不同来源蚕丝蛋白修复骨软骨组织缺损的效果比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前还没有研究比较不同种属来源蚕丝蛋白修复骨软骨的效果。
目的：观察桑蚕和柞蚕来源蚕丝蛋白支架材料修复骨软骨缺损的效果差异。
方法：取新西兰兔20只，制备单侧膝关节骨软骨缺损模型，随机分为5组：其中1组不植入任何材料，作为空白对照；实验1组将3层桑蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处；实验2组将1个包被转化生长因子β3的桑蚕丝蛋白支架与2个包被骨形态发生蛋白2的桑蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处；实验3组将3层柞蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处；实验4组将1个包被转化生长因子β3的柞蚕丝蛋白支架与2个包被骨形态发生蛋白2的柞蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处。术后8周，取关节骨软骨修复区行组织病理学观察，检测Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白表达。
结果与结论：实验1组胶原蛋白广泛分布于缺损区全层；实验2组胶原纤维在修复区表面呈平行分布，在中间和底部呈垂直顶部的方向分布；实验3组在修复区表面可见胶原；实验4组在支架表面和底部可见软骨样细胞有成团分布。4个实验组修复区Ⅰ型胶原蛋白呈强阳性表达；实验1组、实验2组修复区Ⅱ型胶原蛋白呈微弱表达，实验3组、实验4组修复区Ⅱ型胶原蛋白呈强阳性表达。表明两种蚕丝蛋白均能修复骨软骨缺损，桑蚕丝蛋白倾向于形成骨组织，柞蚕丝蛋白倾向于形成软骨组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 蚕丝蛋白, 软骨缺损, Ⅱ型胶原蛋白, Ⅰ型胶原蛋白

Abstract:

BACKGROUND: At present, there are no studies of comparing the effect of silk fibroins from different sources in repair of osteochondral defects.
OBJECTIVE: To compare the effect of mulberry silk- and tussah-derived silk fibroin scaffold materials in repair of osteochondral defect.
METHODS: Totally 20 New Zealand white rabbits were obtained to prepare osteochondral defect models on the unilateral knee joint and randomly divided into five groups: control group, experimental group 1, experimental group 2, experimental group 3 and experimental group 4. Rabbits in the control group were not implanted any materials. In the experimental group 1, 3 layers of mulberry silk protein scaffolds stuck together to fill in defects. In the experimental group 2, one mulberry silk protein scaffold coated with transforming growth factor-β3 was stuck with two mulberry silk protein scaffolds coated with bone morphogenetic protein-2 to fill in defects. In the experimental group 3, three layers of tussah protein scaffolds stuck together to fill in defects. In the experimental group 4, one tussah protein scaffold coated with transforming growth factor-β3 stuck together with two tussah protein scaffolds coated with bone morphogenetic protein-2 to fill in defects. At 8 weeks post surgery,
articular cartilage repair area was observed histopathologically. Type I and II collagen expressions were determined.
RESULTS AND CONCLUSION: The collagen fibers in experimental group 1 were widely distributed in the full-thickness defect area. The collagen fibers in the experimental group 2 were parallelly distributed on the surface of repair area, vertically distributed from the middle and bottom to the top direction. Collagen was observed on the surface of repair area in the experimental group 3. The cartilage-like cells presented clumped distribution on the surface and at the bottom of scaffold. The type I collagen expression in the repair area was strongly positive in these four experimental groups. The type II collagen expression in the repair area of experimental 1 and experimental 2 groups was weak. The type II collagen expression in the repair area of experimental 3 and experimental 4 groups was strongly positive. These results demonstrate that these two kinds of silk fibroins can both repair osteochondral defects, in which mulberry silk proteins tend to form bone tissue, and tussah silk proteins tend to form cartilage tissue.

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中图分类号:

R318

王虔，马云胜，李德华. 不同来源蚕丝蛋白修复骨软骨组织缺损的效果比较[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.009.

