脂肪间充质干细胞可调节变应性鼻炎T细胞的免疫状态

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.10.001

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

变应性鼻炎：又称为过敏性鼻炎，是指特异性个体接触变应原后，主要由IgE介导的介质(主要是组胺)释放，并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜非感染性炎性疾病。

T细胞：在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。

背景：脂肪间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和增殖潜能，并具有低免疫原性以及免疫调节优势。

目的：探讨脂肪间充质干细胞对小鼠变应性鼻炎T细胞免疫状态的影响。

方法：①将60只小鼠随机分为6组(分组表示为致敏/激发/处理)：卵清蛋白/卵清蛋白/高剂量脂肪间充质干细胞组(简称高剂量脂肪间充质干细胞组)、卵清蛋白/卵清蛋白/低剂量脂肪间充质干细胞组(简称低剂量脂肪间充质干细胞组)、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组、卵清蛋白/卵清蛋白组/0组、PBS/PBS组/0组、正常对照组。前5组分别于第0，7，14天的相同时间腹腔注射200 μL卵清蛋白致敏液或PBS进行基础致敏，第15-19天每天给予20 μL卵清蛋白激发液或PBS进行激发，正常对照组不做任何处理。在致敏激发后的第20-22天，前3组分别经尾静脉注射0.1 mL的高、低浓度脂肪间充质干细胞液及PBS。②末次处理48 h后，采用ELISA法检测血清白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ水平，荧光定量PCR法检测脾脏上述各细胞因子mRNA的表达，荧光显微镜观察荧光标记脂肪间充质干细胞在鼻黏膜的迁移情况，苏木精-伊红染色观察鼻黏膜的病理学变化。

结果与结论：①高剂量脂肪间充质干细胞组与卵清蛋白/卵清蛋白组相比，血清和脾脏白细胞介素4和白细胞介素6水平显著下降(P < 0.05)，白细胞介素10和干扰素-γ水平显著增加(P < 0. 05)。②低剂量脂肪间充质干细胞组与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，血清和脾脏中白细胞介素6水平显著下降(P < 0.05)，白细胞介素10水平显著增加(P < 0.05)，白细胞介素4和干扰素-γ的水平无显著性变化(P > 0.05)。③荧光标记的脂肪间充质干细胞可向鼻黏膜迁移分布，高浓度脂肪间充质干细胞组明显多于低浓度脂肪间充质干细胞组。④高、低浓度脂肪间充质干细胞组鼻黏膜中嗜酸性粒细胞浸润明显减轻。⑤脂肪间充质干细胞通过调节Th1/Th2细胞免疫失衡和Treg细胞缺陷发挥非特异性免疫调节作用，这种调节作用存在一定的剂量依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-0978-9952 (肖二彬)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 变应性鼻炎, 脂肪间充质干细胞, 调节性T细胞, Th1/Th2免疫平衡

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells are a kind of pluripotent stem cells that have the potential of self-renewal and proliferation, and have low immunogenicity and immunomodulatory role.
OBJECTIVE: To study the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells on T cell immune status of allergic rhinitis mouse models.
METHODS: Sixty mice were randomly assigned into six groups (sensitized/challenged/treatment): experimental group 1 was given ovalbumin/ovalbumin/high-dose adipose-derived mesenchymal stem cells, experimental group 2 given ovalbumin/ovalbumin/low-dose adipose-derived mesenchymal stem cells, experimental group 3 given ovalbumin/ovalbumin/PBS, experimental group 4 given ovalbumin/ovalbumin/0, and experimental group 5 given PBS/PBS/0, and normal control group given no treatment. In the former five groups, intraperitoneal injection of 200 μL ovalbumin sensitizing solution or PBS was conducted for basic sensitization at days 0, 7, 14; 20 μL ovalbumin challenging solution or PBS was given for challenging at days 15-19. In the former three groups, 0.1 mL of high-dose, low-dose adipose-derived mesenchymal stem cells or PBS was given via the tail vein, respectively, at days 20-22 after sensitization and challenge. At 48 hours after final treatment, ELISA was used to detect serum levels of interleukin-4, interleukin-6, interleukin-10 and interferon-γ, and fluorogenic quantitative PCR used to detect the mRNA expressions of these cytokines in the spleen. Migration of fluorescent-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells in the nasal mucosa was observed under fluorescence microscope, and pathological changes of the nasal mucosa were observed through hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the experimental group 4, the levels of interleukin-4 and interleukin-6 in the serum and spleen were significantly lower in the experimental group 1 (P < 0.05), and the levels of interluekin-10 and interferon-γ levels were significantly increased (P <0.05); while in the experimental group, the levels of interleukin-6 were reduced significantly (P < 0.05), the levels of interleukin-10 was increased significantly (P < 0.05), but no changes were found in the levels of interleukin-4 and interferon-γ (P > 0.05). Fluorescent-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells could migrate into the nasal mucosa, and the number of migrated cells was notably higher in the experimental group 1 than experimental group 2. Eosinophil infiltration in the nasal mucosa was remarkably alleviated in the experimental groups 1 and 2. These findings suggest that adipose-derived mesenchymal stem cells play a non-specific immunomodulatory effect dose-dependently by regulating Th1/Th2 immune imbalances and deficiencies of Treg cells.

