双氢青蒿素抑制胶质瘤干细胞侵袭迁移的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.06.001

摘要/Abstract

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文题释义：

CD133：胶质瘤干细胞标记物CD133是一种跨膜蛋白，于神经胚胎形成早期表达，神经干细胞分化为神经元和胶质细胞后其停止表达，研究表明，从恶性胶质瘤中分离获得的肿瘤干细胞球有CD133阳性表达。CD133阳性细胞具有很强的增殖能力及自我更新能力，CD133阴性细胞呈贴壁生长。

Toll样受体：Toll样受体的表达不仅局限于机体免疫细胞，在分化组织的上皮细胞、女性生殖系统及造血干细胞同样有Toll样受体的表达。近年来，越来越多研究证实在人类肿瘤及肿瘤细胞系同样有Toll样受体的表达，Toll样受体在由癌前病变进展到肿瘤的过程中发挥重要作用。

背景：已有研究表明双氢青蒿素具有促进胶质瘤GL261细胞凋亡的作用，但其对胶质瘤干细胞的作用尚不清楚。

目的：探讨双氢青蒿素抑制胶质瘤干细胞侵袭迁移及其初步机制。

方法：从小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261中分离培养胶质瘤干细胞，免疫荧光检测胶质瘤干细胞的干性特征；Transwell法和实时荧光定量PCR法检测经不同浓度双氢青蒿素处理后胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力的变化，以及Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平。

结果与结论：经分离培养得到胶质瘤干细胞显示干性标记CD133与Nestin；经不同浓度双氢青蒿素处理后，胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力减弱；Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平均降低，并呈剂量依赖性，提示双氢青蒿素具有抑制小鼠胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力，可能与Toll样受体信号通路有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-2407-2159 (吴艳林)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 双氢青蒿素, 胶质瘤干细胞, 侵袭, 迁移, Toll样受体2, 基质金属蛋白酶2, 基质金属蛋白酶9

Abstract:

BACKGROUND: Dihydroartmisinin can promote apoptosis of glioma cells GL261, but its effect on glioma stem cells is still unknown.

OBJECTIVE: To investigate the preliminary mechanism that dihydroartemisinin inhibits migration and invasion of glioma stem cells.

METHODS: Glioma stem cells were isolated from mouse malignant glioma cell lines GL261. Immunofluorescence analysis was conducted to identify the characteristics of glioma stem cells. Migration and invasion abilities of glioma stem cells were analyzed by Transwell assay. The mRNA expressions of Toll-like receptor 2, matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 were examined by real-time fluorescence quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: The characteristics of glioma stem cells were identified by CD133 and Nestin staining. The migration and invasion of glioma stem cells were attenuated by dihydroartemisinin dose-dependently. Moreover, the mRNA expression of Toll-like receptor 2, matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 was also decreased by dihydroartemisinin in a dose dependent manner. These results suggest that dihydroartemisinin inhibits the migration and invasion of glioma stem cells probably through attenuation of Toll-like receptor signaling pathway.

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图/表（结果） 3

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引言

胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的实体肿瘤，在脑肿瘤中占40%-50%^[1]。在中枢神经系统的各种组织学类型肿瘤中，星形胶质细胞起源的恶性胶质瘤具有迅速增殖、强侵袭性和化疗耐受性等特点，致死率高，预后较差，平均生存期约为14.6个月^[2-4]。脑胶质瘤治疗的主要障碍在于复发率高，这与胶质瘤细胞的增殖能力和侵袭性生长有密切关系。胶质瘤干细胞是胶质瘤的起源细胞，具有类似神经干细胞的某些生物学特性，如分化成神经元，表达Nestin、CD133等神经干细胞表面标记物。国外研究表明胶质瘤干细胞移植到非肥胖性糖尿病和重症联合免疫缺陷裸鼠中具有致瘤能力^[5]。胶质瘤干细胞可能是引发胶质瘤并维持其生长的主要细胞来源，在胶质瘤的复发过程中起决定作用。

