同种异体来源骨髓间充质干细胞移植可改善衰老心脏的功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.008

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

碱性成纤维细胞生长因子：是一种多肽类生长因子，既具有促进细胞分化、增殖、血管生成等与丝裂作用有关的生物学效应，同时还具有抑制细胞凋亡，促进一氧化氮产生，拮抗心肌细胞损伤等非丝裂效应，因此在抗衰老过程中起着重要作用。

p53基因：是一种肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，“p53”就诱导细胞凋亡。

背景：目前认为骨髓间充质干细胞能在损伤局部反应性分泌各种各样的因子，具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用。

目的：观察骨髓间充质干细胞对衰老心脏的治疗作用并探讨其可能的作用机制。

方法：30只SD大鼠随机分为3组：正常空白组，阳性造模组，治疗组，后2组给予D-半乳糖皮下注射制作大鼠衰老模型，治疗组经大鼠尾静脉注射同种异体骨髓间充质干细胞，每周1次，共4次；末次注射后1周制作心脏组织切片，苏木精-伊红染色观察各组大鼠心脏组织学改变；免疫印记法检测各组心脏组织中碱性成纤维细胞生长因子的表达，Real-time PCR检测心脏组织中p53 mRNA的表达。

结果与结论：治疗组与阳性造模组相比，能够改善衰老心脏的病理形态；与阳性造模组相比，治疗组能够使心脏组织碱性成纤维细胞生长因子表达升高(P < 0.05)，p53 mRNA表达减低(P < 0.05)，推测骨髓间充质干细胞可能和心脏细胞相互作用分泌碱性成纤维细胞生长因子、降低p53基因的表达从而具有治疗衰老心脏的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-4758-1901 (李艳菊)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 衰老, 心脏, 碱性成纤维细胞生长因子, p53

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells can secrete a variety of factors in the local lesion, and these factors can promote cell proliferation and inhibit cell apoptosis.
OBJECTIVE: To observe the curative effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the aging heart of rats and to explore the possible mechanism of action.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomized into three groups: normal blank group, model group and treatment group. Aging models were made in the latter two groups by injection of D-galactose. Rats in the treatment group were given allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell injection, once a week, totally four times. At 1 week after final injection, the heart tissues were sliced into sections to observe the pathological changes using hematoxylin-eosin staining. Western blot assay was used to detect the expression of basic fibroblast growth factor in the heart tissues. Real-time PCR was used to measure the expression of p53 mRNA in the heart tissues.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation could improve the pathological morphology of the aging heart. Compared with the model group, the expression of basic fibroblast growth factor in the heart tissues was significantly higher in the treatment group (P < 0.05), but the mRNA expression of p53 was lower (P < 0.05). It is speculated that bone marrow mesenchymal stem cells can interact with heart cells to secrete basic fibroblast growth factor and reduce p53 mRNA expression, thereby playing a curative effect on the aging heart.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

李艳菊，丁元廷，周媛，王飞清，曾强武，安仕刚，刘洋. 同种异体来源骨髓间充质干细胞移植可改善衰老心脏的功能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(6): 814-819.

Li Yan-ju, Ding Yuan-ting, Zhou Yuan, Wang Fei-qing, Zeng Qiang-wu, An Shi-gang, Liu Yang . Allogeneic bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can improve the function of the aging heart[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(6): 814-819.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 SD大鼠30只均进入统计结果分析，无脱落现象。

2.2 细胞培养及流式细胞仪鉴定结果 ①采用贴壁法培养的骨髓间充质干细胞于第3天半量换液，去除大量的造血干血细胞，可见细胞呈散在分布的贴壁克隆，长梭形，有胞浆突起，少数呈多角形，传至第3代的细胞生长速度较快，镜下观察形态均一，平行排列或漩涡状生长，第2代细胞经苏木精-伊红染色，核圆，色淡蓝，位于细胞中央，胞质肥大，胞膜清晰(图1)。②经流式细胞仪检测，第4代骨髓间充质干细胞的特异性表面标志物CD29、CD44呈阳性表达，阳性率分别为96.1%，99.8%：CD34、CD45阴性，阳性率分别为1.8%，1.6%，提示第4代贴壁细胞主要是骨髓间充质干细胞。

2.3 心脏组织的光镜分析结果正常空白组心肌细胞排列紧密、有序；阳性模型组心肌细胞嗜酸性染色增强，心肌细胞数量未见明显改变，但可见部分心肌细胞体积增大，心肌细胞间质内结缔组织增生，脂肪浸润，心肌细胞间质的小血管可呈明显的充血状态，有些心肌细胞可见细胞核增多、聚集现象；治疗组能有效改善上述改变(图2)。

2.4 Western Blot检测心肌组织碱性成纤维细胞生长因子蛋白含量与正常空白组相比较，阳性造模组碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达显著降低，治疗组碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达高于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1，图3。

2.5 Real-time PCR测定心肌组织中p53 mRNA表达模型组p53 mRNA的表达高于正常组，治疗组中 p53 mRNA表达明显低于模型组(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] Pagan LU, Damatto RL, Cezar MD, et al. Long-term low intensity physical exercise attenuates heart failure development in aging spontaneously hypertensive rats. Cell Physiol Biochem. 2015;36(1):61-74.

