强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞调控巨噬细胞的功能异常

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.003

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (1): 13-19.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.01.003

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强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞调控巨噬细胞的功能异常

孙素和¹，王鹏¹，苏春燕²，谢中瑜¹，李玉希¹，李登¹，旺姗²，苏鸿君²，伍小华²，邓雯²，吴燕峰²，沈慧勇¹

中山大学孙逸仙纪念医院，¹骨外科，²生物治疗中心，广东省广州市 510120

收稿日期:2015-11-15 出版日期:2016-01-01 发布日期:2016-01-01
通讯作者: 沈慧勇，博士，博士生导师，主任医师，中山大学孙逸仙纪念医院骨外科，广东省广州市 510120
作者简介:孙素和，男，1985 年生，湖南省娄底市人，汉族，中山大学孙逸仙纪念医院骨外科在读硕士，主要从事干细胞组织工程基础及临床研究。
基金资助:

国家自然科学基金资助项目(81271951，81401850)

Bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with ankylosing spondylitis show abnormal immunoregulation capability on macrophages

Sun Su-he¹, Wang Peng¹, Su Chun-yan², Xie Zhong-yu¹, Li Yu-xi¹, Li Deng¹, Wang Shan², Su Hong-jun², Wu Xiao-hua², Deng Wen², Wu Yan-feng², Shen Hui-yong¹

¹Department of Orthopedics, ²Center for Biotherapy, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Received:2015-11-15 Online:2016-01-01 Published:2016-01-01
Contact: Shen hui-yong, M.D., Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthopedics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Sun Su-he, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81271951, 81401850

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

骨髓间充质干细胞免疫调节能力：骨髓间充质干细胞具有极低的免疫原性及较强的免疫调节能力，可被用于治疗多种自身免疫性疾，如Crohn’s病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、风湿性关节炎等。强直性脊柱炎是一类自身免疫性疾病，其发病可能与HLA-B27、白细胞介素1α、白细胞介素23受体、肿瘤坏死因子α受体等基因多态性有关。课题组首次证实静脉输注异体正常人骨髓间充质干细胞可以有效改善强直性脊柱炎患者的炎性状态，或可能为强直性脊柱炎提供新的治疗策略。

TSG-6：是一个具有保护性的炎性调控因子，在炎性疾病中，多种促炎性因子如肿瘤坏死因子α，白细胞介素1等均可以促使其在间充质干细胞、成纤维细胞、滑膜细胞等多种细胞中表达。TSG-6可以反馈性抑制炎性细胞的迁移、黏附并降低其促炎性因子的分泌，从而起到局限炎症的作用。

背景：强直性脊柱炎是一种伴有高炎性状态的自身免疫性疾病，但其具体发病机制不明确，目前尚缺乏有效的治疗方案。

目的：体外探讨强直性脊柱炎患者来源骨髓间充质干细胞调控巨噬细胞的功能及正常人骨髓间充质干细胞在强直性脊柱炎治疗中的潜在作用。

方法：提取25例强直性脊柱炎患者及21例健康志愿者的骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增，以第4代细胞进行实验。体外诱导THP-1细胞系分化成为巨噬细胞。运用流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞及巨噬细胞的表面标志。ELISA检测健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养体系上清中肿瘤坏死因子α及TSG-6蛋白水平，PCR检测巨噬细胞及骨髓间充质干细胞相关因子基因表达水平。

结果与结论：①两种骨髓间充质干细胞均呈现典型间充质干细胞表型，巨噬细胞表型标志CD68为阳性。②强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养组中巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子α蛋白水平及肿瘤坏死因子α转录水平均高于健康志愿者骨髓间充质干细胞(P < 0.05)。③强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞组TSG-6基因的转录水平及蛋白分泌水平均低于健康志愿者骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。结果提示：①强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子α分泌的功能减弱，可能是导致强直性脊柱炎免疫异常的重要原因。②正常人骨髓间充质干细胞可分泌足量的TSG-6抑制强直性脊柱炎患者巨噬细胞的活化，降低其肿瘤坏死因子α的分泌而发挥治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-2756-1866(孙素和)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 强直性脊柱炎, 骨髓间充质干细胞, 巨噬细胞, TSG-6, 肿瘤坏死因子α, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Ankylosing spondylitis is an autoimmune disease at high inflammatory state, and its pathogenesis is still unclear. Besides, there is a lack of entirely satisfactory curative strategies.