Wang Qian, Ma Yun-sheng, Li De-hua. Silk fibroins from different sources repair osteochondral defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.52.009.

图/表（结果） 2

2.1 蚕丝蛋白支架的大体观察和电镜下结构蚕丝蛋白支架的微细结构见图1，内部具有丰富的孔隙，并且孔隙间是开发式的微型体系结构，即每个面上与周边几乎都有相通的孔。扫描电镜图显示，不论是桑蚕还是柞蚕蚕丝支架，其内部孔径大小不等。柞蚕丝蛋白支架比桑蚕丝蛋白支架的孔更加开放，交通孔更多些，孔壁边界更清晰。桑蚕和柞蚕丝蛋白支架的三维孔隙网络分别为(69±11) µm和(73±11) µm，此外支架孔隙率为73%-81%，柞蚕丝蛋白支架的最大孔径为(81±11) µm。

2.2 体内骨软骨修复区组织学观察结果移植填充多层桑蚕丝蛋白支架及柞蚕丝蛋白的动物关节软骨缺损区情况见图2A-C。在支架移植后8周，移植各组缺损区均可见明显的界线(图2D)。大体观察，移植各组修复再生区表面都较光滑，覆盖着洁白的新生组织。显微镜下观察，实验1组和实验3组支架复合物内的细胞并没有至始至终维持其原有的形态(图3，4)，而实验2组和实验4组的细胞始终维持其原来的形态(图5，6)。移植各组修复区域的细胞外基质都被天狼星红染料染成了特征性的红色，表明新生成的基质内胶原含量丰富。除实验1组外，阿新蓝染色阳性与葡萄糖胺聚糖集聚相一致。各实验组无论添加或不添加生长因子，顶层蚕丝蛋白支架上细胞的存在有利于封闭缺损表面，而空白对照组则缺损表面未能关闭。

实验1组中胶原蛋白形成的量非常丰富，可见缺损区全层被染成红色(图3A)。实验2组可见支架内的胶原纤维排列整齐，在修复表面呈平行分布，在中间和底部区域呈垂直顶部的方向分布(图5A)。实验3组只在缺损修复区表面可见染成红色的胶原，支架复合物中间和底部主要是含有丰富葡萄糖胺聚糖的细胞外基质成分，被染成蓝色(图4A)。实验4组可见支架复合物表面和底部软骨样细胞有成团分布表现，而且只有此组细胞有这种分布情况(图6A)。通过阿新蓝/天狼星红染色图像合并方法对体内修复区进行分析，再次验证了组织学的发现(图3B，图4B，图5B，图6B)。所有移植实验组再生修复区底部都可见有血管组织生成(图3A，图4A，图5A，图6A)。空白对照组骨软骨缺损区在8周后都未能修复，表现为缺损区清晰可见，并且未能由细胞外基质完全填充。
2.3 体内骨软骨修复区免疫组织化学观察结果各移植实验组修复区细胞外基质大部分区域都强表达I型胶原蛋白，只有少量区域为阴性(图3C，图4C，图5C，图6C)。
实验1组和实验2组修复区微弱表达Ⅱ型胶原蛋白(图3D，图5D)。实验3组和实验4组修复区Ⅱ型胶原蛋白呈强阳性表达(图4D，6D)。特别是在实验4组中，通过阿新蓝染色可见透明软骨样组织，Ⅱ型胶原蛋白在缺损修复的表面区呈现高度集中表达，软骨样细胞外观体积更大，且呈Ⅱ型胶原蛋白阳性反应，这提示有向缺损基底部软骨内成骨的趋势(图6D)。

