后在胸腺内的定居

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.010

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

归巢：1983年Gallatin等在《自然》杂志上首次报道血源性淋巴细胞能选择性地进入二级淋巴器官，这个过程用“归巢”进行了定义。近年来，随着干细胞疗法的兴起，归巢被引申至对多种干细胞的描述。所谓间充质干细胞归巢，是指自体或外源性间充质干细胞在多种因素的作用下定向趋向性迁移至靶器官并定植的过程。

D-半乳糖衰老动物模型：该模型自1991年被提出以来在国内得到广泛运用和发展。根据衰老的代谢学说，衰老是机体新陈代谢障碍的结果，糖代谢紊乱必然会引起心、肝、肾、脑等重要器官代谢异常最终出现衰老。在制备D-半乳糖衰老大鼠或小鼠模型时，可以每天腹腔注射或颈背部皮下注射 D-半乳糖 50-500 mg/kg，连续给药6-8周。造模后可从形态学、行为学、血液及组织器官生化指标测定等方面进行检测。

背景：骨髓间充质干细胞具有低免疫原性，并可诱导机体产生免疫耐受。目前对骨髓间充质干细胞发挥免疫调节作用的机制还不完全了解，对于骨髓间充质干细胞移植后能否迁移到免疫器官胸腺尚鲜有报道。

目的：观察骨髓间充质干细胞移植后在衰老模型大鼠免疫器官胸腺组织内的存活情况。

方法：以腺病毒介导绿色荧光蛋白基因体外转染骨髓间充质干细胞，通过大鼠尾静脉注射移植给衰老模型大鼠，于移植后第3，7，14，21天取材，荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞归巢到胸腺的存活情况。移植骨髓间充质干细胞第3天，取材胸腺组织，进行苏木精-伊红染色，观察移植细胞部位的组织病理变化。

结果与结论：①骨髓间充质干细胞移植后第3，7天：绿色荧光蛋白荧光表达较强，细胞轮廓清晰，两者平均吸光度值比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)。②移植后第14，21天：绿色荧光蛋荧光表达较弱，与第3天平均吸光度值相比，差异有显著性意义(P < 0.05)。③细胞移植后第3天：胸腺组织切片光镜显示无急性排斥反应特征出现。④结果表明骨髓间充质干细胞可通过血液循环迁移至受损胸腺组织，且至少能够存活1 周。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-2225-3100(王志红)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间质干细胞移植, 衰老, 胸腺, 绿色荧光蛋白, 大鼠, 福建省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have low immunogenicity and can induce immune tolerance. At present, the mechanism of immune regulation of bone marrow mesenchymal stem cells is not completely understood. It has been rarely reported whether the bone marrow mesenchymal stem cells can migrate to the thymus after transplantation.

OBJECTIVE: To observe the distribution and survival of bone marrow mesenchymal stem cells in the thymus of aging rats after transplantation.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro were transfected by adenovirus vectors expressing green fluorescent protein. Transfected bone marrow mesenchymal stem cells were injected into the portal vein of aging rats. At days 3, 7, 14, 21 after transplantation, the survival of bone marrow mesenchymal stem cells homing to the thymus was observed under fluorescence microscope. At day 3 after transplantation, thymus tissues were taken and stained with hematoxylin-eosin for pathological observation.

RESULTS AND CONCLUSION:Green fluorescent protein-labeled bone marrow mesenchymal stem cells had a strong green fluorescence at days 3 and 7 after transplantation, and the cell contour was clear. There was no significant difference in the mean absorbance values at days 3 and 7 (P > 0.05). Expression of green fluorescent protein was weakened significantly at days 14 and 21 compared with that at day 3 (P < 0.05). At 3 days after transplantation, the transplanted bone marrow mesenchymal stem cells were clearly visible in the thymus, and acute rejection was not observed. The results show that bone marrow mesenchymal stem cells can migrate to the damaged thymus tissue through the blood circulation, and can survive at least 1 week.