肖二彬，赵宝建，张驰. 脂肪间充质干细胞可调节变应性鼻炎T细胞的免疫状态[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(10): 1373-1381.

Xiao Er-bin, Zhao Bao-jian, Zhang Chi . Adipose-derived mesenchymal stem cells regulate T cell immune status in allergic rhinitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(10): 1373-1381.

图/表（结果） 3

2.1 脂肪间充质干细胞的形态接种24 h后细胞形态不一，细胞呈圆形，折光性强，少量细胞贴壁生长。 48 h后胞体舒展，呈长梭形，贴壁数量增多。继续观察出现漩涡状成纤维细胞样集落，当细胞生长达80%时进行传代培养，传代培养后细胞出现形态均一的长梭形，生长速度加快(图1)。

2.2 脂肪间充质干细胞表面标志的鉴定经流式细胞仪检测CD44阳性表达率为33.5%，CD106，CD34，CD45呈阴性表达，分别为5.03%，9.43%，11.78%。

2.3 变应性鼻炎模型鼠的构建情况造模小鼠均出现过敏性鼻炎症状，评分均>5分，造模均成功；PBS/PBS组小鼠评分≤5分；正常对照组均未出现变应性鼻炎表现。

2.4 小鼠血清白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ水平

2.4.1 血清白细胞介素4水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/ PBS组的血清白细胞介素4水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000。进一步采用Dunnett's T3法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组的白细胞介素4水平较卵清蛋白/卵清蛋白组明显下降，而低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组与卵清蛋白/卵清蛋白组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素4水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用LSD法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素4水平明显升高(P=0.000)，PBS/PBS组的血清白细胞介素4水平变化不明显(P > 0.05)，见表1。

2.4.2 血清白细胞介素6水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/ PBS组的血清白细胞介素6水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组的血清白细胞介素6水平明显低于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的血清白细胞介素6水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞和低剂量脂肪间充质干细胞均可以降低小鼠血清白细胞介素6水平，脂肪间充质干细胞的免疫调节有剂量依赖性。卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素6水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用Dunnett's T3法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素6水平明显升高(P=0.000)，PBS/PBS组的血清白细胞介素6水平变化不明显(P > 0.05)，见表1。

2.4.3 血清白细胞介素10水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的血清白细胞介素10水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组的血清白细胞介素10水平明显高于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的血清白细胞介素10水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞和低剂量脂肪间充质干细胞均可以升高小鼠血清白细胞介素10水平，脂肪间充质干细胞的免疫调节有剂量依赖性。卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素10水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用Dunnett's T3法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的血清白细胞介素10水平明显降低(P=0.000)，PBS/PBS组的血清白细胞介素10水平变化不明显(P > 0.05)，见表1。

2.4.4 血清干扰素-γ水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/ PBS组的血清干扰素-γ水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组的血清干扰素-γ水平明显高于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；卵清蛋白/卵清蛋白/低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的血清干扰素-γ水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞处理可以升高小鼠血清干扰素-γ水平，低剂量脂肪间充质干细胞处理后血清干扰素-γ水平也有增加趋势，但差异无显著性意义(P > 0.05)。卵清蛋白/卵清蛋白组的血清干扰素-γ水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用Dunnett’s T3法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的血清干扰素-γ水平明显降低(P=0.000)，PBS/PBS组的血清干扰素-γ水平变化不明显(P > 0.05)，见表1。