OBJECTIVE: To explore the immunoregulation capability of bone marrow mesenchymal stem cells from ankylosing spondylitis patients on macrophages and the potential therapeutic use of bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors on ankylosing spondylitis.

METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were extracted from 21 healthy donors and 25 ankylosing spondylitis patients respectively, and passage 4 cells were used in subsequent experiments. A human monocytic cell line was induced to differentiate into macrophages. The phenotypic markers of bone marrow mesenchymal stem cells and macrophages were detected by flow cytometry. Expressions of tumor necrosis factor-α and tumor necrosis factor-α-stimulated gene 6 (TSG-6) proteins in the supernatant of co-culture system were detected by ELISA. Quantitative real-time PCR was applied to detect the mRNA level of cytokines secreted by bone marrow mesenchymal stem cells and macrophages.

RESULTS AND CONCLUSION: The typical mesenchymal stem cell surface markers were expressed in both bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors and patients with ankylosing spondylitis, and CD68 was detected positively in induced macrophages. The protein and mRNA levels of tumor necrosis factor-α secreted by macrophages co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells from patients with ankylosing spondylitis were obviously higher than those from healthy donors (P < 0.05). TSG-6 secreted by bone marrow mesenchymal stem cells from patients with ankylosing spondylitis was lower than that by bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors in both RNA transcriptional and protein levels (P < 0.05). Our study demonstrates that bone marrow mesenchymal stem cells from patients with ankylosing spondylitis shows abnormal immunoregulatory function on inhibiting the tumor necrosis factor-α secretion from macrophages, which reveals a mechanism of immune disorder in ankylosing spondylitis. The therapeutic mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells from healthy donors may work by secreting enough TSG-6 to inhibit the activation of macrophages in patients with ankylosing spondylitis, and thereby to decrease the secretion of tumor necrosis factor-α.

中图分类号:

R394.2

孙素和，王鹏，苏春燕，谢中瑜，李玉希，李登，旺姗，苏鸿君，伍小华，邓雯，吴燕峰，沈慧勇. 强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞调控巨噬细胞的功能异常[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(1): 13-19.

Sun Su-he, Wang Peng, Su Chun-yan, Xie Zhong-yu, Li Yu-xi,Li Deng, Wang Shan, Su Hong-jun, Wu Xiao-hua, Deng Wen, Wu Yan-feng, Shen Hui-yong . Bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with ankylosing spondylitis show abnormal immunoregulation capability on macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(1): 13-19.

图/表（结果） 4

2.1 两种骨髓间充质干细胞形态学及呈现的表型标志无差异健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞均为长梭型的贴壁细胞，且均匀的分布于培养瓶底(图1)。健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞均表达CD29、CD44、CD90、CD105，而HLA-DR、CD34、CD45为阴性，符合间充质干细胞鉴别表型特点(图2)。

2.2 诱导分化的巨噬细胞高表达特异性表型分子CD68 THP-1细胞为集落样悬浮生长的单核细胞(图3A)。诱导后THP-1全部变为贴壁生长、煎蛋样的巨噬细胞(图3B)。流式细胞仪检测结果表明诱导后的巨噬细胞高表达CD68(图3C-E)，证明巨噬细胞诱导成功。

2.3 在共培养体系中，强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞显示出免疫调节功能缺陷巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α呈时间依赖性，第5天的分泌总量趋于平衡(图4A)。在分离/共贴壁共培养体系中，两种骨髓间充质干细胞均能显著降低肿瘤坏死因子α的分泌(P均< 0.01)，健康志愿者骨髓间充质干细胞组抑制肿瘤坏死因子α的作用更明显，差异有显著性意义(P < 0.05，图4B，C)。此外，共贴壁培养体系中两种骨髓间充质干细胞对肿瘤坏死因子α的分泌抑制均比分离共培养体系更明显。在基因水平，与单纯巨噬细胞培养组相比，共培养组中巨噬细胞的肿瘤坏死因子α基因相对表达量均降低(P < 0.01)，而强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞组中巨噬细胞的肿瘤坏死因子α基因相对表达量要高于健康志愿者骨髓间充质干细胞组(P < 0.05，图4D)。

