树脂水门汀口腔黏结材料SuperBond C&B的体外细胞毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.007

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

口腔黏结技术：指的是利用一定的粘接剂，将各种修复材料直接贴附于患者牙齿的缺损部位或者需要修补的牙体硬组织部位，以实现在不磨切或者尽可能少磨切自然牙体组织的情况下，对牙齿缺损或者牙齿硬组织缺损进行有效修复。

细胞毒性：是由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机制。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法、LDH的方法及其他酶方法(如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等)。

背景：口腔黏结材料长期与牙体组织、牙龈组织及口腔中唾液相接触，所以必须具备生物安全性、低细胞毒性或无细胞毒性等特点，保证对口腔黏膜无刺激，与人体组织接触不会发生毒性及过敏反应等。

目的：观察口腔黏结材料SuperBond C&B超级粘接剂的体外细胞毒性。

方法：取对数期人牙周膜成纤维细胞，以1.0×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种在96孔板上，100 μL/孔，常规培养24 h弃上清，分组培养：实验组加入90 μL DMEM培养液+10 μL SuperBond C&B超级粘接剂浸提液，阴性对照组加入100 μL培养液，阳性对照组加入100 μL苯酚溶液。培养72 h后，利用锥虫蓝排斥实验计算各组细胞存活率。

结果与结论：实验组、阴性对照组细胞存活率均高于阳性对照组(P < 0.05)，实验组与阴性对照组细胞存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明SuperBond C&B超级粘接剂无细胞毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0003-3247-8327(江先敏)

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 口腔黏结材料, 树脂水门汀, 人牙周膜成纤维细胞, 锥虫蓝排斥实验, 细胞毒性

Abstract:

BACKGROUND: Because of long-term contact with tooth tissues, gingival tissues and saliva in the mouth, oral bonding materials must have the characteristics of biological safety and low or no cytotoxicity, so as to ensure no irritation response to the oral mucous and no toxicity and allergic reactions when contacting with human tissues.
OBJECTIVE: To observe the in vitro cytotoxicity of an oral bonding material, SuperBond C&B.
METHODS: The logarithmic human periodontal ligament fibroblasts were obtained and inoculated in 96-well plates with a cell concentration of 1.0×108/L, 100 μL/hole. Supernatant was removed after 24 hours of routine culture, and the specimens were grouped and cultured. 90 μL DMEM culture liquid+10 μL SuperBond C&B were added in the experimental group. 100 μL medium was added in the negative control group. 100 μL phenol solution was added in the positive control group. After 72 hours of culture, the cell survival rate in each group was calculated by trypan blue exclusion test.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell survival rates of the experimental group and the negative control group were higher than that of the positive control group (P < 0.05), and there was no significant difference between the experimental group and the negative control group (P > 0.05). These results show that SuperBond C&B has no cytotoxicity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

江先敏，赵曦. 树脂水门汀口腔黏结材料SuperBond C&B的体外细胞毒性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(3): 341-345.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7至9月在四川省德阳市人民医院实验室完成。

1.3 材料收集因正畸或阻生拔除的废弃人牙齿，患者年龄12-29岁，平均(16.65±8.25)岁，入选患者均无牙周炎或尖周炎及龋坏等。在患者拔牙之后，立即在无菌环境下，利用添加抗生素的生理盐水对牙根部进行反复冲洗。冲洗结束后，利用手术刀刮去牙根中2/3处的牙周膜，并移入离心管内进行妥善保存。患者及其监护人均对实验情况知情，并签署知情同意书。

主要试剂与仪器：相差显微镜(日本Olympus公司)；DMEM培养基、小牛血清(美国Hyclone公司)；PBS、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胶原酶(上海弘顺生物科技有限公司)；锥虫蓝试剂(上海恒远生物科技有限公司)；青霉素(广州白云山天心制药股份有限公司)；链霉素(石药集团中诺药业(石家庄)有限公司)；二氧化碳孵箱(力新仪器上海有限公司)；丙酮、苯酚(广州速聚生物科技有限公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；ABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。

实验过程中所使用的超级粘接剂Super Bond C&B套装由日进齿科材料(昆山)有限公司提供，规格型号：聚合粉(L-Type，透明)；催化剂0.7 mL；单体10 mL；聚合粉(L-Type，不透明，象牙色)；绿色表面处理剂5 mL；红色表面处理剂5 mL；海棉球1盒；温度调盘(1个)；量勺、毛刷柄、毛刷等。

1.4 实验方法

人牙周膜成纤维细胞原代培养^[5]：利用PBS冲洗人牙周膜，连续冲洗2次之后添加5 mL胰蛋白酶和胶原酶，于37 ℃条件下振荡。连续消化0.5-1.0 h之后置于显微镜下进行观察，如果可观察到组织呈现出松散状态，大部分细胞均发生游离时，利用吸管进行机械吹打，使其彻底分散。吹打结束之后，利用190目筛对获得的细胞悬液进行过滤和收集，1 000 r/min离心10 min，去掉上清，添加含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基，并进行充分吹打和血细胞计数板计数。将细胞接种在培养瓶中，添加包含小牛血清和青霉素链霉素的DMEM培养基，并置于二氧化碳孵箱中进行培养。观察细胞生长状态，待细胞贴壁生长之后，隔日进行换液，置于镜下进行观察。