2.5 小鼠脾脏白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ mRNA表达

2.5.1 脾脏白细胞介素4 mRNA水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏白细胞介素4 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000。进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组的脾脏白细胞介素4 mRNA水平较卵清蛋白/卵清蛋白组明显下降，而低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏白细胞介素4 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞处理的小鼠脾脏白细胞介素4 mRNA水平明显降低，而低剂量脂肪间充质干细胞处理的小鼠脾脏白细胞介素4 mRNA水平也有所下降，但比较差异无显著性意义。卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素4 mRNA水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用LSD法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素4 mRNA水平明显升高(P=0.000)，见表2。

2.5.2 脾脏白细胞介素6 mRNA水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组和低剂量脂肪间充质干细胞组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平明显低于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞和低剂量脂肪间充质干细胞均可以降低小鼠脾脏白细胞介素6 mRNA水平，脂肪间充质干细胞的免疫调节有剂量依赖性。卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，采用多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平明显升高(P=0.000)，PBS/PBS组的脾脏白细胞介素6 mRNA水平变化不明显(P > 0.05)，见表2。

2.5.3 脾脏白细胞介素10 mRNA水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组和低剂量脂肪间充质干细胞组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平明显高于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；卵清蛋白/卵清蛋白/ PBS组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞和低剂量脂肪间充质干细胞均可以升高小鼠脾脏白细胞介素10 mRNA水平，脂肪间充质干细胞的免疫调节有剂量依赖性。卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用LSD法多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平明显降低(P=0.000)，PBS/PBS组的脾脏白细胞介素10 mRNA水平变化不明显(P > 0.05)，见表2。

2.5.4 脾脏干扰素-γ mRNA水平高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏干扰素-γ mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，P=0.000；进一步采用LSD法多重比较，高剂量脂肪间充质干细胞组的脾脏干扰素-γ mRNA水平明显高于卵清蛋白/卵清蛋白组(P=0.000)；低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组的脾脏干扰素-γ mRNA水平与卵清蛋白/卵清蛋白组比较，差异无显著性意义(P>0.05)，表明高剂量脂肪间充质干细胞处理可以升高小鼠脾脏干扰素-γ mRNA水平，低剂量脂肪间充质干细胞处理后脾脏干扰素-γ mRNA水平也有增加趋势，但差异无显著性意义(P > 0.05)。卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏干扰素-γ mRNA水平与PBS/PBS组和正常对照组比较，P=0.000，进一步采用多重比较，卵清蛋白/卵清蛋白组的脾脏干扰素- γ mRNA水平明显降低(P=0.000)，PBS/PBS组的脾脏干扰素-γ mRNA水平变化不明显(P > 0.05)，见表2。

2.6 荧光标记的脂肪间充质干细胞在鼻黏膜的迁移情况荧光显微镜下鼻黏膜上皮及上皮下层处可见红色荧光，其中高剂量脂肪间充质干细胞组的荧光量较低剂量脂肪间充质干细胞组明显。

2.7 小鼠鼻黏膜的组织学观察高剂量脂肪间充质干细胞组和低剂量脂肪间充质干细胞组小鼠的鼻黏膜中未见明显嗜酸粒细胞浸润，间质水肿及基底膜增厚程度与正常对照组相似，较卵清蛋白/卵清蛋白组低；卵清蛋白/卵清蛋白组见小鼠鼻黏膜固有层有嗜酸性粒细胞浸润，且间质水肿和基底膜增厚较明显。

参考文献

[1] Li X, Wang J, Cao J, et al. Immunoregulation of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells on the Chronic Cigarette Smoking-Induced Lung Inflammation in Rats. Biomed Res Int. 2015;2015: 932923.

[2] James S, Fox J, Afsari F, et al. Multiparameter Analysis of Human Bone Marrow Stromal Cells Identifies Distinct Immunomodulatory and Differentiation- Competent Subtypes. Stem Cell Reports. 2015;4(6): 1004-1015.

[3] Fan L, Yu Z, Li J, et al. Immunoregulation effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in xenogeneic acellular nerve grafts transplant. Cell Mol Neurobiol. 2014;34(7):999-1010.

[4] Dorronsoro A, Fernández-Rueda J, Fechter K, et al. Human mesenchymal stromal cell-mediated immunoregulation: mechanisms of action and clinical applications. Bone Marrow Res. 2013;2013:203643.

