人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中肿瘤干细胞的培养分化及增殖侵袭能力分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.010

摘要/Abstract

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文题释义：

肿瘤干细胞：肿瘤组织中存在一类特殊的细胞，此类细胞具有很强分化和增殖能力，并与肿瘤的增殖和侵袭转移等过程存在密切的联系。实验已从人食管癌细胞株KYSE-150及TE-1中分离培养出具有肿瘤干细胞特性的细胞球。

侵袭转移：侵袭指肿瘤细胞的直接扩散，从原发部位经组织间隙、淋巴管、血管、体腔或脊髓腔不断地向附近器官、组织扩散，累及邻近器官；转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤主体，在与原发肿瘤不相连或较远部位组织器官继发生长出的一个或多个肿瘤。

背景：研究发现，食管癌组织中存在一类细胞亚群，具有一定的侵袭和转移性能，与治疗效果之间存在十分密切的联系。

目的：从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球，并对其增殖和侵袭能力进行分析。

方法：运用无血清培养基培养KYSE-150、TE-1细胞，观察细胞球的生成情况，采用MTT法以及Transwell小室实验检测细胞的增殖情况和侵袭能力，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。

结果与结论：①KYSE-150、TE-1细胞在无血清培养条件下可以获得稳定传代的细胞球。②细胞球的增殖能力和侵袭能力均显著高于亲本细胞(P < 0.05)。③TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的CD44⁺、CD271⁺、CD44⁺CD271⁺细胞比例均显著高于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞(P < 0.05)。④实验结果提示，从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离出具有肿瘤干细胞特性的细胞球，具有很强的增殖和侵袭转移能力，且CD44和CD271可以作为重要的食管癌干细胞表面标志物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0001-9858-4312(王永连)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 食管癌, KYSE-150细胞株, TE-1细胞株, 肿瘤干细胞, 诱导分化, 细胞球, 增殖, 侵袭

Abstract:

BACKGROUND: There is a certain cell subset in esophageal cancer tissues, with certain invasive and metastatic properties, which is closely related to the clinical therapeutic effect on tumors.
OBJECTIVE: To isolate tumor stem cell spheres in human esophageal carcinoma cell lines KYSE-150 and TE-1 and to analyze their proliferation and invasion ability.
METHODS: KYSE-150 and TE-1 cells were cultured in serum-free medium to observe the formation of cell spheres. Cell proliferation and invasion were detected using MTT and Transwell chamber culture. Surface markers of cells were detected using flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell spheres that were stably subcultured were obtained from KYSE-150 and TE-1 cells cultured in serum-free medium. The proliferation and invasion abilities of cell spheres were significantly stronger than those of parent cells (P < 0.05). The number of CD44+, CD271+ and CD44+CD271+ cells in TE-1 and KYSE-150 cell spheres was significantly higher than that in the TE-1 and KYSE-150 parent cells (P < 0.05). These experimental results show that cell spheres isolated from human esophageal carcinoma cell lines TE-1 and KYSE-150 have tumor stem cell properties as well as strong proliferation and invasion abilities. And moreover, CD44 and CD271 can be used as important surface markers of esophageal carcinoma stem cells.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7至8月在新乡医学院第一附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞株人食管癌细胞株KYSE-150和人食管癌细胞TE-1由上海北诺生物科技有限公司提供。

1.3.2 主要试剂与仪器 RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，链霉素(海昱都生物科技有限公司)，青霉素(上海弘顺生物科技有限公司)，胎牛血清(上海慧颖生物科技有限公司)，PBS(青岛海博生物技术有限公司)，MTT(美国Sigma公司)，二氧化碳培养箱(美国Biotrin公司)，流式细胞仪(上海北诺生物科技有限公司)，酶标仪(友康恒业生物科技(北京)有限公司)，Transwell小室(北京雅安达生物技术有限公司)，Matrigel胶(山东赛恩斯科技有限公司)，结晶紫(北京百泰克生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1培养利用RPMI1640培养基(添加链霉素和青霉素以及胎牛血清)培养人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1细胞，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中，观察细胞生长情况，取对数期细胞进行后续实验。

1.4.2 成球培养与诱导分化收集贴壁细胞，利用胰蛋白酶进行消化，并添加含胎牛血清的RPMI1640培养基终止消化。离心弃去上清液，收集对数生长期KYSE-150、TE-1细胞利用无血清RPMI1640培养基进行重悬^[6]。将细胞接种于培养板，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，隔天添加1次新鲜培养基。培养4 d之后收集细胞球，机械吹打获得单细胞悬液，在无血清培养基中连续培养20 d形成的细胞球重新置于含胎牛血清的RPMI1640培养基中，进行诱导分化^[7]。

