干细胞标志物CD133在神经母细胞瘤中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.50.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经母细胞瘤是婴幼儿和儿童最常见的实体肿瘤之一，靶向肿瘤干细胞的治疗能够有望从根本上治愈肿瘤，但是肿瘤干细胞数量较少，并具有抗凋亡、抗放化疗能力等，导致其对于放疗、化疗并不敏感。
目的：探究干细胞标志物CD133在神经母细胞瘤中的表达及其临床意义。
方法：收集2004年6月至2014年2月新疆医科大学第一附属医院小儿外二科诊治的58例神经母细胞瘤患儿临床资料，其中神经母细胞瘤患儿46例，节细胞母细胞瘤患儿12例，通过免疫组织化学分析法分析所有患儿肿瘤组织中的CD133表达水平，并研究神经母细胞瘤的病理分型、INSS分期、术后存活时长与CD133表达水平之间存在的联系。
结果与结论：共有22例(48%)神经母细胞瘤患儿CD133表达为阳性，有4例(33%)节细胞母细胞瘤患儿CD133表达阳性，肿瘤细胞胞浆为CD133主要表达部位。肿瘤组织各临床分期的CD133阳性率差异明显，其中1，2期为21%，3，4期为64%，4S期为36.4%，差异有显著性意义(P=0.011)；组织分型为预后良好型患儿CD133阳性率为29%，明显低于预后不良组织型患儿(57%)，差异有显著性意义(P=0.031)。CD133阴性患儿生存周期显著长于CD133阳性患儿(P < 0.05)。结果表明干细胞标志物CD133的表达与神经母细胞瘤发生、发展、转归有密切联系，在评估患儿术后存活时长、改进该病的诊断和治疗等方面具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 神经母细胞瘤, CD133, 阳性率, 预后

Abstract:

BACKGROUND: Neuroblastoma is the most common solid tumor in infants and children. Targeting cancer stem cell therapy can be expected to cure cancer radically, but because of small number, anti-apoptotic and anti-chemotherapy capacity, cancer stem cells are not sensitive to the radiotherapy and chemotherapy.
OBJECTIVE: To explore the expression of stem cell marker CD133 in neuroblastoma and its clinical significance.
METHODS: Fifty-eight children with neuroblastoma admitted at Department of Pediatric Surgery, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, China from June 2004 to February 2014 were enrolled, including 46 cases of neuroblastoma and 12 cases of ganglion neuroblastoma. Then, the expression level of CD133 was analyzed by immunohistochemistry method, and the relationship between pathological types, International Neuroblastoma Staging System stage, survival time after surgery and the expression level of CD133 was explored.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 22 cases (48%) of neuroblastoma positive for CD133, and 4 cases (33%) of ganglion neuroblastoma positive for CD133. CD133 mainly expressed in the tumor cell cytoplasm. The expression rates of CD133 in different clinical stages were significantly different (P=0.011), which were 21% for stages 1 and 2, 64% for stages 3 and 4, 36% for stage 4S. And the positive rates of CD133 between patients with good prognosis and patients with poor prognosis were significantly different (P=0.031), which were 29% and 57%, respectively. The life cycle of CD133-negative patients was significantly longer than that of CD133-positive infants
(P < 0.05). There were tightly connections between CD133 and the occurrence, development, and prognosis of neuroblastoma, and thus, CD133 is of great significance to assess the survival time after surgery and improve of the diagnosis and treatment of neuroblastoma.

中图分类号:

R394.2

樊珈榕，李万福，梁挺. 干细胞标志物CD133在神经母细胞瘤中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(50): 8090-8094.

Fan Jia-rong, Li Wan-fu, Liang Ting . CD133, a stem cell marker, in neuroblastoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(50): 8090-8094.

图/表（结果） 4

2.1 肿瘤组织CD133的表达情况免疫组织化学分析显示58例神经母细胞瘤患者中共有26例的肿瘤组织CD133表达阳性(44.8%)，其中弱阳性(+)10例、中度阳性(++)9例、强阳性(+++)7例。CD133染色阳性肿瘤细胞数在不同INSS分期的患儿中有所不同，结果见图1。部分病例的免疫组化分析显示肿瘤组织的血管间皮细胞、间质纤维结缔组织亦有CD133的表达。