[5] Akiyama K, Chen C, Wang D, et al. Mesenchymal- stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 2012;10(5):544-555.

[6] Fan FQ, Li D. Progression of relationship between mesenchymal stem cell and immunoregulation. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2011;32(5): 355-358.

[7] Pradier A, Passweg J, Villard J, et al. Human bone marrow stromal cells and skin fibroblasts inhibit natural killer cell proliferation and cytotoxic activity. Cell Transplant. 2011;20(5):681-691.

[8] Sa YL, Shen XM, Shi KQ, et al. Effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on cytokines secretion from allogeneic dendritic cell activated cytokine-induced killer cells. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2010;26(10):988-991.

[9] Chen X, Armstrong MA, Li G. Mesenchymal stem cells in immunoregulation.Immunol Cell Biol. 2006;84(5): 413-421.

[10] Jin JG, Hu JW, Ning HM, et al.The effect of MSC on cytokine production by naive T cell differentiated in vitro.Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2005;26(6):339-341.

[11] Chang HY, Seo JH, Kim HY, et al. Allergic diseases in preschoolers are associated with psychological and behavioural problems.Allergy Asthma Immunol Res. 2013;5(5):315-321.

[12] Chen MH, Su TP, Chen YS,et al.Allergic rhinitis in adolescence increases the risk of depression in later life: a nationwide population-based prospective cohort study.J Affect Disord. 2013;145(1):49-53.

[13] Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, et al. Innate lymphoid cells promote lung-tissue homeostasis after infection with influenza virus. Nat Immunol. 2011; 12(11):1045-1054.

[14] Halim TY, Krauss RH, Sun AC, et al. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 2012;36(3):451-463.

[15] Halim TY, Steer CA, Mathä L, et al. Group 2 innate lymphoid cells are critical for the initiation of adaptive T helper 2 cell-mediated allergic lung inflammation. Immunity. 2014;40(3):425-435.

[16] Barrett NA, Boyce JA. Activation of group 2 innate lymphoid cells: a new role for cysteinyl leukotrienes. J Allergy Clin Immunol. 2013;132(1):214-216.

[17] Ziegler SF, Artis D. Sensing the outside world: TSLP regulates barrier immunity. Nat Immunol. 2010;11(4): 289-293.

[18] Harada M, Hirota T, Jodo AI, et al. Thymic stromal lymphopoietin gene promoter polymorphisms are associated with susceptibility to bronchial asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2011;44(6):787-793.

[19] Ziegler SF. Thymic stromal lymphopoietin and allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2012;130(4):845-852.

[20] Siracusa MC, Saenz SA, Wojno ED, et al. Thymic stromal lymphopoietin-mediated extramedullary hematopoiesis promotes allergic inflammation. Immunity. 2013;39(6):1158-1170.

[21] Kabata H1, Moro K, Fukunaga K, et al. Thymic stromal lymphopoietin induces corticosteroid resistance in natural helper cells during airway inflammation. Nat Commun. 2013;4:2675.

[22] Gauvreau GM, O'Byrne PM, Boulet LP, et al Effects of an anti-TSLP antibody on allergen-induced asthmatic responses. N Engl J Med. 2014;370(22):2102-2110.

[23] 齐景翠,赵玉林,李伟亚,等.郑州地区变应性鼻炎患儿变应原谱分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2015,29(5): 404-406.

[24] 李江丽,刘积平,文玉敏.百色市儿童变应性鼻炎过敏原调查与分析[J].右江民族医学院学报,2014,36(6):885-886.

[25] 张蕾,艾涛,罗荣华.成都地区1123 例儿童过敏原皮肤点刺结果分析[J].海南医学,2014,25(23):3550-3552.

[26] 奚玲.过敏性鼻炎未成年患者常见吸入性变应原分析[J].华西医学,2014,29(4):710-713.

[27] 刘保国,李志英,李宗珊,等.抗组胺药临床应用[J].临床合理用药杂志,2015,8(8):85-86.

[28] 孔隽.氮卓斯汀喷鼻剂治疗过敏性鼻炎的临床疗效[J].中国药物经济学,2015,(1):62-63.

[29] 田卓莎,宋岩.抗组胺鼻喷雾剂与糖皮质激素鼻喷雾剂对于常年性变应性鼻炎的疗效[J].中国医药指南, 2015, 13(1):145-146.