目前脑胶质瘤的治疗方法主要有手术、化疗与放疗等手段，但均不能取得良好的疗效。采用烷化剂联合化疗的患者2年生存率仅为26.5%，中位生存时间为14.6个月，预后效果仍差强人意，复发率高^[6]。对于恶性胶质瘤患者的手术和放化疗效果仍未得到满意的结果，自患者确诊后的生存期不超过15个月^[7]。在过去的20多年，虽然神经影像学技术和显微外科技术的进步取得巨大的进步，极大地推动了神经外科的发展，但手术仍难以彻底切除肿瘤。手术后辅以放射治疗可以提高胶质瘤的治疗效果，但由于放射剂量的限制和有相当一部分肿瘤对放疗不敏感，大多数肿瘤难免复发^[8]。脑肿瘤干细胞的发现丰富了对胶质瘤发生机制的认识，也为胶质瘤的治疗提供了新模式^[9]。Singh等^[10]从脑肿瘤及其细胞系中分离培养得到脑肿瘤干细胞，并发现这类细胞表达人类干细胞标志物CD133。与其他肿瘤干细胞一样，胶质瘤干细胞也可分化成与原发肿瘤相似的肿瘤细胞表型^[11]。Singh等^[12]从两类具有免疫活性的小鼠模型中提取出肿瘤干细胞，并制备为树突状细胞疫苗，可以强化抗体和T细胞选择性靶向肿瘤干细胞的能力。

双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)作为高效低毒的抗疟药已得到全世界的公认，近年来许多国内外学者研究发现双氢青蒿素可诱导多种细胞发生凋亡，尤其是诱导肿瘤细胞凋亡，因此，双氢青蒿素具有广谱抗癌活性。实验从小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261中分离培养得到胶质瘤干细胞，给予双氢青蒿素干预，用Transwell小室检测各组细胞的侵袭和迁移能力，并通过qRT-PCR检测其Toll样受体2、基质金属蛋白酶2，9 mRNA表达水平，为临床利用双氢青蒿素治疗胶质瘤提供实验依据。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点于2014年2至11月在郑州大学第一附属医院药理实验室完成。

1.3 材料小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261购自美国典型菌株保藏中心(ATCC)；兔抗CD133(台湾Abnova公司)，小鼠抗Nestin (北京中杉金桥生物技术有限公司)，Hoechst33342染色液(美国Invitrogen公司)，胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM/F12培养基(美国HyClone公司)，Transwell小室(美国Millipore公司)，实时荧光定量PCR试剂盒(美国Fermentas公司)，多聚甲醛(碧云天生物技术有限公司)，结晶紫(美国Sigma公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，荧光倒置显微镜(日本Leica公司)，CFX98荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)。双氢青蒿素(南京泽郎医药科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养小鼠恶性胶质瘤细胞系GL261用体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基，置于 37 ℃、体积分数为5%CO2、相对湿度95%的培养箱中培养。将处于对数生长期的细胞按2×103/cm²细胞密度接种于DMEM/F12无血清培养基中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、相对湿度95%的培养箱中培养，3 d后换液，6 d后用胰蛋白酶消化吹打制成单细胞悬液，再次以2×10³/cm²接种于24孔板中。传代3次后的细胞球认为是胶质瘤干细胞^[13]。

1.4.2 免疫荧光检测细胞干性特征收集分离培养得到的胶质瘤干细胞，倾去培养基，PBS洗涤2次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次。加入封闭液封闭 1 h，加入相应一抗置于湿盒中4 ℃孵育过夜，再加入相应二抗，37 ℃孵育1 h；加入Hoechst33342染色液 10 min，PBS洗涤3次，封固，于荧光显微镜下观察。

1.4.3 实验分组将双氢青蒿素溶解于二甲基亚砜中，配置成双氢青蒿素处理液。分组如下：①对照组：采用常规培养基进行细胞培养，不进行任何处理。②溶剂对照组：加入相应体积的二甲基亚砜处理24 h。③药物处理组：常规培养基中加入双氢青蒿素处理液使双氢青蒿素终浓度为10，20 μmol/L，培养24 h。