参考文献

[1] Martin I, Miot S,Barbero A,et al.Osteochondral tissue engineering. J Biomech.2007; 40:750-765.
[2] Nukavarapu SP,Dorcemus DL.Osteochondral tissue engineering: Current strategies and challenges.Biotechnol Adv.2013;31:706-721.
[3] Horner EA,Kirkham J,Wood D,et al.Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice.Tissue Eng Part B Rev.2010;16:263-271.
[4] Melton JT,Wilson AJ,Chapman-Sheath P,et al.bone plug: chondral repair, scaffold design, surgical technique and early experiences.Expert Rev Med Devices.2010;7:333-341.
[5] Omenetto FG,Kaplan DL.New opportunities for an ancient material.Science.2010;329: 528-531.
[6] Kundu B,Rajkhowa R,Kundu SC,et al.Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations.Adv Drug Deliv Rev.2013;65: 457-470.
[7] Velema J,Kaplan D.Biopolymer-based biomaterials as scaffolds for tissue engineering.Adv Biochem Eng Biotechnol. 2006;102:187-238.
[8] Wray LS,Rnjak-Kovacina J,Mandal BB,et al.A silk-based scaffold platform with tunable architecture for engineering critically-sized tissue constructs. Biomaterials. 2012;33: 9214-9224.
[9] Rodrigues MT,Gomes ME,Reis RL.Current strategies for osteochondral regeneration: from stem cells to pre-clinical approaches.Curr Opin Biotechnol.2011;22(5):726-733.
[10] Patra C,Talukdar S,Novoyatleva T,et al.Silk protein fibroin from Antheraea mylitta for cardiac tissue engineering. Biomaterials.2012;33:2673-2680.
[11] Rockwood DN,Preda RC,Yucel T,et al.Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.Nat Protoc.2011;6:1612-1631.
[12] Saha S,Kirkham J,Wood D,et al.Comparative study of the chondrogenic potential of human bone marrow stromal cells, neonatal chondrocytes and adult chondrocytes.Biochem Biophys Res Commun.2010;401:333-338.
[13] Mandal BB,Grinberg A,Seok Gil E,et al.High-strength silk protein scaffolds for bone repair.PNAS.2012;109:7699-7704.
[14] Vunjak-Novakovic G,Obradovic B,Martin I,et al.Dynamic cell seeding of polymer scaffolds for cartilage tissue engineering. Biotechnol Prog.1998;14:193-202.
[15] Bhardwaj N,Kundu SC.Chondrogenic differentiation of rat MSCs on porous scaffolds of silk fibroin/chitosan blends. Biomaterials.2012;33:2848-2857.
[16] Shao X,Goh JC,Hutmacher DW,et al.Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model. Tissue Eng.2006;12(6):1539-1551.
[17] Seda T??l? R,Ghosh S,Laha MM,et al.Comparative chondrogenesis of human cell sources in 3D scaffolds.J Tissue Eng Regen Med.2009;3(5):348-360.
[18] Hunziker EB.Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects.Osteoarthritis Cartilage.2002;10(6):432-463.
[19] Shanmugasundaram S,Chaudhry H,Arinzeh TL.Microscale versus nanoscale scaffold architecture for mesenchymal stem cell chondrogenesis.Tissue Eng Part A.2011;17(5-6):831-840.
[20] Stenhamre H,Nannmark U,Lindahl A,et al.Brittberg M Influence of pore size on the redifferentiation potential of human articular chondrocytes in poly(urethane urea) scaffolds. J Tissue Eng Regen Med.2011;5(7):578-588.
[21] Im GI,Ko JY,Lee JH.Chondrogenesis of adipose stem cells in a porous polymer scaffold: influence of the pore size.Cell Transplant.2012;21(11):2397-2405.
[22] Mandal BB,Das S,Choudhury K,et al.Implication of silk film RGD availability and surface roughness on cytoskeletal organization and proliferation of primary rat bone marrow cells.Tissue Eng Part A.2010;16(7):2391-2403.
[23] Yang HS,La WG,Bhang SH,et al.Apatite-Coated Collagen Scaffold for Bone Morphogenetic Protein-2 Delivery.Tissue Eng Part A.2011;17:2153-2156.
[24] Chen S,Xuetao S,Morita H,et al.BMP-2-loaded silica nanotube fibrous meshes for bone generation.Sci Technol Adv Mater.2011;12:065003.
[25] Meinel L,Betz O,Fajardo R,et al.Silk based biomaterials to heal critical sized femur defects.Bone.2006;39:922-931.
[26] Riccio M,Maraldi T,Pisciotta A,et al.Fibroin scaffold repairs critical-size bone defects in vivo supported by human amniotic fluid and dental pulp stem cells.Tissue Eng Part A.2012;18: 1006-1013.