[30] 冯韶燕,樊韵平,李磊.白三烯受体拮抗剂联合鼻用激素治疗变应性鼻炎的系统评价[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,29(3):207-211.

[31] Tintinger GR, Feldman C, Theron AJ, et al. Montelukast: more than a cysteinyl leukotriene receptor antagonist. ScientificWorldJournal. 2010; 10:2403-2413.

[32] Scaife A, Miller D, Spiteri-Cornish D, et al. Inhibitory effects of Montelukast on mediator release by nasal epithelial cells from asthmatic subjects with or without allergic rhinitis Respir Med. 2013;107(12):1859-1865.

[33] Goh BS, Ismail MI, Husain S. Quality of life assessment in patients with moderate to severe allergic rhinitis treated with montelukast and/or intranasal steroids: a randomised, double-blind, placebo-controlled study. J Laryngol Otol. 2014; 128(3):242-248.

[34] 朱和军.变应性鼻炎中西医治疗现状概述[J].光明中医, 2015,30(2):393-395.

[35] 黄慧.益气固表中药治疗常年性变应性鼻炎临床研究[J].亚太传统医药,2015,11(6):87-88.

[36] 宋建华,杨青.玉屏风散治疗变应性鼻炎56 例疗效观察[J].临床合理用药杂志,2013,6(2):124-125.

[37] 赵小慧,周鸿飞.针刺治疗过敏性鼻炎概况[J].实用中医内科杂志,2015,29(1):174-176.

[38] 李敏,张勤修,刘洋.针刺联合药物治疗变应性鼻炎患者的临床疗效观察[J].中国民康医学,2015,27(4):81-82.

[39] 吴国谦.标准化粉尘瞒变应原疫苗滴剂舌下含服治疗变应性鼻炎的疗效及安全性[J].当代医学, 2015,21(2): 95-96.

[40] 张志敏,李国义,陈向军.特异性免疫治疗对变应性鼻炎患者免疫功能的影响[J].现代中西医结合杂志, 2015,24(3): 281-283.

[41] 葛荣明,余少卿.变应性鼻炎的舌下特异性免疫治疗[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,29(9):777-780.

[42] 梁美君,徐睿,许庚.变应性鼻炎研究新进展[J].临床耳鼻咽喉头颈外科,2015,29(3):202-206.

[43] 陈阳静,高建民,赵谦.变应性鼻炎舌下特异性免疫治疗的疗效分析[J].基层医学沦坛,2015,19(4)483-484.

[44] 程雷.变应性鼻炎特异性舌下免疫治疗[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2015,29(3):197-198.

[45] 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会鼻科组,中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会鼻科学组.变应性鼻炎诊断和治疗指南[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009,44(12): 977-978.

[46] Fiocchi A, Fox AT. Preventing progression of allergic rhinitis: the role of specific immunotherapy. Arch Dis Child Educ Pract Ed. 2011;96(3):91-100.

[47] Hankin CS, Cox L, Bronstone A, et al. Allergy immunotherapy: reduced health care costs in adults and children with allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 2013;131(4):1084-1091.

[48] Kopp MV. Role of immunmodulators in allergen- specific immunotherapy.Allergy. 2011;66(6): 792-797.

[49] Cho KS, Park HK, Park HY, et al. IFATS collection: Immunomodulatory effects of adipose tissue-derived stem cells in an allergic rhinitis mouse model. Stem Cells. 2009;27(1):259-265.

[50] Akdis M, Verhagen J, Taylor A, et al. Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells.J Exp Med. 2004;199(11):1567-1575.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2013年4月至2014年7月在河北大学附属医院完成。

1.3 材料 6-8周龄雄性KM小鼠8只，体质量20-25 g，用于分离和培养脂肪间充质干细胞；6-8周龄KM小鼠60只，体质量20-25 g，雌雄不限，用于动物造模，所有小鼠均购自河北省实验动物中心。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠脂肪间充质干细胞的分离和培养 8只小鼠

断颈处死后取附睾及腹股沟周围脂肪组织，用含链霉素和青霉素的PBS进行冲洗，眼科剪剪碎，加入Ⅰ型胶原酶消化，再加入PBS摇匀，过滤离心后弃去上清，PBS洗涤沉淀以去除胶原酶，用含体积分数为10%胎牛血清的DMFM/F12培养基重悬并计数，调整细胞密度后接种于25 mL培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，24 h后首次换液，以后两三天换液1次，待细胞长满80%时用胰酶消化传代培养。