王志红，陈为民，郭坤元. 骨髓间充质干细胞移植后在胸腺内的定居[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1439-1445.

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The homing of transplanted bone marrow mesenchymal stem cells to the thymus

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1439-1445.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物的观察制备衰老模型大鼠10只，全部进入结果分析。衰老模型组连续给D-半乳糖4个月后，大鼠毛色枯黄、失去光泽，体质量减轻，行动缓慢，呈现出明显衰老体征。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的形态特征、鉴定采用贴壁法培养，接种24 h可见部分细胞贴壁；48-72 h贴壁细胞明显增多，逐渐伸展成为梭形、多角形，伸出长短不一、粗细不均的胞质突起，核居中；三四天可见小的集落形成。原代培养中细胞贴壁生长是以分散的、克隆集落方式增殖。传代后细胞呈均匀分布的平均生长，传代至第3代时，光镜下见细胞呈星形、梭形(图1)。利用流式细胞仪检测培养的第3代骨髓间充质干细胞表面标记物。结果发现，CD29 阳性细胞达到99%，CD44 阳性细胞数达到97%，CD34和CD45阴性细胞数分别为99.3%、99.1%。

2.3 表达绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞细胞培养板中加入携带绿色荧光蛋白的腺病毒培养3 h，在荧光显微镜下观察到稀少的微弱绿色荧光，少量细胞被转染；培养24 h后大部分细胞呈较强的绿色荧光(图2)，继续培养至48-72 h，阳性细胞逐渐增多，几乎全部骨髓间充质干细胞被转染，呈明亮的绿色荧光，转染效率80%左右。1周后绿色荧光逐渐减弱，说明阳性细胞减少(图3)；3周时仅少量细胞表达较弱的绿色荧光。空白对照组未见荧光表达。

2.4 绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞移植后的归巢骨髓间充质干细胞移植后第3，7天时胸腺组织中绿色荧光蛋白标记荧光表达较强，细胞轮廓清晰。移植后第3天检测荧光吸光度值为0.851±0.026，移植后第7天吸光度值为0.805±0.014，两者相比较差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后第14天和第21天时绿色荧光蛋白荧光表达较弱，荧光吸光度值分别为0.547±0.073，0.358±0.059，与移植后第3天吸光度值比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 胸腺组织学检查骨髓间充质干细胞移植后第3天，组织切片观察显示胸腺结构正常，可见少量炎性细胞浸润，未见广泛的急性小动脉炎及缺血性坏死，无急性排斥反应特征出现(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年5月在福建省立医院实验室与动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选用8-10周龄清洁级雄性SD大鼠30只(20只用于动物实验，10只用于细胞培养)，体质量160-180 g，均购自福建医科大学动物实验中心(动物编号：SYXK闽2012-001)。

实验过程中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》标准等相关法律。

1.3.2 试剂和仪器低糖型DMEM、胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，D-半乳糖(Sigma公司)，苏木精-伊红染色试剂盒(南京建成生物有限公司)。BS110S型电子天平、荧光显微镜、冰冻切片机(德国Lica公司)、960全自动酶连分析仪(法国Meterteth公司)，6孔培养板(Costar公司)，流式细胞仪(美国Coulter公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养、鉴定取10只SD大鼠，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死。在无菌条件下取出大鼠股骨和胫骨，置于装有DMEM培养液的玻璃培养皿中。使用玻璃吸管反复吸取培养液，冲洗骨髓腔，直至将骨髓腔冲洗干净后，收集细胞悬液。将细胞悬液离心，弃去上清液，加入配制好的细胞培养基(含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM)，使用玻璃吸管反复吹打重悬细胞。将细胞悬液接种于50 mL的小培养瓶内，轻轻摇晃使细胞均匀后置培养箱培养。倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞生长至接近融合，吸尽培养基，加入0.25%胰酶，晃动培养瓶使消化液铺匀，37 ℃培养箱消化3 min，镜下见细胞收缩变圆，加入3 mL培养基，吹打使细胞单个悬浮，收集于离心管中离心3 min，取离心后的细胞沉淀，加入完全培养基进行扩增培养。

