β-酪啡肽7对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病模型大鼠的肾保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.016

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (5): 701-706.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.016

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β-酪啡肽7对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病模型大鼠的肾保护

高燕¹，袁鲁亮²，张海松¹

¹河北大学附属医院肾内科，河北省保定市 071000；²解放军66165部队卫生队，河北省保定市 071000

收稿日期:2015-12-04 出版日期:2016-01-29 发布日期:2016-01-29
通讯作者: 张海松，主任医师，河北大学附属医院肾内科，河北省保定市 071000
作者简介:高燕，女，1976年生，河北省保定市人，汉族，2004年河北医科大学毕业，硕士，副主任医师，副教授，主要从事肾小球疾病及肾小管间质肾病方面的研究。
基金资助:
河北省医学适用技术跟踪项目(GL201311)

Protective effects of beta-casomorphin-7 on renal injury in a rat model with streptozotocin-induced diabetic nephropathy

Gao Yan¹, Yuan Lu-liang², Zhang Hai-song¹

¹Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China; ²Health Team, PLA 66165 Troops, Baoding 071000, Hebei Province, China

Received:2015-12-04 Online:2016-01-29 Published:2016-01-29
Contact: Zhang Hai-song, Chief physician, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
About author:Gao Yan, Master, Associate chief physician, Associate professor, Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei Province, China
Supported by:
the Hebei Province Medical Application Technology Tracking Project, No. GL201311

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

糖尿病肾病：是由多种病因引起以慢性高血糖为特征的代谢紊乱。高血糖是由于胰岛素分泌或作用的缺陷，或者两者同时存在而引起。除碳水化合物外，尚有蛋白质、脂肪代谢异常。常见于病史超过10年的患者。约30%的1型糖尿病和20%-50%的2型糖尿病会发生糖尿病肾病。

链脲佐菌素：是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，是一种DNA烷基化试剂，能通过葡萄糖运转蛋白2葡萄糖转运蛋白独自进入细胞。对胰腺胰岛胰岛素诱发的β-细胞具毒性。链脲佐菌素对葡萄糖运转蛋白2阳性神经内分秘肿瘤细胞有毒性作用。链脲佐菌素可对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病。

背景：研究发现β-酪啡肽7有对糖尿病模型大鼠减轻肾小管上皮细胞的氧化及降血糖的作用，但关于β-酪啡肽7对糖尿病肾病作用机制的研究比较少。

目的：探讨β-酪啡肽7对糖尿病肾病模型大鼠肾损伤的作用。

方法：将30只大鼠随机以n=10等分为对照组、模型组和β-酪啡肽7组。构建糖尿病模型大鼠20只，造模成功后模型组和β-酪啡肽7组模型大鼠腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)，对照组腹腔注射等量柠檬酸液，β-酪啡肽7组模型大鼠给予β-酪啡肽7灌胃30 d，模型组和对照组给予等量生理盐水灌胃。

结果与结论：①与对照组相比，模型组大鼠胰岛素水平降低，血糖、尿糖、尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮水平以及肾脏中Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达水平增加。②与模型组相比，β-酪啡肽7组模型大鼠上述指标明显恢复。表明β-酪啡肽7对糖尿病肾病模型大鼠肾损伤有保护作用。

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ORCID: 0000-0002-1700-5567(张海松)

关键词: 实验动物, 内分泌系统损伤与修复动物模型, 糖尿病, 链脲佐菌素, 糖尿病肾病, β-酪啡肽7, 胰岛素, 肾损伤, 并发症

Abstract:

BACKGROUND: Studies have found that β-casomorphin 7 can lessen oxidation of renal tubular epithelial cells and lower blood sugar in a rat model of diabetes. There is a few studies concerning the effect of β-casomorphin-7 on diabetic nephropathy.
OBJECTIVE: To explore the effects of β-casomorphin-7 on renal injury in a rat model of diabetic nephropathy.
METHODS: The 30 rats were equally and randomly divided into control group, model group and β-casomorphin-7 group. Twenty rat models of diabetes were established. In the model and β-casomorphin-7 groups, rats were intraperitoneally injected with streptozotocin (60 mg/kg). In the control group, rats were intraperitoneally injected with an equal volume of citric acid. Rats in the β-casomorphin-7 group were intragastrically administered β-casomorphin-7 for 30 days. Rats in the model and control groups were given an equal volume of saline by intragastric administration.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, insulin levels decreased, glucagon, blood glucose, urine glucose, urine protein, serum creatinine, serum urea nitrogen levels, mRNA and protein expression levels of type I collagen and type IV collagen in kidney increased in the model group. (2) Compared with the model group, above indexes were apparently recovered in the β-casomorphin-7 group. These findings indicate that β-casomorphin-7 has a protective effect on renal injury in diabetic nephropathy rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

高燕，袁鲁亮，张海松. β-酪啡肽7对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病模型大鼠的肾保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 701-706.