1.4.2 脂肪间充质干细胞鉴定收集第3-5代脂肪间充质干细胞，离心弃上清，以Buffer溶液悬浮，取100 μL细胞悬液加入Ep管中，加入抗体避光孵育30 min，加入Buffer溶液，离心弃上清，再加入Buffer溶液重悬后流式细胞仪进行检测。

1.4.3 致敏液和激发液配制 ①致敏液配制：称取卵清蛋白V 2 mg，加入4 mL PBS中，使其完全溶解配成 500 mg/L卵清蛋白溶液；称取适量明矾加入适量PBS中使其完全溶解配成10%明矾溶液；取4 mL明矾溶液加入卵清蛋白溶液中并充分混匀，室温孵育60 min，离心弃上清，沉淀用PBS重悬至4 mL，充分混匀。②激发液配制：称取卵清蛋白Ⅱ40 mg，溶于1 mL PBS中，充分混匀。

1.4.4 致敏与激发将60只小鼠随机分为6组(分组表示为致敏/激发/处理)：卵清蛋白/卵清蛋白/高剂量脂肪间充质干细胞组(简称高剂量脂肪间充质干细胞组)、卵清蛋白/卵清蛋白/低剂量脂肪间充质干细胞组(简称低剂量脂肪间充质干细胞组)、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组、卵清蛋白/卵清蛋白组、PBS/PBS组、正常对照组。前5组分别于第0，7，14天的相同时间每只给予腹腔注射200 μL卵清蛋白致敏液或PBS进行基础致敏，第15-19天每天每只给予20 μL卵清蛋白激发液或PBS进行激发(每侧鼻孔10 μL)，正常对照组不做任何处理。

1.4.5 脂肪间充质干细胞的荧光标记及移植取第3-5代生长80%以上的脂肪间充质干细胞，进行洗涤、消化，重悬后，加入CM-Dil孵育，PBS洗涤后重悬于PBS中，将其调整为1×10¹⁰ L^-1的低浓度脂肪间充质干细胞悬液和3×10¹⁰ L^-1的髙浓度脂肪间充质干细胞悬液。在致敏激发后的第20-22天，高剂量脂肪间充质干细胞组、低剂量脂肪间充质干细胞组、卵清蛋白/卵清蛋白/PBS组分别经尾静脉注射0.1 mL高浓度脂肪间充质干细胞悬液、0.1 mL低浓度脂肪间充质干细胞悬液及0.1 mL PBS。

1.4.6 小鼠一般症状观察造模第1天起，观察小鼠行为、形态、摄食等，并于每次鼻腔激发后观察小鼠挠鼻、喷嚏和流清涕情况，计算总分，总分超过5分为造模成功。

1.4.7 小鼠血清白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ水平检测各组小鼠末次处理48 h后，麻醉后摘眼球收集外周血，离心取少量血清进行蛋白定量，剩余血清用ELISA法测定白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ水平。

1.4.8 小鼠脾脏白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ mRNA水平检测上述各组小鼠摘眼球取外周血后处死，取出脾脏，提取总RNA，取其中2 μg进行反转录反应，采用荧光PCR法检测白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ的mRNA表达情况。

1.4.9 荧光标记的脂肪间充质干细胞在小鼠鼻黏膜的迁移取小鼠的鼻黏膜玻片，在荧光显微镜下观察CM-Dil标记的脂肪间充质干细胞在鼻黏膜处的迁移情况。

1.4.10 病理学检查末次处理48 h后处死小鼠，取鼻腔呼吸区黏膜，经甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，然后常规进行苏木精-伊红染色，光镜下观察炎症细胞浸润情况。

1.5 主要观察指标 ①血清白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ水平。②脾脏白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素10和干扰素-γ mRNA水平。③脂肪间充质干细胞在鼻黏膜的迁移情况以及鼻黏膜的病理学变化。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