1.4.3 MTT法检测人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1细胞及其细胞球增殖情况将人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1细胞及其细胞球均制备为单细胞悬液，分别接种于培养板，每孔200 μL^[8]，对照组只加培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养，每天取各组6孔细胞添加MTT液孵育4 h，孵育结束去掉多余培养液，添加二甲基亚砜摇晃10 min，利用酶标仪对各孔在490 nm波长处的吸光度值进行检测和记录，描绘细胞增殖曲线。

1.4.4 Transwell小室实验取Transwell小室，在其底部添加无血清RPMI1640培养基和Matrigel胶，置于室温环境下进行风干。取对数期KYSE-150、TE-1细胞及其细胞球制备单细胞悬液并进行计数。在Transwell小室内加入细胞和无血清的RPMI1640培养基，小室外添加含胎牛血清的RPMI1640培养基。各组细胞常规培养12 h后取出小室，去掉微孔膜上层细胞，利用结晶紫进行染色^[9]，PBS洗涤之后置于显微镜下进行观察，计算穿膜细胞数量。

1.4.5 细胞表面标志物检测收集培养3代以上的细胞球和普通培养贴壁肿瘤细胞，机械吹打为单细胞悬液，离心，PBS重悬，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，添加鼠抗人CD44-FITC、CD271-Pecy7单克隆抗体，避光环境下孵育30 min，PBS洗涤2次，上流式细胞仪进行检测^[10]。

1.5 主要观察指标 ①不同食管癌细胞株细胞成球培养结果。②细胞诱导分化结果。③细胞增殖情况。④细胞侵袭能力。⑤细胞表面标志物表达。

1.6 统计学分析利用SPSS 19.0软件完成数据处理。计量资料以x(_)±s表示，并进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，临床大多采用常规化疗和放疗等方式治疗不同类型肿瘤，但经常会出现肿瘤复发和转移等情况，预后效果不佳^[11-13]。随着临床医学的不断发展，人们开始积极的将肿瘤治疗与干细胞理论结合起来^[14-20]。研究发现，肿瘤细胞中存在一些特殊的细胞亚群，这些细胞亚群具有干细胞相似的特性，可以自我更新，并具有很强的增殖和分化能力，由此提出了“肿瘤干细胞理论”，认为肿瘤干细胞会对肿瘤的浸润和复发以及转移等过程产生极大的影响^[21-24]。汪建林等^[25]采用无血清悬浮培养法能富集食管癌KYSE-150和TE-1细胞株中具有肿瘤干性的细胞球，并且随着传代代数的增加细胞球数量增加，食管癌KYSE-150、TE-1细胞球含有的肿瘤干性细胞群较亲本细胞更具放射抗拒性，食管癌肿瘤干性细胞群与放射抗拒性产生机制有关。为此，对食管癌细胞株中肿瘤干细胞的相关生物学特性进行分析，为食管癌的临床治疗提供新的治疗思路至关重要^[26-28]。分离肿瘤干细胞的方法主要有悬浮细胞球培养法和侧群细胞培养法以及表面标志分选法^[29-31]。食管癌缺乏特异性标志物，因此不合适使用表面标志分选法^[32-33]。实验使用悬浮细胞球培养法进行食管癌干细胞分离与培养，TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的增殖能力均显著高于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞，这一结果表明，富集细胞球均具有更强的增殖能力。

对于食管癌等恶性肿瘤而言，肿瘤侵袭转移是导致预后复发的重要原因之一^[34]。目前，Transwell小室实验具有检测速度快等特点，是检测肿瘤干细胞侵袭转移能力的一种十分简单有效方法^[35-39]。赵生霞等^[40]利用有限稀释法对食管癌Eca109单克隆细胞株进行单克隆培养，Transwell小室法检测各细胞株的侵袭能力基本相当，并认为Eca109细胞中可能存在食管癌干细胞。Transwell小室实验结果显示，TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的穿膜细胞数量均显著多于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞，提示不同食管癌亲本细胞的细胞球具有很强的侵袭转移能力。干细胞标志物检测发现，TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的各标志物阳性比例均显著高于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞，提示不同食管癌亲本细胞的细胞球具有干细胞特性。

综上所述，从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离出具有肿瘤干细胞特性的细胞球，相应的细胞球具有很强的增殖和侵袭转移能力，且CD44和CD271可以作为重要的表面标志物，为寻找食管癌的临床治疗靶点提供一定的参考依据。