根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞的生物学行为比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.020

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (1): 113-117.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.020

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞的生物学行为比较

赵璐，于莉，袁萍，周春梅，吴佩玲

新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063

收稿日期:2015-11-03 出版日期:2016-01-01 发布日期:2016-01-01
通讯作者: 吴佩玲，硕士，主任医师，博士生导师，新疆医科大学第二附属医院口腔科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830063
作者简介:赵璐，女，1990年生，山西省晋城市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔基础研究和牙体牙髓病学研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2015211C107)

Stem cells from the apical papilla versus periodontal ligament stem cells: biological behaviors

Zhao Lu, Yu Li, Yuan Ping, Zhou Chun-mei, Wu Pei-ling

Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2015-11-03 Online:2016-01-01 Published:2016-01-01
Contact: Wu Pei-ling, Master, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhao Lu, Studying for master’s degree, Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830063, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2015211C107

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

根尖乳头干细胞：2006年由Sonoyam 等自人根尖尚未形成的第三磨牙牙根部分离出成体干细胞，并命名为根尖乳头干细胞。与牙髓干细胞比较，根尖乳头干细胞有着更高的溴脱氧尿苷吸收率，更强的增殖能力及端粒酶活性和细胞迁移能力，其可能是一种比牙髓干细胞更早期、更优越的牙源性干细胞的资源，在牙髓再生和组织工程运用中具有广阔的应用前景。

牙周膜干细胞：自人牙牙周膜处分离出的成体干细胞，与根尖乳头干细胞、牙髓干细胞、牙囊干细胞共同位于牙根尖端部。牙周膜干细胞是牙周组织再生最可靠的种子细胞，具有向其他类型组织细胞分化的能力，体外矿化诱导时，牙周膜干细胞能分化为成骨样细胞。牙周膜干细胞是牙周缺损细胞治疗和基因治疗重要的细胞学基础，是近年来牙周病研究的热点之一。

背景：根尖乳头干细胞是一种新发现的间充质干细胞，其能否应用于牙根再生是目前研究的关键。

目的：体外培养鼠根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞，研究比较两者生物学行为，为根尖乳头干细胞用于牙根再生的可能性提供实验依据。

方法：取幼鼠根尖尚未发育完全的健康下颌牙，用酶消化法获得根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞，免疫荧光法鉴定干细胞表面标志物，MTT法测定细胞生长曲线，茜素红染色观察细胞矿化结节形成情况。

结果与结论：①鼠根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞均呈STRO-1强阳性表达，根尖乳头干细胞呈CD90强阳性表达而CD146阳性表达稍弱，牙周膜干细胞呈CD146强阳性表达而CD90阳性表达稍弱。②根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞吸光度值随着时间的递增呈现出增高的状态，第8天起趋于平稳。自第4天起根尖乳头干细胞的增殖活力明显强于牙周膜干细胞，差异有显著性意义(P < 0.05)。③与牙周膜干细胞相比，根尖乳头干细胞染色明显较深，可推测矿化结节形成数量较多。④结果表明与牙周膜干细胞相比，根尖乳头干细胞具有较强的增殖活性和矿化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-4293-4392(吴佩玲)

关键词: 干细胞, 培养, 根尖乳头干细胞, 牙周膜干细胞, 牙乳头, 生物学行为, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells from the apical papilla are a new kind of mesenchymal stem cells, and whether it can
be used in root regeneration is the key to the present study.
OBJECTIVE: To culture rat stem cells from the apical papilla and periodontal ligament stem cells in vitro, and to compare the biology behaviors of these two kinds of cells, thereby providing experimental basis for the application of stem cells from the apical papilla in root regeneration.
METHODS: The apical papilla, as well as the periodontal ligament tissues from the healthy mandibular teeth of young rats were digested and cultured. Immunophenotypes of stem cells from the apical papilla and periodontal ligament stem cells were detected by immunofluorescence technique. Then, cell growth curves were determined by MTT method and mineralized nodule formation was observed by alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Stem cells from the apical papilla and periodontal ligament stem cells were both positive for STRO-1. Stem cells from the apical papilla were positive for CD90 and weakly positive for CD146. Periodontal ligament stem cells were positive for CD146 and weakly positive for CD90. The absorbance values of stem cells from the apical papilla and periodontal ligament stem cells increased with the increasing of time and became stable at 8 days. Since the 4th day, the proliferation capacity of stem cells from the apical papilla was significantly stronger than that of periodontal ligament stem cells (P < 0.05). Both of stem cells are visible to have mineralized nodule formation. Compared with the periodontal ligament stem cells, stem cells from the apical papilla were stained obviously deeper and had more mineralized nodules. These results show that stem cells from the apical papilla have stronger proliferation capacity and mineralization ability than periodontal ligament stem cells.

中图分类号:

R394.2

赵璐，于莉，袁萍，周春梅，吴佩玲. 根尖乳头干细胞与牙周膜干细胞的生物学行为比较[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(1): 113-117.