引言

骨软骨缺损治疗手段包括同种异体移植、激发骨髓再生修复及清创术，但异体移植涉及免疫排斥和疾病传播问题，而激发骨髓再生修复只是临时的姑息手段并不是完全治愈性手段^[1-2]。骨组织工程采用生物材料、干细胞和生长因子为治疗骨软骨缺损提供了一个非常有前景的治疗方案。目前为止已有一些支架材料作为骨和软骨缺损的再生填充物，如羟基磷灰石和间充质干细胞、重组人骨形态发生蛋白、磷酸钙骨结合蛋白及聚乳酸-羟基乙酸共聚物^[3]。大部分支架材料都存在局限性，如不能长期支撑组织再生，容易引起感染和免疫排斥反应，新生组织的形成与材料降解时间不匹配等问题^[4]。蚕丝是自然界里非常丰富的原材料，蚕丝蛋白具有极好的生物组织相容性，降解产物无毒性，此外其降解速度可控，具有较高强度、韧性、透湿性和三维孔隙结构。蚕丝支架已被应用于多种组织的再生治疗，目前美国食品和药物管理局(FDA)已批准其可作为韧带和肌腱组织修复材料，并在商业市场上推广。目前的高分子复合物不能同时满足骨和软骨缺损修复的需求，因此寻找合适的具有良好修复能力的材料是临床上迫切需要解决的问题。困难仍然在于如何提高和改善新生成组织与周围组织及骨和软骨接触面的整合性问题。本实验对不同来源的蚕丝蛋白(桑蚕/柞蚕)支架进行研究，包括其体内骨软骨再生能力。
属于转化生长因子超级家族的成员在组织工程领域发挥着重要的作用。转化生长因子β在体内外都参与了软骨诱导^[5]。骨形态发生蛋白尤其是骨形态发生蛋白2，被证明具有骨诱导能力^[6]，其被FDA批准用于治疗长骨骨折。然而，关于在体内联合使用转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2复合蚕丝蛋白支架重建骨软骨的研究还未见到报道。
蚕丝作为骨或软骨组织工程的支架材料，其对骨和软骨组织再生的支持作用在体内还未见评估报道。骨软骨的再生比单纯的骨或软骨组织再生更加复杂，因为支架和种子细胞需要对关节软骨进行修复，此外还需要骨和软骨交界面下软骨下骨的支持^[7]。虽然关于采用蚕丝蛋白支架在体内外对单纯软骨或单纯骨组织再生的研究已有一些报道，但很少有采用蚕丝蛋白在体内进行骨软骨缺损再生的研究^[8]。据了解，目前还没有关于体内对比桑蚕和柞蚕(非桑蚕)来源的蚕丝蛋白对骨软骨修复的效果。本实验的目的是评估桑蚕和非桑蚕来源支架材料对骨或软骨的诱导能力，然后对两种支架材料的天然属性进行比较。此外实验还进一步采用生长因子转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2，观察多层无细胞蚕丝蛋白支架对细胞浸润和新基质形成方面的作用，借此来分析两种不同来源蚕丝蛋白作为三维种植平台方案对骨软骨再生治疗的效果。

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材料方法

1.1 设计平行观察对照实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1至11月在辽宁医学院人体解剖学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选取12月龄健康雄性新西兰白兔20只，购于辽宁医学院实验动物中心(辽卫2013-035)，体质量4.5 kg左右。