取生长良好的第3代细胞，胰酶消化后，用PBS调整细胞量为2×10⁵，制成4组样本，分别加入荧光标记CD29，CD34，CD44，CD45单克隆抗体，应用流式细胞术检测细胞表面抗原表达。同时用小鼠IgG1-FITC和IgG1-PE作为同型抗体对照。

1.4.2 绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞取第3代细胞，按上述胰酶消化，收集细胞悬液计数后，接种于6孔培养板。将培养板置于倒置显微镜下观察，单层细胞培养接近80%融合时，弃去上清液，加入无血清DMEM培养基。培养体系加入病毒液(Ad-GFP滴度为3.0×10¹³ PFU/L)，以110 PFU/cell的剂量加入培养板中。每隔30 min振荡1次，常规半量换液。200倍荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白基因转染细胞的绿色荧光表达情况。转染率为绿色荧光阳性细胞百分数。

1.4.3 D-半乳糖致衰老动物模型的建立雄性SD大鼠20只随机分为正常大鼠组和衰老模型组。采用D-半乳糖制备衰老模型(剂量400 mg/kg)，经颈背部皮下注射，连续4个月，自由进食进水。正常对照组经颈背部皮下注射同等体积生理盐水。

1.4.4 移植后绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞的归巢收集绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞，胰酶消化后计数，制成3×10⁶的细胞悬液，经尾静脉注入衰老模型大鼠体内。分别于骨髓间充质干细胞移植后第3，7，14，21天，戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，取出胸腺组织。冰冻切片机连续冠状切片，30 μm/片，每隔4片取1张切片，荧光显微镜下观察GFP阳性细胞的分布。同时使用Image Pro Plus 6.0图像分析处理系统计算平均吸光度值。

1.4.5 苏木精-伊红染色移植骨髓间充质干细胞后3 d，取大鼠胸腺组织行苏木精-伊红染色，对细胞归巢组织的炎症反应情况进行组织学观察。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的标记情况。②骨髓间充质干细胞在大鼠胸腺的定位。③细胞移植大鼠的胸腺组织结构。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，组间比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来研究表明，间充质干细胞能克服排斥反应，减少免疫抑制药物的不良反应，已广泛用于器官移植研究^[10-11]。在造血干细胞移植后移植物抗宿主病临床试验中，间充质干细胞治疗和预防移植物抗宿主病的发生取得了很好的效果^[12-13]。间充质干细胞具有低免疫原性，可明显降低器官移植后排斥反应的发生率^[14-15]。大量研究表明，间充质干细胞表面MHC-Ⅰ类分子表达阳性，而基本不表达MHC-Ⅱ类分子、T 细胞活化的共刺激分子(B7-1、B7-2和CD40等)^[16]。MHC-Ⅰ类分子可保护间充质干细胞免受NK细胞的杀伤。在间充质干细胞与器官移植的研究中发现，间充质干细胞还具有免疫调节活性。一方面，间充质干细胞对多种免疫细胞具有免疫调节作用，包括树突状细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等^[17-19]。另一方面，间充质干细胞可通过分泌可溶性细胞因子诱导免疫偏离(如白细胞介素10、转化生长因子β1、肝细胞生长因子等)^[20-21]，在免疫功能重建、抑制异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病等领域备受关注^[22-24]。