[2] Lu TM, Tsai JY, Chen YC, et al. Downregulation of Sirt1 as aging change in advanced heart failure. J Biomed Sci. 2014;21:57.

[3] Khan H, Kalogeropoulos AP, Zannad F, et al. Incident heart failure in relation to vascular disease: insights from the Health, Aging, and Body Composition Study. Eur J Heart Fail. 2014;16(5):526-534.

[4] Campbell SG, Haynes P, Kelsey Snapp W, et al. Altered ventricular torsion and transmural patterns of myocyte relaxation precede heart failure in aging F344 rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;305(5):H676-686.

[5] Tasso R, Gaetani M, Molino E, et al. The role of bFGF on the ability of MSC to activate endogenous regenerative mechanisms in an ectopic bone formation model. Biomaterials. 2012;33(7):2086-2096.

[6] Ponte AL, Marais E, Gallay N, et al. The in vitro migration capacity of human bone marrow mesenchymal stem cells: comparison of chemokine and growth factor chemotactic activities. Stem Cells. 2007;25(7):1737-1745.

[7] Liu Z, Liu H, Jiang J, et al. PDGF-BB and bFGF ameliorate radiation-induced intestinal progenitor/stem cell apoptosis via Akt/p53 signaling in mice.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2014;307(11): G1033-G1043.

[8] Bandoh N, Hayashi T, Takahara M, et al. VEGF and bFGF expression and microvessel density of maxillary sinus squamous cell carcinoma in relation to p53 status, spontaneous apoptosis and prognosis. Cancer Lett. 2004;208(2):215-225.

[9] Westwood G, Dibling BC, Cuthbert-Heavens D, et al. Basic fibroblast growth factor (bFGF)-induced cell death is mediated through a caspase-dependent and p53-independent cell death receptor pathway. Oncogene. 2002;21(5):809-824.

[10] 李艳菊,胡亮杉,郭坤元.间充质干细胞在衰老大鼠体内归巢的研究[J].中国老年学杂志,2009,29(7):823-826.

[11] Elder RW, George RP, McCabe NM, et al. Immunologic Aging in Adults with Congenital Heart Disease: Does Infant Sternotomy Matter. Pediatr Cardiol. 2015;36(7): 1411-1416.

[12] Pagan LU, Damatto RL, Cezar MD, et al. Long-term low intensity physical exercise attenuates heart failure development in aging spontaneously hypertensive rats. Cell Physiol Biochem. 2015;36(1):61-74.

[13] Cencioni C, Spallotta F, Mai A, et al. Sirtuin function in aging heart and vessels. J Mol Cell Cardiol. 2015;83: 55-61.

[14] Cowling RT. The aging heart, endothelin-1 and the senescent cardiac fibroblast. J Mol Cell Cardiol. 2015; 81:12-14.

[15] Linton PJ, Gurney M, Sengstock D, et al. This old heart: Cardiac aging and autophagy.J Mol Cell Cardiol. 2015; 83:44-54.

[16] Lipina TV, Dukhinova MS, Serezhnikova NB, et al. Age-related changes in the myocardium of the Japanese quail (Coturnix japonica) as a model of accelerated aging of the heart. Dokl Biol Sci. 2014;458: 319-321.

[17] Ikeda Y, Sciarretta S, Nagarajan N, et al. New insights into the role of mitochondrial dynamics and autophagy during oxidative stress and aging in the heart. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:210934.

[18] Steinmetz NJ, Aisenbrey EA, Westbrook KK, et al. Mechanical loading regulates human MSC differentiation in a multi-layer hydrogel for osteochondral tissue engineering. Acta Biomater. 2015;21:142-153.

[19] Haragopal H, Yu D, Zeng X, et al. Stemness enhancement of human neural stem cells following bone marrow MSC coculture. Cell Transplant. 2015; 24(4):645-659.

[20] Lin QD, Fang BJ, Zhou J, et al. Regulatory effect of As?O?on imbalance between adipogenic and osteogenic differentiation of BM-MSC from patients with aplastic anemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2014; 22(6):1667-1672.