2.4 健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞分泌TSG-6存在差异半定量PCR结果显示强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞组TSG-6的表达要明显低于健康志愿者骨髓间充质干细胞(P < 0.001)，而吲哚胺2，3-双加氧酶、转化生长因子β、诱生型一氧化氮合酶，肝细胞生长因子在二者的表达无明显差别(图5A)。收集5 d的共培养上清液，ELISA检测发现单纯巨噬细胞组中不分泌TSG-6，强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞分泌的TSG-6水平明显低于健康志愿者骨髓间充质干细胞组(P < 0.05，图5B)。

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引言

强直性脊柱炎是一种以炎性腰背痛、附着点炎症及中轴骨进行性骨化为临床特征的慢性自身免疫性疾病，常伴有银屑病、前葡萄膜炎、炎症性肠病等关节外炎症表现^[1-2]。强直性脊柱炎的发病机制较为复杂，尚未完全明确，目前的研究推测可能与人类白细胞抗原B27基因错误折叠^[3]、微生物感染^[4-5]、巨噬细胞活化等原因有关^[6]。自20世纪90年代以来，学者们发现炎症始终伴随着强直性脊柱炎的发生及发展，如在强直性脊柱炎发病初期，患者的骶髂关节处就已高表达肿瘤坏死因子α，在强直性脊柱炎患者血清中的肿瘤坏死因子α水平也显著高于非炎性腰背痛患者，所以肿瘤坏死因子α可能在强直性脊柱炎的发病及进展过程中扮演着非常重要的角色^[7]。

探索强直性脊柱炎有效的治疗方法一直是国内外学者研究的重点。传统的治疗方法如非类固醇抗炎药，改善病情抗风湿药均存在长期使用不良反应大，缓解率不高等缺点^[8-10]。而新型生物制剂肿瘤坏死因子α抑制剂虽然可以有效缓解强直性脊柱炎患者的临床症状，但其并不能延缓强直性脊柱炎疾病的进展^[11-12]。因此，探寻一种新的、有效的治疗强直性脊柱炎的方法具有重要的临床意义。

骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，可以从骨髓、脂肪、脐带、牙髓等组织中分离获得。骨髓间充质干细胞具有极低的免疫原性及较强的免疫调节能力，可被用于治疗Crohn’s病、系统性红斑狼疮、多发性肌炎、风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病^[13-17]。课题组首次证实静脉输注异体正常人骨髓间充质干细胞可以有效改善强直性脊柱炎患者的炎性状态^[18]，为强直性脊柱炎提供了一个全新的治疗策略。

TSG-6是一种起抑制炎症作用的糖蛋白，于1990年被Lee等^[19]首次发现。随后，Qi等^[20]在烧伤小鼠模型中发现皮下注射的间充质干细胞受到肿瘤坏死因子α刺激后分泌大量的TSG-6，而TSG-6可以负反馈抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子α的分泌。TSG-6的抑炎特性还被其他学者在间充质干细胞静脉输注治疗小鼠腹膜炎^[21]、脑出血^[22]、神经炎性疾病等模型疾病中得到证实^[23]。同时Oh等^[24]发现敲除掉间充质干细胞TSG-6基因后，间充质干细胞的炎性调控作用明显减弱，提示TSG-6是间充质干细胞发挥炎性调控功能的重要因子；也有学者认为TSG-6是一个评价间充质干细胞炎性调控效能的重要指标^[25]，抑制巨噬细胞的活化是TSG-6发挥免疫调节作用的主要途径。近年研究发现TSG-6除了具有抑制炎症功能外，也可以通过抑制破骨细胞活性从而减少骨质的丢失^[26]，还可以通过直接结合骨形态发生蛋白2降低成骨细胞分化从而抑制成骨^[27]，而这2项功能的发现对于改善强直性脊柱炎具有重要的临床意义。

为此实验将健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与巨噬细胞进行体外共培养，构建强直性脊柱炎的细胞治疗模型，以此来了解健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞对巨噬细胞的调控作用，从而探究强直性脊柱炎的发病机制及骨髓间充质干细胞输注治疗强直性脊柱炎的可能作用机制。

