脂肪间充质干细胞经肝动脉移植治疗晚期肝病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

晚期肝病：主要指晚期的肝硬化，肝硬化是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。诱导肝硬化发生的原因为病毒感染，肝组织病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。

干细胞移植的途径：干细胞移植的途径有肝动脉、门静脉、肝内、外周静脉等多种途径，其中外周静脉移植创伤小，操作简单，但此途径经过全身的血液循环使到达肝内的细胞数量减少；肝内途径移植是直接将细胞注射到肝脏内，使细胞在肝脏的定植率高，但容易损伤肝脏，导致肝破裂等；肝动脉移植通过介入的方法从股动脉穿刺插管经肝动脉进行细胞移植，该方法有利于细胞在肝内定植，增加定植量。

背景：干细胞移植是晚期肝病比较有前景的治疗方法，脂肪间充质干细胞是继骨髓间充质干细胞后的又一研究热点。

目的：探讨经肝动脉移植大鼠脂肪间充质干细胞对晚期肝病的影响。

方法：将45只SD大鼠随机分为3组，对照组、模型组和移植组各15只。模型组和移植组皮下注射四氯化碳诱导建立大鼠肝硬化模型，移植组大鼠经肝动脉注入1 mL CFSE 标记的脂肪间充质干细胞，模型组经肝动脉注入等量的生理盐水，对照组不予处理。移植治疗后4周，观察各组大鼠的肝脏病理组织学变化，肝功能及肝纤维化程度。

结果与结论：①在大鼠的肝脏内见到绿色荧光标记的脂肪间充质干细胞。②经苏木精-伊红染色和Masson染色后发现：模型组大鼠肝小叶结构不清，有假小叶形成，细胞浊肿疏松，部分变性坏死，见炎症细胞浸润；对照组大鼠肝组织未见异常。移植组大鼠的肝脏病理组织学改变介于模型组和对照组之间。③模型组大鼠的血清白蛋白水平低于对照组(P < 0.05)，胆红素、转氨酶和Ⅳ型胶原水平明显高于对照组(P < 0.05)；移植组大鼠的血清白蛋白水平高于模型组(P < 0.05)，胆红素、转氨酶和Ⅳ型胶原低于模型组(P < 0.05)。④由此可见脂肪间充质干细胞移植治疗可以改善肝硬化大鼠的肝脏功能，减轻肝纤维化程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-3740-4637 (郭宪立)

关键词: 干细胞, 移植, 脂肪间充质干细胞, 晚期肝病, 细胞移植, 肝硬化, 肝功能

Abstract:

BACKGROUND: Stem cell transplantation is a promising treatment for advanced liver diseases, and adipose-derived mesenchymal stem cells are a hot topic following bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effect of adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation via the hepatic artery on advanced liver diseases in rats.
METHODS: Forty-five rats were randomized into three groups, 15 rats in each group: control group, model group and transplantation group. Rat models of liver cirrhosis were made in the latter two groups through subcutaneous injection of carbon tetrachloride. Then, 1 mL of CFSE-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells was infused via the hepatic artery in the transplantation group, and the same volume of normal saline was infused in the model group. Control group had no treatment. Pathological changes, liver function and degree of hepatic fibrosis were observed in the three groups at 4 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: After transplantation, green fluorescence-labeled adipose-derived mesenchymal stem cells were seen in the liver of rats. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining showed unclear hepatic lobule structure in the model group with the formation of false lobules, cell cloudy swelling and loose, some degeneration and necrosis, and inflammatory cell infiltration; in the control group, there was nothing abnormal in the liver tissues of rats in the control group; in the transplantation group, the pathological changes of the rat liver were better than those in the model group, but worse than those in the control group. Compared with the model group, the level of serum albumin was higher in the control and transplantation group (P < 0.05), and the levels of bilirubin, aminotransferase and type IV collagen were lower in the control and transplantation group (P < 0.05). Thus, it can be seen that adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation can improve liver function and reduce liver fibrosis in cirrhotic rats.