[21] Koch M, Lehnhardt A, Hu X, et al. Isogeneic MSC application in a rat model of acute renal allograft rejection modulates immune response but does not prolong allograft survival. Transpl Immunol. 2013; 29(1-4):43-50.

[22] Hagmann S, Moradi B, Frank S, et al. FGF-2 addition during expansion of human bone marrow-derived stromal cells alters MSC surface marker distribution and chondrogenic differentiation potential. Cell Prolif. 2013;46(4):396-407.

[23] Battula VL, Bareiss PM, Treml S, et al. Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum-free, b-FGF-containing medium express cell surface frizzled-9 and SSEA-4 and give rise to multilineage differentiation. Differentiation. 2007;75(4): 279-291.

[24] Li JF, Yin HL, Shuboy A, et al. Differentiation of hUC-MSC into dopaminergic-like cells after transduction with hepatocyte growth factor. Mol Cell Biochem. 2013;381(1-2):183-190.

[25] Yamachika E, Tsujigiwa H, Matsubara M, et al. Basic fibroblast growth factor supports expansion of mouse compact bone-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and regeneration of bone from MSC in vivo. J Mol Histol. 2012;43(2):223-233.

[26] Tamama K, Kawasaki H, Wells A. Epidermal growth factor (EGF) treatment on multipotential stromal cells (MSCs). Possible enhancement of therapeutic potential of MSC.J Biomed Biotechnol. 2010;2010: 795385.

引言

衰老是一个以机体逐渐丧失生理功能和对疾病敏感性增加为特征的生物学过程，心脏是机体的重要器官，也是容易衰老的器官。心血管系统随着年龄的增长也会发生衰老改变，主要有以下几方面：①主动脉进行性扩张和延长，管壁僵硬度增加，这是由于管壁弹性组织减少，胶原数量增多造成的。②左室进行性肥厚，心肌细胞数量减少，肌细胞肥大。③左室舒张功能减退。④其他的衰老表现还有瓣膜钙化和返流等。这些衰老改变使老年人的心功能减低，尤其合并器质性心脏病时易发生心力衰竭^[1-4]。

骨髓间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类重要的成体干细胞，具有多种组织修复能力，已广泛用于临床治疗研究。目前认为骨髓间充质干细胞除了具有多向分化潜能，还能在损伤局部反应性分泌碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)^[5-6]，碱性成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子家族成员之一，现已发现有9种成纤维细胞生长因子，但主要为酸性成纤维细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子，它能触发一系列中胚层及神经外胚层来源细胞的增生与分化。研究表明碱性成纤维细胞生长因子能稳定培养细胞的表现型，延缓老化、延长培养细胞的寿命。碱性成纤维细胞生长因子还具有降低抑癌基因p53表达的作用^[7-9]，因此骨髓间充质干细胞治疗衰老心脏的作用机制之一可能与其分泌碱性成纤维细胞生长因子有关。实验采用皮下注射 D-半乳糖制备亚急性衰老大鼠模型，通过尾静脉注射间充质干细胞，观察骨髓间充质干细胞对衰老心脏的影响，探讨骨髓间充质干细胞治疗衰老心脏的可能作用机制。

材料方法

1.1 设计细胞学实验，体内作用对比观察。

1.2 时间及地点实验于2009年9月至2010年4月在贵州医科大学附属医院分子生物学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选用八九周龄清洁级SD大鼠30只用于造模，雌雄各半，体质量为160-180 g；6-8周龄SPF级SD大鼠30只用于细胞培养，体质量为130-140 g，均购自南方医科大学动物实验中心，动物编号：2006A072，动物饲养温度约25 ℃，湿度60%-70%。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 主要试剂及仪器 D-半乳糖(Sigma公司)；Trizol试剂、RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；SYBGREEN(华美生物工程公司)；引物序列由primer 3设计，上海英俊公司合成；Western Blot 所用抗体为Santa Cruz公司；倒置相差荧光显微镜、BI2000图像分析系统(德国Lica公司)；CO₂孵箱(美国Thermo Formo公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；流式细胞仪(美国COULTER公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定 ①细胞的培养：采用贴壁法培养骨髓间充质干细胞，收集大鼠骨髓细胞悬液置于新的离心管中，应用PBS清洗1遍后，1 500 r/min离心10 min，收集细胞待用。得到的细胞加入15 mL 间充质干细胞专用培养基重悬，细胞浓度为(3-5)×10⁹ L^-1，铺于培养瓶中，并置于37 ℃，体积分数为5% CO₂ 培养箱培养。第3-5天可在培养瓶看到贴壁骨髓间充质干细胞，此时采取半量换液，7 d后全量换液。待细胞长至80%左右融合时，0.25%胰酶消化传代至新培养瓶中，待长满后可冻存或继续传代培养。②流式细胞仪检测细胞表面抗原：用0.25%胰酶消化第3代骨髓间充质干细胞，离心洗涤后，制备成2×10⁵/管细胞悬液，制成3个样本，分别加入荧光直标的CD34、CD45、CD29、CD44单克隆抗体，室温避光孵育30 min，再用PBS洗2遍后，1 500 r/min离心5 min，弃上清，重复2次；20 g/L多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