Gao Yan, Yuan Lu-liang, Zhang Hai-song. Protective effects of beta-casomorphin-7 on renal injury in a rat model with streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(5): 701-706.

图/表（结果） 7

2.1 造模成功动物数量及过程 30只SD大鼠分为3组，对照组、模型组、β-酪啡肽7组各10只，全部进入结果分析。

2.2 模型方法的改进实验通过腹腔一次性大剂量注射链脲佐菌素的方式诱导糖尿病，成模率高(100%)，且成活率高，并且易于实验操作。

2.3 模型更接近临床实践模型大鼠出现糖尿病典型的三多一少的症状，食多、饮水多、尿多，与临床实践相类似，而且可持续稳定。

2.4 主要观察结果和次要观察结果

2.4.1 大体情况对照组大鼠的饮水、进食、体质量及精神状态无明显改变，模型组大鼠饮水及进食量增加，体质量下降，精神状态不佳，症状随病程的延长而加重；β-酪

啡肽7组大鼠与模型组相比，饮水及进食量减少，体质量增加，精神状态较好，表明β-酪啡肽7能够改善糖尿病大鼠的一般状况。

2.4.2 血糖由表1可以看出，正常组大鼠血糖维持在正常水平(3.6-5.8 mmol/L)；模型组大鼠的血糖水平明显高于对照组(P < 0.05)；β-酪啡肽7组大鼠血糖水平从造模后10 d时低于模型组(P < 0.05)，但仍高于对照组(P < 0.05)。

2.4.3 胰岛素和胰高血糖素水平由表2可以看出，与对照组相比，模型组大鼠血清胰岛素降低(P < 0.05)，而血清胰高血糖素水平升高(P < 0.05)；而与模型组相比，β-酪啡肽7组大鼠血清胰岛素水平增加(P < 0.05)，而血清胰高血糖素水平增加(P < 0.05)，且两种指标仍与对照组差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4.4 肾脏生化指标由表3可以看出，模型组大鼠尿糖、尿蛋白、血清肌酐和血清尿素氮均高于对照组(P < 0.05)；而β-酪啡肽7组大鼠尿糖、尿蛋白、血清肌酐和血清尿素氮介于对照组和模型组之间(P < 0.05)。

2.4.5 肾脏指数对照组、模型组及β-酪啡肽7组大鼠的肾脏指数分别为6.2%，14%和11.2%，3组差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.4.6 肾脏病理变化

苏木精-伊红染色显示：对照组大鼠肾小球结构正常，未见萎缩、增大，肾小管腔没有明显扩张，上皮细胞无明显水肿、脱落、坏死等情况；模型组大鼠肾小球结构紊乱，细胞增生，肾小管水肿，表明糖尿病大鼠肾脏出现了病理性损伤的表现；β-酪啡肽7组大鼠的肾小球结构接近正常，细胞轻度增生，肾小管轻度水肿，病理改变较模型组有改善(图1)。

Masson染色显示：对照组大鼠肾脏见少量的胶原纤维；模型组大鼠肾脏的相对胶原纤维面积(约7%)明显多于对照组(约1%)(P < 0.05)，表明肾小球和肾小管有胶原纤维沉积；β-酪啡肽7组大鼠肾脏肾小球与肾小管间质中的相对胶原纤维面积(约2%)与模型组相比明显减少(P < 0.05) (图2)。

天狼星红染色显示：对照组大鼠肾脏存在少量的胶原纤维；模型组大鼠肾脏出现大量胶原纤维面积约3.7%，明显多于对照组(约0.6%)(P < 0.05)；β-酪啡肽7组大鼠肾脏的胶原纤维相对面积(约1.4%)较模型组明显减少(P < 0.05) (图3)。

2.4.7 胶原蛋白mRNA及蛋白的表达水平模型组大鼠肾脏Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白mRNA的表达及蛋白均明显高于对照组大鼠，差异有显著性意义(P < 0.05) ，见表4，图4。

β-酪啡肽7组大鼠肾脏Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白mRNA的表达及蛋白明显低于模型组大鼠(P < 0.05)，与对照组接近(P > 0.05)，见表4，图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验在2013年6月至2015年3月在河北大学附属医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雄性SD大鼠30只，鼠龄7周，体质量180-220 g，由河北省动物中心提供，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。实验前饲养于实验室鼠专用鼠笼，12 h日夜交替，自由进食和饮水。实验大鼠经过河北大学附属医院动物伦理学委员会批准。30只大鼠随机等分为对照组、模型组和β-酪啡肽7组。