2.2 INSS分期与CD133表达之间的关系随着分期的增加，CD133阳性率也逐渐升高。其中1期和2期肿瘤组织免疫组化显示CD133表达阳性有4例(21%，4/19)，3期和4期CD133表达阳性有18例(64%，18/28)，4S期有4例(36.4%，4/11)。各期肿瘤组织的CD133表达水平差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。
2.3 神经母细胞瘤组织类型、病理分型与CD133表达之间的关系神经母细胞瘤型共有27例CD133表达阳性(59%，27/46)，节细胞母细胞瘤型有3例(25%，3/12)，Fisher精确概率法分析显示差异有显著性意义(P=0.038)。预后良好组织型有8例CD133表达阳性(29%，8/28)，预后不良好组织型有17例CD133表达阳性(57%，17/30)，Fisher精确概率法显示差异有显著性意义(P=0.031)，结果见表1。

2.4 神经母细胞瘤患儿术后存活时长与CD133表达、临床分期分期、病理分型、组织类型的关系共有38例患儿接受了完整的术后随访，其中神经母细胞瘤32例、节细胞母细胞瘤6例，随访结果显示CD133表达阳性患儿存活时长明显低于CD133表达阴性患儿，差异有显著性意义(P < 0.05)，结果见表2。

2.5 不同CD133表达率的神经母细胞瘤患儿的生存曲线从图2神经母细胞瘤患儿存活周期可以看出：CD133阴性患儿生存周期显著长于CD133阳性患儿(P < 0.05)。

参考文献

[1] Chen X,Zhu YJ,Han LL,et al.Chemokine receptor 4 gene silencing blocks neuroblastoma metastasis in vitro. Neural Regen Res. 2014;9(10): 1063-1067.

[2] Kushner BH, Modak S, Kramer K, et al. Striking dichotomy in outcome of MYCN-amplified neuroblastoma in the contemporary era. Cancer. 2014;120(13):2050-2059.

[3] Hashimoto K, Aoyagi K, Isobe T, et al. Expression of CD133 in the cytoplasm is associated with cancer progression and poor prognosis in gastric cancer. Gastric Cancer. 2014; 17(1):97-106.

[4] Meany HJ, London WB, Ambros PF, et al. Significance of clinical and biologic features in Stage 3 neuroblastoma: a report from the International Neuroblastoma Risk Group project. Pediatr Blood Cancer. 2014;61(11):1932-1939.

[5] Minter MR, Zhang M, Ates RC, et al. Type-1 interferons contribute to oxygen glucose deprivation induced neuro-inflammation in BE(2)M17 human neuroblastoma cells. J Neuroinflammation. 2014;11:43.

[6] Tirino V, Desiderio V, Paino F, et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 2013;27(1):13-24.

[7] Williams SA, Anderson WC, Santaguida MT, et al. Patient-derived xenografts, the cancer stem cell paradigm, and cancer pathobiology in the 21st century. Lab Invest. 2013;93(9):970-982.

[8] Meany HJ, London WB, Ambros PF, et al. Significance of clinical and biologic features in Stage 3 neuroblastoma: a report from the International Neuroblastoma Risk Group project. Pediatr Blood Cancer. 2014;61(11):1932-1939.

[9] Zhang D, Sun B, Zhao X, et al. Twist1 expression induced by sunitinib accelerates tumor cell vasculogenic mimicry by increasing the population of CD133+ cells in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2014;13:207.

[10] Chen L, Chang WC, Hung YC, et al. Androgen receptor increases CD133 expression and progenitor-like population that associate with cisplatin resistance in endometrial cancer cell line. Reprod Sci. 2014;21(3):386-394.

[11] Oktem G, Bilir A, Uslu R, et al. Expression profiling of stem cell signaling alters with spheroid formation in CD133high/ CD44high prostate cancer stem cells. Oncol Lett. 2014;7(6): 2103-2109.

[12] Shin JH, Lee YS, Hong YK, et al. Correlation between the prognostic value and the expression of the stem cell marker CD133 and isocitrate dehydrogenase1 in glioblastomas. J Neurooncol. 2013;115(3):333-341.

[13] Braekeveldt N, Wigerup C, Gisselsson D, et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours. Int J Cancer. 2015;136(5):E252-261.

[14] Albanus RD, Juliani Siqueira Dalmolin R, Alves Castro MA, et al. Reverse engineering the neuroblastoma regulatory network uncovers MAX as one of the master regulators of tumor progression. PLoS One. 2013;8(12):e82457.

[15] Rihani A, Van Maerken T, De Wilde B, et al. Lack of association between MDM2 promoter SNP309 and clinical outcome in patients with neuroblastoma. Pediatr Blood Cancer. 2014;61(10):1867-1870.