1.4.2 衰老模型的制备选用清洁级SD大鼠，每日皮下注射D-半乳糖400 mg/kg，连续注射3个月建立大鼠衰老模型^[10]。

1.4.3 分组及回输骨髓间充质干细胞实验分3组，每组10只大鼠：①正常空白组，按照SPF动物饲养原则培养，未进行任何干预。②阳性造模组：D-半乳糖皮下注射制作大鼠衰老模型。③治疗组：D-半乳糖皮下注射制作大鼠衰老模型的同时经大鼠尾静脉注射同种异体骨髓间充质干细胞3×10⁶个，每周1次，共4次。

1.4.4 心脏组织病理改变　末次注射后1周，取各组大鼠心脏，分离出左前壁心肌组织制作病理切片，进行苏木精-伊红染色，剩余组织用于蛋白和mRNA检测。

1.4.5 Western Blot检测心脏组织碱性成纤维细胞生长因子蛋白含量取低温保存的大鼠心脏标本，加入组织裂解液，用玻璃匀浆器在冰上匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心10 min。取上清液，小部分用Lorry氏法测定蛋白浓度。取上述制备的上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；全湿式电转法将分离胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，信号用发光剂显影于感光胶片上成像。

1.4.6 Real-time PCR测定心脏中p53 mRNA表达大鼠心脏总RNA采用Trizol法提取，然后采用实时定量-反转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量。反应条件：①Real-time PCR：95 ℃ 5 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 cycles。②Melt curve：95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，60 cycles。PCR反应各管所加模板RNA的量约为1 μg。最终通过Real-time PCR仪记录的Ct值对起始模板相对定量。

1.5 主要观察指标 ①心脏组织的病理改变。②心脏组织碱性成纤维细胞生长因子蛋白及p53 mRNA的表达。

1.6 统计学分析所有数据均以x(_)±s表示，应用SPSS 13.0软件进行组间t 检验。

讨论

随着人民生活水平的提高，中国老年人群的比重逐年增加，老年人群慢性心脏功能减退的比率明显升高。心脏是生命的核心器官，随着年龄的增长，心脏及血管会发生一定程度的形态和功能改变，并较易出现各种心血管疾病^[11-12]。心脏的衰老关系到人类的健康和寿命，正逐渐成为影响国民健康和社会发展的主要疾病^[13-17]。

骨髓间充质干细胞是全身结缔组织的干细胞，骨髓间充质干细胞不仅具有广泛的分化潜能^[18-20]，而且具有移植后不发生排斥反应的特点^[21]。目前认为骨髓间充质干细胞能在损伤局部反应性分泌各种各样的因子^[22-26]，其中包括碱性成纤维细胞生长因子，具有可促进细胞增殖，加快细胞倍增，尤其能够缩短细胞周期G₁期的时间，研究发现碱性成纤维细胞生长因子除了干预细胞凋亡外，还可能通过调控凋亡相关基因的表达而发挥抗凋亡作用，多项研究表明碱性成纤维细胞生长因子通过降低抑癌基因p53的表达，延缓衰老。

实验采用D-半乳糖连续皮下注射3个月造模，过多的D-半乳糖在体内氧化产生大量的自由基超过机体的清除能力，过多的自由基引发脂质过氧化的链式反应，产生大量的脂质过氧化物丙二醛，加重对细胞的损伤，引起代谢紊乱使机体过氧化反应增强引发心脏衰老；实验采用贴壁法培养第4代骨髓来源的间充质干细胞，经流式细胞仪检测CD34，CD45阴性，CD29，CD44阳性，提示第4代贴壁细胞主要是骨髓间充质干细胞。将培养的间充质干细胞通过尾静脉输注衰老组大鼠体内4周后，制作心脏组织病理标本，结果发现，治疗组相对于模型组，能有效改善心肌细胞体积，降低心肌细胞间质内结缔组织增生及脂肪浸润，改善心肌细胞间质的小血管充血状态；与模型组相比，治疗组能够提高碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达、降低p53基因的表达(P < 0.05)，故推测骨髓间充质干细胞可能和心脏细胞相互作用分泌碱性成纤维细胞生长因子、降低p53基因的表达从而具有治疗衰老心脏的作用。