1.4 实验方法

蚕丝蛋白支架制备及扫描电镜检测：将桑蚕和柞蚕蚕茧切成碎块，在0.02 mol/L Na₂CO₃中煮沸1 h，以去除高亲水性的蛋白丝胶，获得21%的蚕丝蛋白。将脱掉丝胶的蚕丝蛋白用流水彻底冲洗过夜，然后干燥，最后用9.3 mol/L溴化锂溶解上述蚕丝蛋白，产出蚕丝蛋白溶液^[8]。将蚕丝蛋白溶液用12 ku透析管进行透析，同时不停搅动溶液。将水性蚕丝蛋白溶液入5 mm×4 mm 模具中，冻干后获得三维蚕丝蛋白支架。通过扫描电子显微镜检测蚕丝蛋白支架内部孔隙性，采用图像分析系统选取16个电镜视野计算平均孔大小。

支架体内置入实验: 采用骨钻在20只兔一侧膝关节髌骨凹槽内制备直径4 mm、深3 mm的骨软骨缺损，随机分为5组，每组4只，其中1组为空白对照组，关节缺损区空置；实验1组将3层桑蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处；实验2组将1个包被转化生长因子β3(1 mg/L)的桑蚕丝蛋白支架与2个包被骨形态发生蛋白2(0.1 g/L)的桑蚕丝蛋白支架粘在一起^[9]，充填于缺损处；实验3组将3层柞蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处；实验4组将1个包被转化生长因子β3 (1 mg/L)的柞蚕丝蛋白支架与2个包被骨形态发生蛋白2 (0.1 g/L) 的柞蚕丝蛋白支架粘在一起，充填于缺损处。

1.5 主要观察指标

支架孔隙率测量: 支架材料的孔隙率采用溶剂置换法进行，将支架浸入装有已知量乙烷溶剂(体积为V1)刻度量筒中。10 min后，乙烷完全渗透到支架内部的孔隙内并导致溶剂量减少，再经过5 min后，根据浸入到支架内部的乙烷量(V2)与外面剩余的乙烷量(V3)可以计算出孔隙率^[9]。

关节软骨修复组织病理学观察：术后8周，将移植修复区组织固定于体积分数10%中性甲醛溶液中，组织逐级脱水，二甲苯透明并包埋于石蜡中，做5 µm厚的连续切片。将切片进行0.5%阿新蓝/0.3%天狼猩红染色^[10]，显微镜下进行拍照并行NIS图像系统进行分析，同样采用盲测法对细胞分化情况进行分析。

免疫组织化学法检测：分别采用Ⅰ型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白抗体检测移植区域再生组织，制作5 µm厚石蜡切片，脱蜡后梯度乙醇逐级入水，体积分数1%过氧化氢清除内源性过氧化物酶，以柠檬酸盐进行抗原修复，采用体积分数5%牛血清封闭10 min。然后将样本与兔抗I型胶原蛋白和II型胶原蛋白抗体(1∶200)孵育并于4 ℃下过夜。次日用HRP标记的羊抗兔二抗(1∶200)孵育1 h，DAB显色处理，用苏木精复染细胞核，于显微镜下观察。