材料方法

1.1 设计细胞水平体外研究。

1.2 时间及地点 2014年3月至2015年7月在中山大学孙逸仙纪念医院生物治疗中心骨科实验室完成。

1.3 材料 BD FACSVersion流式细胞仪(美国BD公司)，实时定量PCR仪(Roche公司)，多功能酶标仪(Thermo公司)，0.4 μm 6孔Transwell培养板(美国Costar公司)，佛波酯(Sigma公司)，人CD68-FITC，小鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、HLA-DR单克隆抗体，肿瘤坏死因子α ELISA Kit (美国BD公司)，Human TSG-6 ELISA Kit (加拿大Mybioscience公司)，重组人IFN-γ干粉(PeproTech公司)，反转录试剂盒(RR037A)、SYBR Premix Ex Tap 试剂盒(Takara公司)，重组人LPS干粉(碧云天公司)，THP-1细胞系(中国科学院上海生命科学研究院)。骨髓间充质干细胞库相关病例资料见表1。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞的分离培养无菌操作抽取髂后上棘内约30 mL骨髓，采用密度梯度离心法分离出骨髓间充质干细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM进行培养，每3 d换液1次，待贴壁生长至90%瓶底后，进行传代，传至第4代用于实验，剩余细胞保存于液氮罐。每次均随机抽取3例强直性脊柱炎患者及3例健康志愿者的骨髓间充质干细胞进行实验，重复3次以上。

1.4.2 细胞培养及巨噬细胞诱导分化骨髓间充质干细胞以0.5×10⁴/cm²细胞密度种植于培养瓶中，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养，并置于恒温37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱中培养。THP-1细胞则用1640培养基(含体积分数10%的胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL)进行培养。THP-1细胞以1×10⁶/孔的细胞浓度种植于普通6孔板/6孔Transwell板下室中，加入浓度为320 μmol/L的佛波酯诱导48 h后，所有悬浮细胞均贴壁，PBS洗涤3遍，更换1640培养基，并加入干扰素-γ 20 μg/L+脂多糖100 μg/L再诱导24 h^[28]。THP-1巨噬细胞诱导成功后，健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与巨噬细胞以 1︰10的比例进行共培养，即把骨髓间充质干细胞以1×10⁵/孔的数量种植在普通6孔板(共贴壁)/6孔Transwell板上室内(分离共培养)进行共培养，时长为5 d。实验共分为3组，单纯巨噬细胞培养组，巨噬细胞+健康志愿者骨髓间充质干细胞组，巨噬细胞+强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞组。

1.4.3 人骨髓间充质干细胞及巨噬细胞的流式鉴定用0.25%胰蛋白酶消化贴壁的健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞，收集数量约1×10⁶个用于流式细胞仪检测。选取的细胞表面抗体为小鼠抗人CD29-PE，小鼠抗人CD34-APC，小鼠抗人CD44-FITC，小鼠抗人CD45-FITC，小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人CD105-FITC，小鼠抗人HLA-DR-PE，并以同型对照设门。收集约5×10⁵个巨噬细胞，破膜并孵育CD68-FITC流式抗体，洗涤重悬，上机检测，以阴性对照设门。

1.4.4 酶联免疫法(ELISA) 收集骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养上清标记、分装、冻存于-80 ℃冰箱，于检测前解冻。依据说明书进行肿瘤坏死因子α及TSG-6的检测，每次实验均同时进行标准曲线的绘制及待测样品的测定。

1.4.5 半定量PCR 所有的RNA样本均使用Trizol reagent提取，随后依据说明书用PrimeScript^TM RT reagent kit反转录成cDNA，在实时定量PCR仪上进行半定量测定，基因相对表达量以mRNA 2^-??Ct法计算，选取GAPDH作为内参，通过将目标基因与内参基因相比进行标准化统计。引物序列见表2。1.5 主要观察指标 ①单纯巨噬细胞培养体系及健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养体系中肿瘤坏死因子α的分泌水平及其基因相对表达量。②健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞中TSG-6、吲哚胺2，3-双加氧酶、诱生型一氧化氮合酶、转化生长因子β、肝细胞生长因子的基因相对表达量及TSG-6在培养上清液中的分泌水平。