1.4.4 Transwell侵袭实验分别收集胶质瘤干细胞，离心弃去上清液，调整细胞浓度为2.5×10⁸ L^-1，向已用Matrigel包被的小室底部膜上室面的小室中加入200 μL细胞悬液，并在下室中加入500 μL含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基；将Transwell小室置于37 ℃，体积分数为5%CO₂的培养箱中培养24 h，弃去上室培养液，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤，结晶紫染色5 min，蒸馏水漂洗，用棉签轻轻擦去小室底膜上方的细胞，晾干，将小室置于光学显微镜下观察，计数。

1.4.5 Transwell迁移实验迁移实验操作步骤与侵袭实验基本相同，其中Transwell小室不需要用Matrigel包被。

1.4.6 qRT-PCR检测Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平按照Trizol说明书裂解细胞，使用氯仿提取总RNA，建立反转录反应，引物序列见表1。

扩增条件为：95 ℃ 5 min；93 ℃ 35 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35个循环。反应结束后，标准曲线和扩增曲线由PCR仪器自动生成，用紫外分光光度法测定RNA样品的A_{260 nm}值，并进行定量。将目的基因与内参基因进行比较，得出目的基因相对表达量的变化，所得结果直接在荧光定量操作软件中进行分析比较。

1.5 主要观察指标 ①CD133与Nestin蛋白表达水平。②胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力。③Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平。

1.6 统计学分析各实验结果以x(_)±s表示。方差分析采用Bonferoni(LSD)法进行比较，由SPSS 15.0软件包完成，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

青蒿素及其衍生物作为高效低毒的抗疟药已经得到了很好的临床验证。研究指出双氢青蒿素对乳腺癌、肺癌以及血液系统等肿瘤细胞具有明显地杀灭作用^[14-15]。尹怡等^[16]研究发现双氢青蒿素能够通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、诱导Caspase-3激活途径促进胶质瘤GL261细胞凋亡。已有报道指出双氢青蒿素可以通过血脑屏障，使之在脑内可达到有效的药物浓度，可以用于治疗中枢神经系统肿瘤^[17-18]。胶质瘤干细胞是导致胶质瘤侵袭的重要细胞基础，且对放化疗具有明显的抗性，外科手术无法彻底清除肿瘤细胞^[19]。实验研究发现双氢青蒿素处理后的小鼠胶质瘤干细胞的侵袭和迁移能力显著下降，提示双氢青蒿素可能具有降低胶质瘤复发率的疗效。

研究表明Toll样受体具有促进肿瘤细胞增殖生长和侵袭的作用，抑制肿瘤细胞发生凋亡^[20-22]。多项报道指出Toll样受体在结肠癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞等多种肿瘤细胞中均有表达^[23-25]。有报道发现Toll样受体2可以通过激活NF-κB通路来促进MDA-MB-231乳腺癌细胞发生侵袭，从而导致乳腺癌细胞的迅速扩散^[26]。基质金属蛋白酶具有降解细胞外基质中各种蛋白成分，从而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学障碍，从而促进细胞移动，因此，在肿瘤细胞的侵袭迁移中起关键作用^[27]，其中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的高表达与胶质瘤恶性程度呈正相关^[28]。qRT-PCR检测发现，经双氢青蒿素处理后的胶质瘤干细胞中Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9 mRNA表达水平均显著下降，提示双氢青蒿素抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移的机制可能与Toll样受体2、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9有关，详细机制需要开展进一步实验。

由于恶性脑胶质瘤的浸润性生长特性，肿瘤组织与周围脑组织边界不清，手术治疗完全切除肿瘤组织十分困难。在过去的20多年，神经影像学技术和显微外科技术取得巨大的进步，极大地推动了神经外科的发展，但手术仍难以彻底切除肿瘤^[29]。放疗化疗的不良反应大，部分患者对此不敏感，仍有较高的复发率^[30]。实验发现双氢青蒿素对胶质瘤干细胞具有抑制迁移和侵袭的作用，估计能有效降低肿瘤的复发，因此具有良好的发展前景。