人牙周膜成纤维细胞传代培养：观察细胞生长状态，待细胞长满单层之后进行传代培养。使用胰蛋白酶对细胞进行消化，利用人牙周膜成纤维细胞和上皮细胞细胞对胰蛋白酶敏感性的不同对细胞进行分离。胰蛋白酶消化成纤维细胞速度较快，经消化之后首先弃去原培养基，利用PBS进行洗涤，然后添加胰蛋白酶，置于相差显微镜下进行观察。若干分钟之后可观察到大部分牙周膜成纤维细胞出现收缩，与瓶壁发生分离，对分离的细胞进行收集，并利用新的培养瓶，添加新的培养液对其进行接种培养。

人牙周膜成纤维细胞鉴定：取第4代人牙周膜成纤维细胞，每24 h对3孔进行计数，获得平均值。连续观察8 d，根据数据结果描绘人牙周膜成纤维细胞的体外生长曲线。利用免疫组化染色法进行细胞来源鉴定，取培养第4代人牙周膜成纤维细胞，接种于置有盖玻片的培养皿中，观察细胞生长情况，待长至半满时将玻片取出，利用丙酮进行固定并吹干。利用ABC免疫组化试剂盒对波丝蛋白、角蛋白进行染色，严格按照试剂盒说明书进行操作，并置于光镜下对不同蛋白质的染色情况进行观察。

材料浸提液的制备：按10 g/L的比例将SuperBond C&B超级粘接剂材料与细胞培养液进行混合，无菌条件下进行浸提，48 h后收集浸提液。

体外细胞毒性实验：取对数期人牙周膜成纤维细胞进行锥虫蓝排斥实验，添加胰酶进行消化，获得细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10⁸ L^-¹。将细胞悬液接种在96孔板上，100 μL/孔，并置于二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为湿度95%、37 ℃、体积分数5%CO₂。继续培养24 h，观察细胞生长情况，待细胞完全贴壁生长之后，去掉上清，进行分组处理：实验组以100 μL人牙周膜成纤维细胞悬液+90 μL DMEM培养液+10 μL SuperBond C&B超级粘接剂浸提液培养，阴性对照组以100 μL人牙周膜成纤维细胞悬液+100 μL DMEM培养液培养，阳性对照组以100 μL人牙周膜成纤维细胞悬液+100 μL苯酚溶液培养。均置于二氧化碳培养箱中进行培养，培养条件为湿度95%、37 ℃、体积分数5%CO₂。连续培养72 h，取各组细胞制备细胞悬液90 μL，细胞浓度为1.0×10⁸ L^-¹，分别添加10 μL 0.4%锥虫蓝溶液，充分混合均匀，反应2 min后，置于倒置相差显微镜下见观察，进行活细胞和死细胞计数，并计算。各组人牙周膜成纤维细胞存活率计算方法为：人牙周膜成纤维细胞存活率=活细胞总数÷(活细胞总数+死细胞总数)×100%。一共进行6次计数，取平均值作为最终的结果。

1.5 主要观察指标人牙周膜成纤维细胞细胞培养形态；人牙周膜成纤维细胞细胞角蛋白、波形丝蛋白免疫组化染色结果；人牙周膜成纤维细胞体外生长情况；人牙周膜成纤维细胞存活率。

1.6 统计学分析实验过程中获得的相关数据均利用统计学软件SPSS 19.0进行处理分析。其中人牙周膜成纤维细胞存活率予以 t 检验，将不同数据经统计学比较差异存在统计学意义的标准设定为P < 0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

口腔黏结技术利用粘接剂，将各种修复材料直接贴附于患者牙齿的缺损部位或需要修补的牙体硬组织部位，可实现对各种牙齿缺损或者牙齿硬组织缺损的有效修复^[6-8]。在治疗过程中，需要用到各种口腔粘接材料^[9-12]。SuperBond C&B超级粘接剂即为一种常用的口腔黏结材料，属于树脂水门汀材料^[13-14]。SuperBond C&B超级粘接剂具有十分出色的抗拉伸强度，被广泛应用于各种类型的口腔黏结治疗之中^[15]。SuperBond C&B超级粘接剂以4-META/MMA为粘接单体，属于纯树脂型多功能粘接剂，在使用过程中可形成耐冲击力极强的粘接层，以更好地满足人体口腔环境的要求^[16]。临床可用来对若干狭小区域病例进行治疗，例如松动牙的直接粘接固定及粘接树脂牙进行牙列缺损修复治疗等^[17-19]。但口腔粘接材料需要长期与患者的口腔接触，受到人体口腔特殊环境的影响，对相应的材料在细胞毒性及生物相容性方面有着极高的要求^[20]。生物相容性指的是不同材料和其所处环境之间的相互作用，在牙科学与其他医学领域(如矩形学、心脏学、血管生物学)，对材料生物相容性的关注程度极高^[21]。当今，在任何生物材料的研制中，不但要考虑材料的强度、美观或功能，还要考虑其生物相容性。另外，当材料在体内行使更复杂的功能较长时间时，对合适生物反应的要求随之增加^[23-24]。只有保证良好的生物相容性、较低的细胞毒性及无细胞毒性，才能保证材料在特定的环境中及不同部位，在与宿主发生直接或者间接接触时，可以保持较为稳定的状态，不被排斥或破坏，更不会产生不良影响。