Zhao Lu, Yu Li, Yuan Ping, Zhou Chun-mei, Wu Pei-ling . Stem cells from the apical papilla versus periodontal ligament stem cells: biological behaviors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(1): 113-117.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3至7月在新疆医科大学科技楼干细胞实验室完成。

1.3 材料 4周龄Wistar大鼠5只，体质量(60±5) g，饲养级别为清洁级，口腔牙周牙体状况良好，遗传背景清楚明确，由新疆医科大学动物饲养中心提供。实验中对动物的处理方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求^[7]。

1.4 实验方法

1.4.1 鼠根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的分离培养和鉴定参照文献[8]的方法取幼鼠根尖尚未发育完全的健康下颌牙，用含1%双抗的PBS反复冲洗，在无菌条件下钝性分离根尖部的牙乳头组织，再用刮匙刮取牙根中部1/3的牙周膜组织，剪碎后分别置于15 mL离心管中，加入3 g/L Ⅰ型胶原酶，37 ℃恒温水浴消化50 min，持续振荡至完全消化；800 r/min离心5 min，弃上清液，加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，分别均匀接种到10 cm²培养皿中，在37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下培养，每隔3 d换液。观察到细胞接近融合时，消化、传代。采用免疫荧光法鉴定STRO-1、CD146、CD90的表达，确定两者的干细胞特性。

1.4.2 细胞生长曲线的测定分别选取第2代根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的单细胞悬液，各以2×10³/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，设调零孔。每孔加入150 μL的培养液，放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。连续10 d在规定的时间点加入MTT液20 μL，37 ℃继续培养4 h，去除剩余培养液，加入150 μL二甲基亚砜，持续振荡，酶标仪检测波长为570 nm的各孔吸光度值，连续检测 10 d，以时间为横轴、吸光度值为纵轴绘制生长曲线图。

1.4.3 细胞矿化实验分别选取第3代根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的单细胞悬液，以1×10⁵/孔的密度接种于6 孔板。倒置显微镜下观察细胞大部分融合时加入矿化液继续培养。每3 d吸去剩余培养基，分别加入各培养液继续培养，于矿化3周后，终止培养，PBS冲洗3次，使用40 g/L多聚甲醛固定30 min，1%茜素红染色20 min，PBS冲洗3次，观察矿化结节形成情况并拍照。

1.5 主要观察指标 ①根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的形态及表面标志物表达。②不同时间点根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的增殖活性。③根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞的矿化结节形成情况。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件对数据进行两样本t 检验，数据以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

众所周知，当年轻恒牙发生牙髓坏死或根尖周病变时，临床上一般使用氢氧化钙以达到根尖诱导的目的。然而，应用氢氧化钙进行根尖诱导在不同病例上获得的效果不一。研究发现年龄小、病史较短的患牙的治疗效果较年龄偏大、病史稍长的患牙的治疗效果好。前者可观察到根尖部有新的硬组织形成，根尖孔闭合，而后者即使有硬组织形成但根尖孔闭合欠佳。究其原因可能是病史较长的患牙根尖部形成硬组织的细胞受到破坏^[9-15]。临床上也有采用无机三氧化聚合物来进行根尖屏蔽，其效果虽有硬组织形成但不能增加管壁的厚度和抗力性^[16]。近年来许多临床病例发现，年轻恒牙发生根尖周炎后，通过清理根管，刺激根尖区组织出血等治疗，封闭数月后可观察到根尖部分有新的硬组织形成，根尖孔闭合，牙根变长。这与传统上认为发生根尖周炎症的患牙牙髓全部坏死，牙根停止发育显然不符。有学者认为年轻恒牙根管附近一定有能促进牙根继续发育的因素存在，并提出了“血管重建假说”：年轻恒牙由于其宽大的根管腔和通畅的血液循环，使得在根尖周病变发生时，根端也许仍有部分干细胞存活，并可继续再生牙髓及根尖成形^[17-22]。根尖乳头干细胞的问世正好证实了这一假说，其具有的高度增殖能力、自我更新能力和多向分化的潜能迅速使其成为牙本质再生及牙根发育的焦点^[23-24]。但由于根端组织涉及的干细胞非常多，如牙髓干细胞^[25-26]、根尖乳头干细胞、牙囊干细胞^[27]、牙周膜干细胞等^[28-32]，故还无法完全确定。此研究体外培养鼠根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞，并对比两者增殖能力和矿化能力，得出根尖乳头干细胞较牙周膜干细胞有较强的克隆形成能力与矿化能力。

种子细胞是组织工程学的研究热点，它的选择往往直接影响到牙髓牙本质的再生。目前寻找具备较强增殖活性和分化能力的种子细胞，是牙组织工程的重要课题^[33-40]。该研究发现与牙周膜干细胞相比，根尖乳头干细胞具有较强的增殖活性和矿化能力，进一步为根尖乳头干细胞作为牙根再生的种子细胞提供实验依据。但由于涉及的实验对象为Wistar大鼠，且仅观察根尖乳头干细胞短期的生长活性和矿化能力，无法判断其长期的根尖成形效果，故根尖乳头干细胞促使人牙再生的长期效果，还需进一步进行大量的实验研究和临床试验。

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Stem cells from the apical papilla versus periodontal ligament stem cells: biological behaviors

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