间充质干细胞是当前组织工程领域研究的热点^[25-26]，但间充质干细胞在体内的定居和定位情况尚不明确，移植入体内的骨髓间充质干细胞在修复组织损伤及免疫调节中到底发挥什么作用难以作出评价。绿色荧光蛋白是一种在美国西北海岸的水母中所发现的生物发光蛋白，可在紫外光或蓝色光激发下发出绿色荧光，由于绿色荧光蛋白荧光稳定，可在不影响细胞正常生理作用下进行即时的观察及分析，因此被广泛用作细胞标记^[27]。成熟的绿色荧光蛋白较为稳定，将绿色荧光蛋白基因通过病毒载体转染入骨髓间充质干细胞后，绿色荧光蛋白可在骨髓间充质干细胞内稳定表达，载体系统及表达的绿色荧光蛋白对靶细胞无明显的毒害作用^[28-29]，故为组织工程种子细胞标记提供了一种灵敏、可靠而直观的方法。

实验以腺病毒携带绿色荧光蛋白基因转染骨髓间充质干细胞，对骨髓间充质干细胞移植后在衰老损伤胸腺组织的迁移归巢方面进行初步研究。胸腺是体内重要的淋巴器官，是淋巴细胞分化和成熟的场所，在抗感染免疫和肿瘤免疫中具有重要的作用。实验发现大鼠尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可在免疫器官胸腺组织内长期存活。实验选用衰老大鼠模型，可能在创伤部位炎症或修复等因素作用下，骨髓间充质干细胞通过血液循环迁移至受损胸腺参与再生修复，从而进入局部组织微环境增殖分化。

大量研究发现，当组织损伤后，骨髓中或引入体内的外源性骨髓间充质干细胞，以有限的效率优先向炎症区域和损伤组织归巢，同时在肺、肝和脾中也发现大量的间充质干细胞分布，但缺血损伤的组织更能吸引骨髓间充质干细胞归巢，使其迁移至损伤处发挥治疗作用^[30]。骨髓间充质干细胞具有向损伤及炎症组织定向迁移的能力^[31]，这主要为趋化因子及受体所介导，因其涉及细胞因子及其受体、信号传导通路等机制较为复杂，故目前确切的趋化定向迁移的机制还未完全阐明。研究显示，多种因素参与了间充质干细胞发挥趋化效应，包括生长因子(血小板衍生因子、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子和肝细胞生长因子等)^[32-33]，趋化因子(SDF-1/CXCR4、MCR-1/CCR2、CXCL-8/CXCR1等)^[34-35]。不同分子间组合效应非常复杂，而信号转导通路也是一个复杂的网络^[36]，目前其调控机制尚不清楚。骨髓间充质干细胞在进入血液循环之后，其迁移方向遵循损伤组织释放大量趋化因子所导致的化学质量浓度梯度。在趋化因子和相关生长因子的趋化指引下，骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞可逆的接触即为滚动。沿着内皮细胞壁滚动后的骨髓间充质干细胞向血管内皮黏附，涉及骨髓间充质干细胞通过黏附分子介导的归巢作用。另外，骨髓间充质干细胞分泌组织纤溶酶原激活物、尿激酶型纤溶酶原激活物等，这些纤溶酶能降解纤溶蛋白凝块，促进骨髓间充质干细胞进入损伤组织并参与组织修复重建^[37]。

植入的骨髓间充质干细胞向损伤部位定向迁移后，主要通过分化成新的组织细胞，替代损伤或死亡的细胞，从而发挥修复作用^[38]。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在适当的环境下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、表皮细胞和血管内皮细胞等。骨髓间充质干细胞在损伤部位产生新的组织间质结构，并能通过分化形成各种新的组织细胞。另外，骨髓间充质干细胞可抑制T、B细胞的增殖活化，促进T细胞向调节性T细胞转化等，通过细胞接触、分泌可溶性细胞因子等多种方式发挥其免疫调节作用。

综上所述，实验证实骨髓间充质干细胞可通过血液循环迁移至受损胸腺组织，进一步通过移植骨髓间充质干细胞可能改善胸腺中淋巴细胞和细胞因子免疫微环境，重建免疫平衡。骨髓间充质干细胞在修复胸腺损伤中的作用机制及其发挥免疫耐受作用还有待于进一步研究。