为了保证口腔黏结材料的生物相容性，提高治疗效果，可积极采用体外细胞毒性实验方式对其进行检测^[25]。实验必须明确的是，细胞毒性实验只是对材料生物相容性的一个方面进行分析，并不能完全代表实际应用情况。与原代培养的细胞进行比较，已建成系的细胞株的细胞种类、形态更为单一，在增殖能力及代谢能力等方面也呈现出更强大的情况。此次实验中，在进行体外细胞毒性实验的过程中，采用体外组织细胞培养的方式，对不同材料环境下细胞的生长状态等进行观察和评价，以评估材料的细胞毒性等。临床对各种口腔黏结材料进行生物相容性评估的过程中，即可以采用不同的体外细胞毒性实验，目前可以采用的方法有很多^[26-27]。Gioka等^[28]利用DNA合成测试法和MTT(噻唑蓝)比色法评估生理盐水浸提介质中光固化及化学固化两种黏结剂的细胞毒性和生物相容性。检测过程中，通过对不同条件下人牙龈纤维细胞的成活力及增殖情况的观察，分析两种黏结剂的细胞毒性。经实验发现，两种黏结剂均不具有细胞毒性。Kaga等^[29]选择使用压液相色谱法报道牙本质粘接树脂中单体的存在是有细胞毒性的。

在进行体外细胞毒性实验时，可以通过对牙周膜成纤维细胞生长情况及存活情况等的观察来了解不同材料的细胞毒性^[30-32]。此次实验中，即选择利用人牙周膜成纤维细胞进行实验。实验过程中，通过对第4代人牙周膜成纤维细胞进行免疫组化染色，观察波形蛋白丝和角蛋白的染色情况。其中，波形蛋白丝存在于中胚层来源细胞中，例如各种来源的成纤维细胞等^[33]；角蛋白属于纤维状蛋白质，具有结缔功能及保护功能，主要分布于上皮细胞中^[34-35]。通过对两种蛋白质染色情况的观察，可以对上皮细胞和牙周膜成纤维细胞予以很好地区分和鉴定^[36]。实验中经染色和观察发现，染色角蛋白胞浆无染色，呈阴性；波形丝蛋白经染色胞浆呈现出棕黄色，呈阳性，即表明实验所获得的细胞来源于中胚层，属于纤维细胞，且未出现上皮源性细胞污染情况。实验过程中还通过连续观察和细胞计数，描绘出人牙周膜成纤维细胞的体外生长曲线。经观察可以，发现曲线呈“S”形，在接种后的第一二天，细胞呈现出缓慢增殖的情况，曲线平缓上升；接种第3天之后，细胞出现快速增殖，曲线变得陡峭，分析与细胞进入对数生长期，增殖速度较快有关；接种第七八天，胞增殖速度变缓，细胞生长进入平台期。上述结果表明，实验所获得人牙周膜成纤维细胞具有良好的生长活性，可以很好地满足后续实验的需求。此次实验过程中，选择利用锥虫蓝排斥实验进行SuperBond C&B超级粘接剂材料的细胞毒性。锥虫蓝排斥实验所依据的原理为：当细胞受到各种因素的影响，出现损伤甚至死亡时，锥虫蓝染色剂便可以通过透变性的细胞膜，与已经解体的DNA发生结合，并对其予以着色^[37-39]。于是，通过对染色结果的观察，便可以较为直观地了解到不同细胞的存活情况^[40]。本次实验过程中，经体外细胞毒性实验发现，阴性对照组和实验组人牙周膜成纤维细胞存活率均显著高于阳性对照组，但阴性对照组和实验组人牙周膜成纤维细胞存活率比较差异无显著性意义。结果表明，SuperBond C&B超级粘接剂经体外实验无细胞毒性，可以满足口腔材料临床应用的生物相容性要求。

但受到复杂口腔环境等因素的影响，单纯的体外细胞毒性实验分析并不能完全代表各种材料的临床应用效果。而且，实际情况下，牙周组织包含多种细胞类型，并非含有牙周膜成纤维细胞，而且在体内状态下，材料与组织的接触极其所产生的反应等十分复杂。因此，通过此次实验虽然初步获得SuperBond C&B超级粘接剂经体外实验无细胞毒性，可以满足口腔材料临床应用的生物相容性要求的结论，但关于材料的具体临床应用效果，还需要进一步的体内或者动物实验予以更加全面、客观的评估。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程