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图/表（结果） 3

2.1 大鼠脂肪间充质干细胞的形态接种后4 h出现贴壁现象，24 h基本完成贴壁，细胞多呈三角形或者短梭形，折光性高，随着培养时间延长，细胞体积增大，迅速分裂，至第5天时细胞明显增加，少数呈集落样生长，培养8 d时融合可达80%。传代培养一两个小时出现贴壁，呈类圆形，12 h内完全贴壁，呈长梭形，24 h内增殖比较缓慢，72 h后增长较快，进入对数生长期，第5天完全融合，呈梭形细胞群，漩涡状生长(图1A)。

2.2 大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定免疫组化染色显示：脂肪间充质干细胞CD44及CD105的阳性表达率分别为93%及92%，不表达HLA-DR、CD34和CD106，可见脂肪间充质干细胞不表达成纤维细胞和造血干细胞的表面标志，表达间充质干细胞的表面标志。

2.3 实验动物数量分析体内实验所用大鼠45只，全部进入结果分析。

2.4 各组大鼠肝脏内荧光染色和细胞计数情况经CFSE标记的脂肪间充质干细胞经肝动脉移植后，移植组大鼠的肝脏内见到绿色荧光标记的细胞(图1B)，荧光标记的细胞数平均为(194±10)个，而模型组和对照组均未见绿色荧光标记细胞。

2.5 各组大鼠肝脏的病理改变经苏木精-伊红染色和Masson染色，镜下观察肝组织切片发现(图2)：模型组大鼠肝小叶结构不清，有假小叶形成，细胞浊肿疏松，部分变性坏死，见炎症细胞浸润；对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞形态规则，肝窦正常，肝细胞索规则；移植组大鼠的肝脏损害程度介于模型组和对照组之间。

2.6 各组大鼠移植后肝功能指标及肝纤维化指标由表1可以看出，模型组大鼠的血清白蛋白水平明显低于对照组(P < 0.05)；模型组的胆红素(直接胆红素和总胆红素)、转氨酶(天冬氨酸转移酶和丙氨酸转移酶)和Ⅳ型胶原水平明显高于对照组(P < 0.05)，表明肝硬化模型建造成功。移植组大鼠的血清白蛋白水平明显高于模型组(P < 0.05)；移植组的胆红素(直接胆红素和总胆红素)、转氨酶(天冬氨酸转移酶和丙氨酸转移酶)和Ⅳ型胶原水平明显低于模型组(P < 0.05)，表明脂肪间充质干细胞移植治疗对肝硬化有保护作用。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年5月至2015年7月在河北医科大学第二医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性健康SD大鼠50只，四五周龄，清洁级，体质量130-150 g，购自河北省实验动物中心，实验前按照实验动物标准进行进食和饮水饲养1周。实验大鼠符合卫生部一级动物标准，实验过程对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 主要溶液调配 ①DMEM/F12基础培养液：取10 g DMEM/F12培养粉+3.67 g NaHCO₃+2.4 g HEPES+980 mL三蒸水搅拌，溶解后添加100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素至1 000 mL，pH值为7.2-7.4，搅匀后过滤除菌。②DMEM/F12完全培养液：体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12 基础培养液，过滤除菌即成。③胶原酶消化液：100 mg Ⅰ型胶原酶+100 mL含有钙镁的PBS+1 g牛血清白蛋白溶解制成0.1%Ⅰ型胶原酶+1% BSA的消化液，过滤除菌分装备用。④PBS：0.20 g KCl+ 8.00 g NaCl+1.56 g Na₂HPO₄•H₂O +0.2 g KH₂PO₄+1 000 mL三蒸水溶解，pH值调至7.2-7.6，高压灭菌备用。⑤红细胞裂解液：100 mL无钙镁PBS+ 1.711 7 g NH₄Cl溶解配成160 mmol/L NH₄Cl溶液，过滤分装备用。⑥胰酶消化液：100 mL PBS+ 0.25 g胰蛋白酶溶解，滤网过滤，分装备用。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离培养将5只SD大鼠脱颈处死，浸泡乙醇中消毒，无菌环境中取大鼠腹股沟脂肪垫，剪去其中的结缔组织和血管，留下的脂肪组织剪成小块，加入Ⅰ型胶原酶于恒温水浴箱中消化，再加入含血清培养基中和消化，经滤网过滤，离心后弃去上清液，红细胞裂解液悬浮细胞，再离心弃去上清液，无血清培养基重新悬浮细胞，离心，弃去上清液，加入生长培养基培养，24 h第1次换液，除去没有贴壁的细胞，以后每48 h进行1次换液。待细胞生长至80%-90%融合时用胰蛋白酶消化，传代培养，2 d更换1次培养基，细胞铺满瓶底时重复上述操作。

