隐丹参酮对肾癌干细胞增殖和凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

肿瘤干细胞：又称为肿瘤始动细胞，是肿瘤内部存在着一组具有干细胞特性的小的细胞集群，具有自我更新、无限增殖和多向分化的能力。目前广泛认为肿瘤干细胞参与肿瘤的发生、发展，并且与肿瘤的化疗耐药性以及放疗抗性密切相关。

隐丹参酮：丹参中的化学成分主要分为水溶性和脂溶性2类，其中水溶性成分多具有酚酸性结构，而脂溶性成分主要是二萜醌类衍生物，脂溶性成分中的隐丹参酮因具有菲并呋喃结构且D环上C15与C16之间为单键而呈现独特的药理活性。药动学研究也发现隐丹参酮的药动学特征符合二室开放模型，其在大鼠体内的半衰期约为6.6 h，且比丹参酮ⅡA等其他脂溶性成分分布缓慢，消除时间长，这些都使隐丹参酮渐渐引起了人们的关注，其在心血管疾病、抗肿瘤、抗菌消炎、代谢紊乱性疾病及神经退行性疾病等方面显示出很好的前景。

背景：前期研究发现隐丹参酮对多种肿瘤具有抑制作用，但是对肾癌的影响尚未有报道。

目的：探讨隐丹参酮对肾癌干细胞增殖和凋亡的影响。

方法：采用免疫磁珠法分离纯化CD133⁺肾癌干细胞。通过MTT法检测不同质量浓度(0，0.2，1，5 mg/L)隐丹参酮对CD133⁺肾癌干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测不同质量浓度(0，0.2，1，5 mg/L)隐丹参酮对CD133⁺肾癌干细胞凋亡的影响；免疫印迹检测5 mg/L隐丹参酮对肾癌干细胞中Ki67、Bcl-2、Caspase-3和p-Caspase-3蛋白表达的影响。

结果与结论：分选前CD133⁺阳性细胞的百分率为6.32%，分选后CD133⁺阳性细胞的百分率为82.73%，差异有显著性意义(P < 0.001)。隐丹参酮抑制肾癌干细胞生长，促进肾癌干细胞凋亡，并呈浓度依赖性。Ki67和Bcl-2在5 mg/L隐丹参酮组中的表达明显低于未加药组，p-Caspase-3的表达水平则明显高于未加药组，而Caspase-3在两组中的表达水平没有明显变化，结果表明隐丹参酮可能通过抑制肾癌干细胞Ki67和Bcl-2表达，促进p-Caspase-3表达来发挥抑增殖促凋亡效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-2322-5208(冯敏)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 隐丹参酮, 肾癌, 肾癌干细胞, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that cryptotanshinone represses multiple tumors, but little is reported on its effect on renal carcinoma.
OBJECTIVE: To explore the effect of cryptotanshinone on the proliferation and apoptosis of the renal carcinoma stem cells.
METHODS: CD133+ renal carcinoma stem cells were separated from OS-RC-2 cells by immunomagnetic bead separation. Effects of 0, 0.2, 1, 5 mg/L cryptotanshinone on the proliferation and apoptosis of CD133+ renal carcinoma stem cells were detected by MTT and flow cytometry, respectively. Expression levels of Ki67, Bcl-2, Caspase-3 and p-Caspase-3 protein were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: After magnetic cell sorting, the percentage of CD133+ cells was increased from 6.32% to 82.73%, and there was a significant difference before and after cell sorting (P < 0.001). Cryptotanshinone could repress the proliferation of CD133+ renal carcinoma stem cells and promote cell apoptosis in a dose-dependent manner. The protein expression levels of Ki67 and Bcl-2 in the 5 mg/L cryptotanshinone group were significantly decreased compared with the control group, while the protein expression level of p-Caspase-3 protein was significantly increased. In addition, there was no difference in the protein expression of Caspase-3 between cryptotanshinone and control group. These findings indicate that cryptotanshinone may be a potent anticancer drug for the treatment of renal carcinoma by inhibiting expression of Ki67 and Bcl-2 and promoting protein expression of p-Caspase-3.

中图分类号:

R394.2

冯敏，贾明华. 隐丹参酮对肾癌干细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(1): 49-54.

Feng Min, Jia Ming-hua . Cryptotanshinone effects on the proliferation and apoptosis of renal carcinoma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(1): 49-54.