1.4 方法

1.4.1 造模方法模型组和β-酪啡肽7组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg，美国Sigma公司)^[5-6]，对照组腹腔注射等量柠檬酸液。注射后观察大鼠饮水和进食情况。

1.4.2 造模成功检测标准注射链脲佐菌素72 h后检测大鼠空腹血糖，连续3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L视为糖尿病模型制作成功^[5-6]。血糖仪购自北京怡成生物电子技术有限公司。

1.4.3 β-酪啡肽7灌胃造模7 d后，β-酪啡肽7组大鼠每天给予β-酪啡肽7(7.5×0-6 mol/kg；美国凤凰制药公司) 灌胃^[7-8]，模型组和对照组每天给予等量生理盐水。每天记录大鼠体质量、饮水及进食量，空腹血糖5 d检查一次，末次灌胃后留取大鼠24 h尿液。大鼠肾脏指数=左肾重量(mg)/体质量(g)×100%^[8]。

1.4.4 取材灌胃30 d后，乙醚麻醉，颈静脉采集血液，离心后留取血清，然后处死大鼠，剖腹取出肾脏，称质量后取部分肾脏多聚甲醛固定。

1.4.5 血清及尿液中生化指标测定血清中胰岛素和胰高血糖素采用放射免疫法测定；血清肌酐采用苦味酸法测定，血清尿素氮采用Fearon法测定，尿蛋白采用考马斯亮蓝法测定，尿葡萄糖浓度采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定。试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察大鼠肾脏组织经甲醛固定后，切成3 μm厚切片(德国LEICA公司)，常规进行脱蜡、水洗、苏木精染色、盐酸乙醇分化、清水浸泡、伊红染色、脱水、封固后，光镜(日本奥林巴斯公司)下观察大鼠肾脏组织学形态。

1.4.7 Masson纤维染色 Masson纤维染色主要观察肾脏纤维化程度^[9]。大鼠肾脏切片经苏木精-伊红染色，冲洗后，丽春红染色(南京建成生物工程研究所)，冲洗，磷钼酸分色，亮绿蓝染色，乙醇冲洗，中性树脂封固。高倍镜下每个切片选取10个视野进行观察，计算每个视野胶原纤维绿染区/视野面积值，结果取平均值。

1.4.8 天狼星红染色天狼星红染色反应大鼠肾脏纤维化情况^[10]。大鼠肾脏切片经波恩氏液固定，流水冲洗，天狼星红(美国Sigma公司)染色，冲洗，苏木精染色，脱水，中性树脂封固。高倍镜下每个切片选取10个视野进行观察，计算每个视野胶原纤维红染区/视野面积值，结果取平均值。

1.4.9 实时PCR分析取各组大鼠肾脏组织进行检测。组织匀浆器由瑞士Kinematica AG公司提供。Trizol试剂盒由Takara公司提供。引物由Primer 5.0 软件设计引物，Ⅰ型胶原蛋白的上游引物为5’-TAC AGC ACG CTT GTG GTT G-3’，下游引物为5’-TTG GGA TGG AGG GAG TTT A-3’，产物长度190 bp；Ⅳ型胶原蛋白的上游引物为5’-GGT CAC TTT CAC TGG TTG ACG A-3’，下游引物为5’-TTG AAT ATC AAA CAC GCA AGG C-3’，产物长度201 bp。引物由上海英俊技术有限公司合成。总RNA采用一步抽提法抽取，经反转录成cDNA，转录的cDNA用实时PCR法进行分析。垂直板电泳槽、半干转印仪、Versa Doc成像系统由美国Bio-Rad公司提供。荧光定量PCR仪由美国ABI公司提供。

1.4.10 Western-blot分析将各组大鼠肾脏组织加入RIPA裂解液，冰上匀浆，离心(德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG)后取上清液，加入蛋白上样缓冲液使其变性，经浓缩胶和分离胶分离电泳后取目的蛋白凝胶转印到PVDF膜，PVDF膜转印完成后漂洗，脱脂奶粉封闭，加兔抗Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白(美国Bioworld公司)，孵育完成后对图像进行采集和处理，以GAPDH为内参，结果以目的条带与GAPDH的吸光度比值表示。

1.5 主要观察指标大鼠血糖、胰岛素、胰高血糖素水平、肾脏病理变化及胶原蛋白mRNA和蛋白的表达水平。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，结果以x(_)±s表示，采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