1.4.2 大鼠脂肪间充质干细胞的鉴定选生长良好的第3代细胞进行鉴定，将第3代细胞用甲醛固定爬片，PBS洗涤，H₂O₂孵育消除过氧化物酶活性，蒸馏水洗涤，加入一抗，过夜孵育，PBS洗涤，加入羊抗鼠IgG二抗孵育，PBS洗涤，加入SABC孵育，PBS洗涤，DAB显色，细胞内出现棕褐色物质时停止显色，苏木精复染，观察拍照。

1.4.3 大鼠脂肪间充质干细胞的CFSE体外标记将第3代脂肪间充质干细胞消化后，制成1×10⁹ L^-1单细胞悬液，加入CFSE 37 ℃孵育5 min后，PBS洗1次，最后调整细胞浓度为5×10⁹ L^-1用于细胞移植。

1.4.4 大鼠分组将45只SD大鼠随机分为对照组、模型组和移植组各15只。

1.4.5 大鼠肝损伤模型的建立^[1] 将模型组和移植组大鼠共30只进行肝硬化模型的建立，每只大鼠皮下注射四氯化碳液体橄榄油混合液(3 mL/kg)，每周注射2次，共注射4周，观察大鼠的一般状况。

1.4.6 细胞移植造模后第8周，移植组大鼠戊巴比妥钠麻醉成功后，将1 mL CFSE 标记的脂肪间充质干细胞悬液经肝动脉注入大鼠体内，模型组经肝动脉注入等量的生理盐水，对照组不予处理。

1.4.7 大鼠肝功能及纤维化指标测定移植后4周制取肝脏标本前抽取大鼠下腔静脉血约3 mL，离心后取上清液用全自动生化分析仪测定肝功能指标(白蛋白、直接胆红素、总胆红素、天冬氨酸转移酶、丙氨酸转移酶)，ELISA法检测Ⅳ型胶原水平。

1.4.8 制取大鼠肝脏标本移植后4周时处死大鼠，以9.8 kPa的灌注压经大鼠左心室-升主动脉进行插管先灌注500 mL生理盐水，再灌注50 mL多聚甲醛，待肝脏变为苍白色后将肝脏取出，剪成小块浸润甲醛溶液中。

1.4.9 大鼠肝脏病理组织学检查将大鼠肝组织在甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片机切成5 μm厚的切片，进行苏木精-伊红染色和Masson染色。苏木精-伊红染色：切片经二甲苯、乙醇脱蜡，蒸馏水洗涤，苏木精染色，盐酸乙醇分色，自来水冲洗，镜下见细胞核蓝染，乙醇脱水，伊红染色，乙醇分色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。Masson染色：切片经二甲苯、乙醇脱蜡，蒸馏水洗涤，苏木精染色，盐酸乙醇分色，自来水冲洗，丽春红酸性品红液染色，蒸馏水洗涤，磷钼酸、苯胺蓝染色，自来水冲洗，烤箱烘干二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.10 肝脏内荧光标记细胞计数荧光显微镜下观察荧光细胞的分布情况，计算5个视野的荧光细胞数，取其平均值。

1.5 主要观察指标大鼠肝脏功能指标白蛋白、直接胆红素、总胆红素、天冬氨酸转移酶、丙氨酸转移酶的改变，以及肝脏病理组织结构的改变。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素分析方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