图/表（结果） 5

2.1 免疫磁珠法分选CD133+细胞阳性率利用免疫磁珠分选技术，从人肾癌细胞株OS-RC-2中分选CD133+肾癌干细胞，采用流式细胞仪分析样品中的阳性细胞数，计算阳性细胞的百分率，结果发现分选前CD133+阳性细胞的百分率为6.32%，分选后CD133+阳性细胞的百分率为82.73%，分选后CD133+肾癌干细胞表达比例明显升髙，差异有显著性意义(P < 0.001)，分选的纯度高，符合后续实验的要求，见图1。

2.2 隐丹参酮抑制肾癌干细胞增殖含有0.2，1，5 mg/L隐丹参酮的培养液培养肾癌干细胞48 h，各组的活细胞分别为未加药组的68.5%(P < 0.05)、43.9%(P < 0.01)和28.6% (P < 0.001)，不同质量浓度隐丹参酮处理的细胞与未用隐丹参酮处理的细胞在增殖率上差异均具有显著性意义，而且随着隐丹参酮质量浓度的升高，细胞的增殖率降低，见图2。

此外，采用免疫印迹检测未加药组和加有5 mg/L隐丹参酮组的Ki67蛋白表达水平。Ki67蛋白是细胞增殖相关蛋白，与细胞增殖程度相关，是公认的有效的细胞增殖活性标志物。实验结果显示，5 mg/L隐丹参酮组的Ki67蛋白表达水平显著低于未加药组(P < 0.01)，见图3。

2.3 隐丹参酮促进肾癌干细胞凋亡用含0，0.2，1， 5 mg/L隐丹参酮的培养液培养细胞48 h，流式细胞仪检测其凋亡率，各组的凋亡率分别为0.81%、6.75%(P < 0.05)、15.34%(P < 0.01)和21.34%(P < 0.001)，不同质量浓度隐丹参酮处理的细胞与未用隐丹参酮处理的细胞在凋亡率上差异均具有显著性意义，而且随着隐丹参酮质量浓度的升高，细胞的凋亡率增加，见图4。

此外，采用免疫印迹检测了未加药组和加有5 mg/L隐丹参酮组的凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3和p-Caspase-3的表达水平。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Caspase-3和p-Caspase-3是促凋亡蛋白。加有5 mg/L隐丹参酮组细胞中p-Caspase-3蛋白的表达水平明显高于未加药组(P < 0.01)，Caspase-3的蛋白表达水平没有明显变化，而Bcl-2蛋白的表达水平相比于未加药组明显降低(P < 0.01)，见图5。

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引言

肾细胞癌简称肾癌，是成人泌尿系统中常见的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%-3%^[1-3]。近年来随着生活环境及生活方式的改变，肾癌的发病率也逐渐增加。尽管有核磁共振成像、超声成像、核素成像等多种先进的诊查手段，以及不断提高的外科手术、放化疗技术等，肾癌的生存期并没有取得显著性的提高^[4-6]。过去的10年里，肾癌的5年死亡率高达40%-50%^[2]。随着对肿瘤研究的深入，学者们提出了肿瘤干细胞理论，认为在肿瘤组织中存在很少一部分干细胞样的群体，因其大多处于相对静止状态，使其对化疗药物及放射治疗不敏感，但是其又具有自我更新、无限增殖和多系分化的能力，故在治愈一段时间或临床好转后，出现肿瘤转移与复发^[7-9]。肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、复发和转移的根源。到目前为止，已有多种肿瘤干细胞从肿瘤中分离出来，并对其性能进行了研究，证实了肿瘤干细胞理论的合理性和可信性，例如白血病干细胞，乳腺癌干细胞、卵巢癌干细胞、结肠癌干细胞、胶质瘤干细胞等^[10-15]。肾癌干细胞的分离较晚，是2008年Bussolati等^[16]采用磁珠分选技术完成的，它符合肿瘤干细胞的一切特征，推测其可能是肾癌发生、复发和转移的根源。此后相继有很多研究者采用多种方法分离肾癌干细胞，并对其进行研究，旨在通过干细胞来有效地治疗肾癌^[17-20]。