1.6 统计学分析数据实验所得所有数据采用x(_)±s表示，采用SPSS 16.0统计软件包进行统计分析。

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讨论

修复骨软骨缺损并再生的关键是要有合适的细胞来源、具有良好三维空间结构支架材料及生物诱导微环境^[11-12]。软骨细胞有一定的增殖分裂能力，但修复骨软骨缺损往往需要大量的软骨细胞，因此供体细胞来源不足是一个很大的问题。原始的骨髓间充质干细胞具有向多个胚层、多个细胞系分化的潜能，在合适条件下分化为成骨细胞和成软骨细胞^[13]，而且可从自体取得细胞来源，通过体外扩增的方法获取足够多的细胞数量。但如果将骨髓间充质干细胞直接移植到骨软骨缺损处，大部分细胞可能会从缺损部位流失^[14]。将细胞与合适的支架联合应用，可有效保存局部细胞数量并有效填充缺损。
支架内部孔隙的大小对细胞分化非常重要，因为其影响细胞外基质的构造及最终组织的形成^[15]。文献报道支架内部孔径<150 µm 是最适合成软骨分化的尺寸，而支架内部孔径<100 µm则有助于骨软骨形成并适合低氧环境^[16]。本实验中的蚕丝蛋白支架材料具有开放式的相互交通的孔隙，这有助于细胞外基质的形成、营养物质充分的渗透及新生血管的形成^[17]。柞蚕蚕丝蛋白具有天然Arg-Gly-Asp三肽序列结构[18]，这有助于细胞的黏附、细胞间相互作用及组织再生。在此基础上，作者采用冷冻技术将蚕丝蛋白材料在-20 ℃下冷冻 24 h，最终获得的孔径直径及孔径几何形状都与生理松质骨结构非常接近^[19-20]，其孔隙率达到了50%-90%^[21-22]。本实验中两种蚕丝蛋白支架相似的孔径尺寸及孔隙率，剔除了因孔径物理问题而干扰后期实验结果的分析。
添加生长因子来修复骨软骨缺损，能够使支架发挥更好的功能。本实验中，分别采用两种生长因子转化生长因子β和骨形态发生蛋白2按照逆向浓度梯度的方式来发挥作用。例如，对于某个缺损区，转化生长因子β浓度是在支架的某一端最高，这样有助于软骨再生；而骨形态发生蛋白2在支架的另一端浓度最高，这样有助于骨发生。为了使这个策略得以实现，将支架制成圆盘状，采用纤维蛋白胶将不同的层进行黏附，然后插入到骨软骨缺损区，通过此方式来模拟骨软骨组织的实际情况^[22]。众所周知，骨形态发生蛋白2较骨形态发生蛋白4在体内修复软骨下骨方面有更好的成骨诱导发生潜能。骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3的浓度是根据不同类型的支架材料文献报道选择的^[23]，事先采用染料预实验分析出每个设计的支架达到最佳的最大吸收量为 3 µL。目前的研究也有助于认识生长因子在骨缺损区新生骨软骨复合物形成及功能整合等方面的重要性。
同时，实验中所有的体内修复再生组织与宿主组织间的整合性非常好，而骨软骨组织细胞外基质的形成在移植组和空白对照组之间或在桑蚕丝蛋白支架组和柞蚕丝蛋白支架组间都是有差别的。各移植组的修复组织区都显示具有不同密度的细胞网络，并可见清晰和完整的支架结构。组织学和免疫组织化学显示，这些修复物中含有大量未完成的软骨发生过程^[24]。这可能是由于体内修复的时间相对较短的缘故。由于实验的最初目的是评估来源于不同种属蚕丝蛋白对骨软骨再建的潜能，因此选择了8周这个时间点，并认为这个时间足够发生组织学或免疫组织化学方面的变化。作者发现再生组织的细胞外基质成分不尽相同，这与蚕丝蛋白的种属来源(桑蚕和柞蚕)及是否添加了细胞生长因子有关^[25]。桑蚕丝蛋白支架构建的复合物显示大量的血管形成，并向基地部延伸；然而在柞蚕丝蛋白支架构建的复合物上只见到支架内部有少量血管和大的软骨样细胞，这提示再生修复物内可能出现软骨内成骨现象^[26]。桑蚕丝蛋白支架修复物的细胞外基质主要为I型胶原蛋白，而柞蚕丝蛋白修复物内部细胞外基质主要是蛋白聚糖、I型胶原蛋白和Ⅱ型胶原蛋白的混合物。
综合以上的数据发现，实验结果显示在体内移植8周后，蚕丝蛋白支架能够修复兔膝关节骨软骨缺损，具有天然的吸引内源性关节区细胞向骨和软骨组织分化的能力，桑蚕丝蛋白支架倾向于形成骨组织，柞蚕丝蛋白支架倾向于形成软骨组织。

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