[16] Mai HM, Zheng JW, Wang YA, et al. CD133 selected stem cells from proliferating infantile hemangioma and establishment of an in vivo mice model of hemangioma. Chin Med J (Engl). 2013;126(1):88-94.

[17] El-Khattouti A, Selimovic D, Haïkel Y, et al. Identification and analysis of CD133(+) melanoma stem-like cells conferring resistance to taxol: An insight into the mechanisms of their resistance and response. Cancer Lett. 2014;343(1):123-133.

[18] Van Craenenbroeck EM, Van Craenenbroeck AH, van Ierssel S, et al. Quantification of circulating CD34+/KDR+/CD45dim endothelial progenitor cells: analytical considerations. Int J Cardiol. 2013;167(5):1688-1695.

[19] 曲利园,王亚东,王贵齐,等.国内外大肠癌筛查现状分析及对我国大肠癌筛查的建议[J].中国全科医学,2007,10(19):1584-1586.

[20] Hou Y, Zou Q, Ge R, et al. The critical role of CD133(+)CD44(+/high) tumor cells in hematogenous metastasis of liver cancers. Cell Res. 2012;22(1):259-272.

[21] Kim HM, Haraguchi N, Ishii H, et al. Increased CD13 expression reduces reactive oxygen species, promoting survival of liver cancer stem cells via an epithelial-mesenchymal transition-like phenomenon.Ann Surg Oncol. 2012;19 Suppl 3:S539-548.

[22] Sukowati CH, Anfuso B, Torre G, et al. The expression of CD90/Thy-1 in hepatocellular carcinoma: an in vivo and in vitro study. PLoS One. 2013;8(10):e76830.

[23] Michishita M, Ezaki S, Ogihara K, et al. Identification of tumor-initiating cells in a canine hepatocellular carcinoma cell line. Res Vet Sci. 2014;96(2):315-322.

[24] Yamashita T, Honda M, Nakamoto Y, et al. Discrete nature of EpCAM+ and CD90+ cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2013;57(4): 1484-1497.

[25] Ma S, Lee TK, Zheng BJ, et al. CD133+ HCC cancer stem cells confer chemoresistance by preferential expression of the Akt/PKB survival pathway. Oncogene. 2008;27(12): 1749-1758.

[26] Piao LS, Hur W, Kim TK, et al. CD133+ liver cancer stem cells modulate radioresistance in human hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2012;315(2):129-137.

[27] Salnikov AV, Kusumawidjaja G, Rausch V, et al. Cancer stem cell marker expression in hepatocellular carcinoma and liver metastases is not sufficient as single prognostic parameter. Cancer Lett. 2009;275(2):185-193.

[28] Rege TA, Hagood JS. Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. FASEB J. 2006; 20(8):1045-1054.

[29] Dan YY, Riehle KJ, Lazaro C, et al. Isolation of multipotent progenitor cells from human fetal liver capable of differentiating into liver and mesenchymal lineages.Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(26):9912-9917.