变应性鼻炎是指变应原作用于个体引起IgE介导的鼻黏膜炎症性疾病，变应性鼻炎患者因受到鼻塞等症状的影响，使其生活质量明显下降，精神状况也受到影响，甚至出现一些抑郁症等心理疾病^[11-12]。变应性鼻炎的发病机制比较复杂：过去经典的观点认为变应性鼻炎发病的关键因素为树突状细胞引起的Th1和Th2优势分化，sIgE介导的炎症反应，近年来新的观点认为不依赖树突状细胞也可发生过敏反应，认为气道黏膜中的2型固有淋巴样细胞可能是Th2细胞的来源^[13]，是导致Th2细胞发生免疫反应的主要细胞^[14-15]；也有观点认为半胱氨酰白三烯(Cys-LTs)是过敏反应过程中的主要炎性介质，在变应性鼻炎迟发阶段发挥持久作用^[16]；胸腺基质淋巴细胞生成素在正常情况下维持机体Th2细胞反应平衡，在过敏反应中胸腺基质淋巴细胞生成素激活树突状细胞，促进Th2细胞因子的释放，启动炎症反应，胸腺基质淋巴细胞生成素还可以促进外周血前体细胞分化为Th2效应细胞^[17-22]。

变应性鼻炎的治疗包括以下几种：①避免接触变应原：变应性鼻炎的过敏原主要有花粉、尘螨、霉菌、冷空气、狗猫毛等^[23-26]，患者尽量避免与已知的过敏原进行接触。②药物治疗：目前治疗变应性鼻炎的药物只要有抗组胺药^[27-28]、糖皮质激素^[29]、抗白三烯药^[30-33]、抗胆碱药、抗充血剂、肥大细胞膜稳定剂及中药治疗等^[34-38]，其中糖皮质激素和抗组胺药物为一线药物。③特异性免疫治疗：特异性免疫治疗是通过免疫调节改变变应性鼻炎进程的治疗方法，但其周期长，患者顺应性差，在临床上尚未得到广泛推广^[39-48]。变应性鼻炎的药物治疗容易复发，研究新的治疗方法是非常有必要的。

变应性鼻炎的药物治疗只能控制症状，不能逆转免疫失衡状态，免疫治疗能够对患者进行过敏原脱敏，阻止变应性鼻炎发生发展。Th1和Th2的免疫失衡受多种因素调节：Th1/Th2的细胞失衡学说认为变应性鼻炎是Th2细胞的免疫反应偏移引起细胞因子及炎性介质释放而导致的鼻过敏反应^[49]，因此阻止Th2反应偏移恢复Th1/ Th2免疫平衡成为治疗变应性鼻炎的新方法。Treg细胞具有促进树突状细胞成熟、抑制T淋巴细胞增殖、调节Th1/Th2细胞平衡的作用，在变应性鼻炎患者中Treg细胞缺陷是引起其免疫失衡的主要因素^[50]，有人认为变应性鼻炎是Th2免疫失衡和Treg细胞缺陷的炎症性疾病。间充质干细胞分布在骨髓、脐血、脂肪等组织中，具有自我更新分化增殖潜能。脂肪间充质干细胞具有多向分化、稳定增殖、促进修复等能力，可以向造血细胞、骨骼肌细胞、神经细胞及心肌细胞等方向分化，并具有减少成纤维细胞凋亡，促进增殖，参与新生血管生成等作用。脂肪间充质干细胞具有免疫抑制作用，它的发现为探讨变应性鼻炎的机制及其治疗提供了新的思路。该实验对变应性鼻炎小鼠模型进行脂肪干细胞移植治疗，研究其对变应性鼻炎小鼠T细胞免疫的影响，结果发现：脂肪间充质干细胞可以降低血清中白细胞介素4、白细胞介素6水平，升高血清中干扰素-γ水平，从而调节Th1/Th2失衡；高剂量和低剂量脂肪间充质干细胞均可增加白细胞介素10及其mRNA水平，且高浓度和低浓度之间存在差异，白细胞介素10为Treg的代表性细胞，结果表明白细胞介素10可以调节Treg细胞的免疫缺陷，且具有剂量依赖性；两组小鼠的病理切片结果显示高浓度剂量组鼻黏膜上皮损伤轻，嗜酸性细胞浸润少，低浓度剂量组可以部分降低上皮损害和嗜酸性细胞浸润程度，表明脂肪间充质干细胞在减轻炎症反应上也具有剂量依赖性。

综上所述，脂肪间充质干细胞移植后可以通过调节Th1/Th2免疫失衡以及Treg细胞缺陷来改善小鼠变应性鼻炎的T细胞免疫状态，并且这种调节作用具有剂量依赖性。