1.6 统计学分析用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

强直性脊柱炎是一类慢性、免疫异常的脊柱关节病，致畸率、致残率较高，疾病晚期常严重影响患者的生活质量^[29-30]。课题组首次进行了骨髓间充质干细胞输注治疗强直性脊柱炎的临床试验，发现患者于治疗后其C-反应蛋白、红细胞沉降率等炎性指标及炎性症状均得到改善^[18]。因此，深入探究骨髓间充质干细胞在强直性脊柱炎发病中所起的作用对评价及推广正常人骨髓间充质干细胞输注治疗强直性脊柱炎这种治疗方式具有重要意义。

强直性脊柱炎患者体内存在巨噬细胞过度活化的现象，其骶髂关节在疾病早期就高表达肿瘤坏死因子α^[31]，血清中肿瘤坏死因子α水平也明显升高^[32]，而巨噬细胞是肿瘤坏死因子α的主要来源，可见强直性脊柱炎的高炎性状态与巨噬细胞功能异常密切相关。故实验以巨噬细胞作为主要研究对象，用直接接触/分离的方式将健康志愿者/强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞与之进行共培养，发现二者均可以显著降低巨噬细胞肿瘤坏死因子α的分泌，而相比分离共培养的方式，直接接触培养体系中肿瘤坏死因子α的分泌水平抑制得更加明显，考虑为细胞直接接触抑制有关，这一结果与之前的学者所发现的相符^[33-34]，然而此次实验首次发现在两种共培养模式下强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞抑制巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α的能力显著弱于健康志愿者骨髓间充质干细胞，说明强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞在调控巨噬细胞肿瘤坏死因子α分泌的功能上存在缺陷。

实验结果发现强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞分泌TSG-6的水平显著低于健康志愿者骨髓间充质干细胞，其分泌TSG-6的能力不足，致使其对巨噬细胞调控功能减弱，这可能是导致强直性脊柱炎患者炎性异常的重要原因。而正常人骨髓间充质干细胞则可以分泌足量的TSG-6，显著抑制巨噬细胞的活化，显著降低肿瘤坏死因子α水平的分泌，这或许就是正常人骨髓间充质干细胞发挥其治疗作用的主要机制。近年研究发现TSG-6除了具有抑制炎症的功能外，也可以通过抑制破骨细胞的活性从而减少骨质的丢失^[26]，还可以通过直接结合骨形态发生蛋白2降低成骨细胞的分化从而抑制成骨^[27]，这2项功能的发现对强直性脊柱炎的治疗具有重要的意义：首先，中轴骨骨质疏松伴异位骨化是强直性脊柱炎一个重要临床表现^[35]，其次脊柱不可抑制的进行性骨化也是非类固醇类抗炎药，肿瘤坏死因子α抑制剂等药物目前临床应用面临的巨大难题，而TSG-6一方面可以抑制破骨细胞的功能可以减少骨质的丢失，另一方面也可以抑制异位成骨细胞的分化从而减少异位成骨，那么则能够显著减少强制性脊柱炎患者脊柱关节结构的损害。因此，作者推测正常人骨髓间充质干细胞输注入强直性脊柱炎患者体内后可能通过分泌大量的TSG-6从而不仅能抑制强直性脊柱炎患者的炎症，还可以减少其脊柱关节结构的损害，从而发挥其即可降低强直性脊柱炎疾病严重程度，同时也能延缓强直性脊柱炎疾病进展的双重治疗效果。

综上所述，强直性脊柱炎患者的骨髓间充质干细胞抑制巨噬细胞活化的功能减弱，可能致使强直性脊柱炎患者体内肿瘤坏死因子α升高，从而最终导致强直性脊柱炎的发病。而异体正常人的骨髓间充质干细胞则可能通过补充分泌足量的TSG-6来抑制强直性脊柱炎患者体内巨噬细胞的活化，降低患者体内的炎症水平，从而发挥其治疗作用，但是，尚需要进一步的临床验证。TSG-6作为骨髓间充质干细胞分泌的一种重要的炎性调节因子，有望转化成药物用于强直性脊柱炎的临床治疗。

强直性脊柱炎患者骨髓间充质干细胞调控巨噬细胞的功能异常

Bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with ankylosing spondylitis show abnormal immunoregulation capability on macrophages

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