晚期肝病大多是肝硬化病程的终末阶段，肝功能严重受到损害。肝硬化主要是由病毒性肝炎引起，其中乙肝所致的肝硬化最为常见。目前的治疗有西医治疗、中医治疗和中西医治疗。西医治疗：①抗病毒治疗。拉米夫定和阿德福韦联合治疗能够有效改善肝功能，提高临床效果^[2-3]，替比夫定与恩替卡韦治疗乙肝后肝硬化可以改善病情^[4]。②抗纤维化治疗。抗纤维化治疗主要是抑制肝星状细胞的活化，γ干扰素被认为是比较有前途的抗纤维化药物^[5]，还可以通过免疫治疗和肝细胞的保护治疗阻止肝脏纤维化的发展^[6]。中医治疗：①抗病毒治疗：中医认为肝硬化的主要原因是湿热疫毒的入侵，临床上常用的抗病毒中药有苦参素、肝络欣、叶下珠等，苦参素可能提高免疫反应，抑制乙肝DNA的复制，清除肝细胞内病毒^[7]，叶下珠治疗肝硬化也具有良好的效果^[8]。②抗纤维化治疗：中药丹参、黄芪、莪术、姜黄素、苦参等抗纤维化的疗效已被证实^[9-10]。中西医结合治疗：恩替卡韦片联合双虎清肝颗粒^[11]、安络化纤丸联合阿德福韦等中西医联合治疗效果优于单一治疗效果^[12]，有研究认为以免疫为导向的抗病毒治疗效果比较稳定^[13-14]，中西医结合治疗可以互补单纯西药及单纯中医的不足，治疗效果更好。但目前的治疗方法都只能改善症状，缓解病情，不能从根本上解决肝细胞再生的问题，干细胞可以分化为肝细胞，为晚期肝病的治疗提供了新的方法。

干细胞是一种多潜能细胞，具有自我更新增殖和分化能力，治疗肝硬化的细胞主要有非肝源性的骨髓干细胞、造血干细胞等，肝源性的肝细胞、小肝细胞以及卵圆细胞等^[15-16]。骨髓间充质干细胞具有抗炎及抗纤维化作用，并具有强大的归巢能力^[17]，对肝细胞的再生和修复具有重要作用^[18]，在体内可以分化为肝细胞，改善肝功能^[19-22]，在肝硬化的治疗中有广泛应用。脐血干细胞在体内外也可以分化为肝样细胞，移植治疗也可以改善肝功能^[23-25]。脂肪间充质干细胞是当今又一热点研究的干细胞，人或者动物的脂肪组织经培养后可能得到具有复制和分化潜能的脂肪源性间充质干细胞^[26-30]，脂肪间充质干细胞具有和骨髓间充质干细胞相似的特性，具有相似的标记抗原^[31]、基因转导能力^[32]、多向分化能力等。与骨髓间充质干细胞相比，具有取材方便、细胞获得率高^[33-34]、增殖不需要特定血清或基质补充等优点，因此具有比骨髓间充质干细胞更为广泛的应用前景。

干细胞移植的途径有肝动脉、门静脉、肝内^[35]、外周静脉、脾内移植等多种途径，其中外周静脉移植创伤小，操作简单，但此途径经过全身的血液循环使到达肝内的细胞数量减少；肝内途径移植是直接将细胞注射到肝脏内，使细胞在肝脏的定植率高，但容易损伤肝脏，导致肝破裂等；肝动脉移植通过介入的方法从股动脉穿刺插管经肝动脉进行细胞移植，一方面有利于细胞在肝内定植，增加定植量，另一方面操作简单，创伤小，是临床中应用最多的移植方法。

干细胞移植可以改善肝功能，升高血清白蛋白水平，减轻水肿和腹水，降低胆红素水平等^[36-39]，在临床研究中，大多未发生与干细胞移植相关的并发症^[40-41]。此次实验将45只大鼠随机分为对照组、模型组和移植组，模型组和移植组大鼠建立肝硬化模型，并将脂肪间充质干细胞经肝动脉移植治疗肝硬化大鼠，结果发现CFSE标记的脂肪间充质干细胞经肝动脉移植后在大鼠的肝脏内见到绿色荧光标记的细胞，而未进行移植的模型组和对照组均未见绿色荧光标记细胞；经苏木精-伊红染色和Masson染色后镜下观察发现：模型组大鼠肝小叶结构不清，有假小叶形成，细胞浊肿疏松，部分变性坏死，见炎症细胞浸润；对照组大鼠肝脏的病理形态正常；移植组大鼠的肝脏损害程度介于模型组和对照组之间。模型组大鼠的血清白蛋白水平明显低于对照组，模型组的胆红素、转氨酶和Ⅳ型胶原水平明显高于对照组；移植组大鼠的血清白蛋白水平明显高于模型组；移植组的胆红素、转氨酶和Ⅳ型胶原水平明显低于模型组。由此可见经肝动脉途径移植脂肪间充质干细胞治疗肝硬化，可以改善大鼠的肝功能，减轻肝脏的纤维化程度。