隐丹参酮(Cryptotanshinone)是从唇形科植物丹参中提取的主要活性化合物之一，临床上用于治疗多种疾病，例如冠心病、高血脂、急性脑缺血疾病、慢性肾衰竭、慢性肝炎、老年痴呆等^[21-25]。近期研究发现，它不仅可以用于以上疾病的治疗，还是一个有效的抗癌药，可以抑制多种癌细胞系的细胞增殖，例如结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、胶质瘤、子宫颈癌等^[26-32]。关于隐丹参酮对肾癌及肾癌干细胞的影响尚未有报道。目前有多种方法可以将肾癌干细胞与肾癌非干细胞分开，其中最常见的是利用肾癌干细胞表面抗原分子CD133免疫表型进行流式细胞分选或者免疫磁珠分选，将肾癌干细胞(CD133⁺)和肾癌非干细胞(CD133^-)分开^[33-35]。本实验采用免疫磁珠分选技术从人肾癌细胞株OS-RC-2中分离出CD133⁺肾癌干细胞，采用MTT法研究不同质量浓度隐丹参酮对肾癌干细胞增殖的影响，并用免疫印迹法检测了细胞增殖相关蛋白Ki67在隐丹参酮处理细胞中的表达水平，进而辅助说明隐丹参酮对肾癌干细胞增殖的影响。实验还采用流式细胞仪检测了不同质量浓度隐丹参酮对肾癌干细胞凋亡的影响，以及隐丹参酮处理细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3和p-Caspase-3的表达水平，为肾癌提供新的有效的治疗药物，也为以后深入研究隐丹参酮对肾癌干细胞和肾癌生物学特性的影响奠定了基础。

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1至12月在郑州颐和医院病理科完成。

1.3 材料人肾癌细胞株OS-RC-2购自中科院上海细胞研究所。隐丹参酮对照品(纯度> 98%，货号YY90061)购自上海原叶生物科技有限公司，将其溶于二甲基亚砜中，配置成10 g/L的工作母液，置于-20 ℃的冰箱中备用，使用前用RPMI1640无血清培养液调至所需浓度。

实验试剂及仪器：RPMI 1640培养基，胎牛血清(美国Gibco公司)；PE标记CD133抗体，IgG1抗体，GAPDH抗体，Ki67抗体，Bcl-2抗体，Caspase-3抗体，p-Caspase-3抗体，辣根过氧化物酶标记二抗(英国Abcam公司)；噻唑蓝，二甲基亚砜(美国Sigma公司)；0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶(德国Miltenyi Biotec公司);恒温培养箱(上海茸研仪器公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；CD133细胞分离试剂盒(美国Gene Copoeia公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养将人肾癌细胞株OS-RC-2培养在RPMI1640完全培养液中(含有体积分数为10%胎牛血清、0.1 g/L链霉素、100 U/mL青霉素)，于37 ℃、体积分数为5%CO₂恒温培养箱中培养。待细胞融合度达到85%左右时，用0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶混合消化液进行消化，然后收集细胞700 r/min离心6 min，传代培养。

1.4.2 CD133⁺细胞的检测收集对数生长期的细胞，PBS清洗，计数，分管，按1×10⁶/μg细胞浓度加入PE标记的CD133抗体(对照加入同型IgG1抗体)，4 ℃孵育30 min，PBS清洗，采用流式细胞仪分析样品中的阳性细胞数，计算阳性细胞的百分率。

1.4.3 免疫磁珠法分选CD133⁺细胞严格按照CD133细胞分离试剂盒的使用说明进行操作，将第5代的OS-RC-2细胞置于EDTA消化液中4 ℃孵育30 min，收集细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，PBS清洗3次，加入300 μL缓冲液重悬细胞，使用磁性细胞分离柱进行分选，得到CD133⁺细胞，离心后重悬于无血清RPMI1640培养液中，取部分细胞用流式细胞仪检测其阳性细胞的百分率，其余细胞继续培养用于后续实验。

1.4.4 MTT检测细胞增殖情况将分选得到的CD133⁺细胞，以3×10⁴/孔的密度接种于96孔板后加入包含有不同质量浓度隐丹参酮(0，0.2，1，5 mg/L)的培养液进行培养，48 h后进行检测，每孔先加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h，然后换液，每孔加入二甲亚砜150 μL，放入摇床中轻微振荡直至完全溶解MTT转化生成的蓝紫色产物甲臜。酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度值。