糖尿病肾病严重影响糖尿病患者的生活质量。糖尿病肾病的治疗包括：①饮食疗法^[11]。②控制血糖：包括降糖药和胰岛素^[12]。③控制血压：控制血压可以保护肾功能^[13]。④控制血脂^[14]。⑤中医治疗：中医辨证治疗可以保护肾脏功能，延缓或阻止病情发展^[15-17]。⑥终末肾病的治疗：包括肾脏透析和器官移植^[18-19]。糖尿病肾病的早期病变是可逆的，病情进入中晚期肾脏的损害很难逆转。糖尿病肾病的发病机制比较复杂：①血流动力学改变^[20-24]：肾素-血管紧张素系统被认为是糖尿病肾病肾损伤的主要原因，通过多种途径参与糖尿病肾病的病理变化。②非酶糖基化^[25-27]：非酶糖基化可以诱导糖尿病肾病的许多病理变化，造成肾小球硬化。③氧化应激^[28-29]：糖尿病患者代谢紊乱，氧自由基生成过多，同时糖尿病肾病产生过多的活性氧，炎性细胞因子、生长因子等多种因素也导致活性氧的生产增加，NADPH氧化酶抑制剂可以减少氧化应激，防止肾小球硬化，延缓糖尿病肾病的发生发展。④多元醇通路激活^[30-31]：醛糖还原酶通过转化生长因子β1、活性氧和非酶糖基化在糖尿病肾病肾脏的病理变化中发挥作用。⑤细胞因子^[32]：细胞因子均有调节细胞免疫和炎症反应的作用，糖尿病肾病的发病机制之一是大量细胞因子的激活，转化生长因子β通过Nrf2调节血管紧张素的表达^[33-36]；血管内皮生长因子及其受体对血管的生成和调控起重要作用^[37-39]；肿瘤坏死因子介导炎症反应引起肾脏损害^[40]。⑤炎症因子：炎症因子可以增加毛细血管通透性，诱导内皮细胞凋亡，引起肾脏损伤^[41-44]。

β-酪啡肽7可以从多个环节减少糖尿病高血糖对机体的损害。β-酪啡肽7有7个氨基酸组成，为牛乳酪蛋白的降解产物，可以影响肠道的分泌和运动功能，在肠道内被吸收后可以发挥免疫调节作用，抑制下丘脑促性腺激素释放激素的分泌影响生殖内分泌功能，作为阿片活性物质可以增加动物的采食量以及镇静镇痛作用，能够促进神经元的生长和修复。在糖尿病方面：β-酪啡肽7能够降低葡萄糖的转运，抑制在小肠内的吸收，降低血糖，机制可能为下调葡萄糖转运蛋白的表达，降低酶的活性，增加葡萄糖的消耗。在糖尿病大鼠实验中发现β-酪啡肽7可以降低氧化应激反应，降低血糖水平^[4]，能够抑制胰高血糖素分泌，促进胰岛素分泌，降低机体对氧化应激水平^[45]，并通过氧化应激减轻糖尿病大鼠的心肌损伤，改善糖尿病大鼠的心脏功能。此次实验用链脲佐菌素诱导建立大鼠糖尿病肾病模型，研究β-酪啡肽7对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的作用。结果发现：模型组大鼠出现糖尿病肾病相关的临床症状及糖尿病肾病的肾脏病理变化，β-酪啡肽7可以缓解糖尿病肾病大鼠多饮多食、体质量减轻等糖尿病症状，可以降低血糖水平，降低血清胰岛素水平，升高胰高血糖素水平；降低血清肿瘤坏死因子α水平；减轻肾脏的病理损伤，改善相应的血清学指标；模型组大鼠出现Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白及其mRNA的表达明显升高，肾脏纤维化程度明显增加，β-酪啡肽7可以减少肾脏Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白及其mRNA的表达，减少胶原纤维沉积所致的肾脏纤维化程度。

综上所述，β-酪啡肽7对糖尿病肾病大鼠的肾脏由保护作用，可以改善其肾功能的损害，减轻肾脏纤维化程度。本实验以链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病肾病损伤模型，探讨β-酪啡肽7对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的保护作用。为生物活性物质β-酪啡肽7的开发利用提供实验依据，也为探寻糖尿病肾病发病的新机制和防治的新策略提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

β-酪啡肽7对链脲佐菌素诱导糖尿病肾病模型大鼠的肾保护

Protective effects of beta-casomorphin-7 on renal injury in a rat model with streptozotocin-induced diabetic nephropathy

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