1.4.5 免疫印迹检测增殖和凋亡相关蛋白表达分别提取用含5 mg/L隐丹参酮培养液培养24 h和48 h的肾癌干细胞中的总蛋白，检测增殖蛋白Ki67和凋亡蛋白Bcl-2，Caspase-3，p-Caspase-3的表达，进行定量，然后使用10%的分离胶进行电泳。在冰浴下100 V转膜2 h。使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入相对应的一抗(Ki67抗体，Bcl-2抗体，Caspase-3抗体和p-Caspase-3抗体)4 ℃孵育过夜，采用TBST进行洗涤3次，每次10 min。之后加入二抗，37 ℃孵育1 h，使用TBST洗涤3次，每次15 min，在暗室中压片，然后进行显影、定影。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡将CD133⁺肾癌干细胞加入到含有不同质量浓度隐丹参酮(0，0.2，1，5 mg/L)的培养液中进行培养，24 h后收集细胞，800 r/min离心 5 min，PBS清洗。然后使用Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测其凋亡情况，操作过程严格按照使用说明书进行，将细胞加入到100 μL 1×Binding缓冲液中重悬，添加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料，进行避光振荡混匀，室温反应15 min，然后再加入400 μL 1×Binding缓冲液，混匀，上流式细胞仪进行检测，统计发生凋亡的细胞个数。

1.5 主要观察指标分选前后CD133⁺肾癌干细胞所占的比例，不同质量浓度隐丹参酮对肾癌干细胞增殖和凋亡的影响。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。计量资料用x(_)±s表示，采用t 检验比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，在中国发病率仅次于膀胱肿瘤，死亡率在泌尿系统恶性肿瘤中居首位^[36-37]，发病具有隐匿性，约1/3的肾癌患者在确诊为原发肿瘤时已有转移灶，而且患者术后1年内出现复发、转移的高达40%，5年生存率不到20%，未接受治疗的患者3年存活率不超过5%^[38]。肾癌是一种对放化疗均不敏感的实体瘤，目前的治疗手段不能对提高肾癌患者的生存率起到显著性的效果。近年来肿瘤干细胞的研究受到了广泛关注并取得了重大进展，这为肾癌研究提供了新的思路。本研究采用免疫磁珠法分离纯化肾癌干细胞，然后对其进行研究。

隐丹参酮是中药丹参的主要脂溶性有效成分之一，属于二萜醌类化合物，近年来研究发现其具有显著的抗肿瘤功能，在恶性肿瘤的治疗中展现出良好的应用前景。目前已报道，隐丹参酮可有效抑制宫颈癌、乳腺癌、肺癌，肝癌、前列腺癌和白血病等多种肿瘤细胞的增殖，诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和分化，并且在一定程度上能够抑制肿瘤细胞的侵袭，防止其向远处转移^[39-40]。Chen等^[41]发现隐丹参酮通过下调横纹肌肉瘤Rh30细胞中cyclin D的表达诱导细胞周期阻滞于G₁/G₀期，抑制其增殖。Shin等^[42]发现隐丹参酮通过磷酸化前列腺癌细胞DU145中的Rb蛋白，诱导细胞周期阻滞于G₁/G₀期，抑制DU145前列腺癌细胞增殖。研究也已经报道了隐丹参酮通过下调横纹肌肉瘤细胞Rh30和前列腺癌细胞DU145中抗凋亡蛋白survivin和Mcl-1的表达，诱导肿瘤细胞凋亡^[42-43]。Jung等^[44]发现隐丹参酮通过调控JAK2/STAT3和SHP1信号通路，降低了白血病细胞K562中survivin、cyclin D、bcl-xL等蛋白的表达水平，促进细胞凋亡。叶因涛等^[45]发现隐丹参酮通过调控p53通路抑制宫颈癌Hela细胞增殖，促进其凋亡。目前关于隐丹参酮对肾癌的影响尚未有报道。本研究则探讨了隐丹参酮对肾癌干细胞增殖和凋亡的影响，发现隐丹参酮能够抑制肾癌干细胞的增殖，促进其凋亡，并呈浓度依赖性，这表明隐丹参酮是一个潜在的抗肾癌药，为以后隐丹参酮用于肾癌的治疗提供了依据，但是关于隐丹参酮对肾癌干细胞发挥功能的具体分子机制仍有待深入研究，这也是后续大量工作所在。