[30] Ishizawa K, Rasheed ZA, Karisch R, et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 2010; 7(3):279-282.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点于2004年6月至2014年2月在新疆医科大学第一附属医院完成。
1.3 对象选择58例于2004年6月至2014年2月入新疆医科大学第一附属医院小儿外二科诊治的神经母细胞瘤患儿，其中男35例，女23例，年龄18个月-7.8岁，平均(2.8±3.5)岁。所有患儿均通过组织病理学检查确诊为神经母细胞瘤。病理类型：神经母细胞瘤患儿46例，节细胞母细胞瘤患儿12例。肿瘤解剖学定位于纵膈者11例、肾上腺32例、后腹膜15例。依据神经母细胞瘤国际分期系统(International Neuroblastoma Staging System，INSS)[4]，对所有患儿进行临床分期：其中1期9例、2期10例、3期12例、4期16例、4S期11例。
纳入标准：①入选患儿均经过病理诊断确诊为神经母细胞瘤。②入选患儿年龄<8岁。③患儿家属对实验方案、实验目的知情同意，且自愿参加此次研究。
排除标准：①不符合临床诊断标准者。②合并心血管疾病者。③精神异常或心、肝、肾功能异常者。
根据Minter等[5]提供的方法，计算肿瘤细胞有丝分裂核碎裂指数和判断病理分型：预后良好组织型：①任意年龄段发生、肿瘤组织基质丰富、肿瘤组织无结节。②年龄1.5-5岁、肿瘤细胞组织较少、组织分化较好、有丝分裂核碎裂指数<100。③年龄≤1.5岁、肿瘤组织基质少、有丝分裂核碎裂指数< 200。预后不良好组织型：①任意年龄段发生、肿瘤组织基质丰富有结节。②年龄> 5岁，肿瘤基质少。③年龄1.5-5岁，肿瘤组织基质少伴肿瘤组织分化不良。④年龄1.5-5岁、肿瘤基质少伴分化良好，但有丝分裂核碎裂指数> 100。⑤年龄< 1.5岁、肿瘤组织基质少、有丝分裂核碎裂指数> 200。58例患者中预后良好组织型28例，预后不良好组织型30例。
所有患儿手术前均未接受放疗或者化疗，术后有34例患儿因肿瘤过大，术中病理分型结果不佳等原因接受放疗、化疗治疗方案2-6个疗程。术后共有38例患儿接受了完整的随访，其中神经母细胞瘤32例、节细胞母细胞瘤6例，随访时长9个月至6年，术后存活时间定义为手术日期至随访终止日期或者患儿因复发、转移而死亡的日期。
1.4 方法
1.4.1 免疫组织化学分析肿瘤组织分别来源于手术切除30例(其中完全切除19例、部分切除11例)、肿瘤组织活检28例。所得肿瘤组织均采用体积分数为10%甲醛固定 24 h，石蜡包埋、切片(厚度4.0-5.0 μm)。运用链霉卵白素-生物素-辣根过氧化物酶复合物法对处理好的肿瘤组织行免疫组织化学分析。选用武汉博士德技术有限公司提供的兔抗人CD133单克隆抗体(浓度为1︰200)，其余免疫组化试剂均由上海长岛生物技术有限公司提供。
1.4.2 CD133阳性判定标准免疫组化染色完毕后，将标本置于显微镜下观察肿瘤细胞，胞质内有物质着色为棕色者即表示为CD133表达阳性。高倍镜下每份标本随机选取15-20个视野，统计1 000个肿瘤细胞中CD133表达阳性的细胞数，依据CD133表达阳性细胞所占比例判断神经母细胞瘤的CD133表达水平：其中阴性(-)<5%、弱阳性(+)6%-25%、中度阳性(++)26%-50%、强阳性(+++) > 50%。
1.5 主要观察指标 ①神经母细胞瘤患儿肿瘤组织CD133的表达情况。②神经母细胞瘤患儿NSS分期与CD133表达之间的关系。③神经母细胞瘤组织类型、病理分型与CD133表达之间的关系。
1.6 统计学分析将所得数据录入SPSS 19.0软件行统计学分析，计数资料以百分数表示，行卡方检验，计量资料用x(_)±s表示，组间比较行t 检验，采用Fisher行精确概率检验，应用Kaplan-Meier分析患儿术后存活时长并绘制存活时长曲线，采用Log-rank模型分析差异性，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

既往曾有学者研究显示肿瘤组织中的干细胞具有高度繁殖、多向分化和无限自我更新等能力，是肿瘤组织异质性形成的关键^[6]。Williams等[7]研究结果显示，肿瘤干细胞的诸项特性是肿瘤产生耐药性、高复发率、高转移率的重要原因。有研究结果表明，具有肿瘤干细胞特性的干细胞样细胞同样存在于神经母细胞中，Meany等^[8]对41例神经母细胞瘤患儿的肿瘤细胞行Hoechst染料染色，并进行肿瘤细胞的流式细胞分选，发现有18例的肿瘤细胞中存在不同比例(1.1%-49%)的侧群干细胞，这说明了肿瘤干细胞确实存在于神经母细胞瘤中。由于肿瘤干细胞对神经母细胞瘤来说具有重要意义，针对肿瘤干细胞的进一步研究，将有助于提高人类对神经母细胞瘤的发生、进展、转归的认识，对于该病的早期发现、诊断和治疗方面具有独特的价值。
作为一种造血干细胞标志物，CD133以跨膜蛋白的形式存在于胎肝、骨髓、脐血、动员前后的外周血等造血组织的CD34+细胞亚群上，其分子质量为120 ku。曾有学者研究发现，CD133的mRNA转录本同样存在于肾、胎盘、成人肝、胰腺、心、脑、肺等非淋巴造血系统上，而畸胎瘤细胞系NT-2以及视网膜母细胞瘤细胞系Y79和WERI-Rb-1中同样可发现CD133的存在^[9]。国内外学者发现，CD133同样表达于人类神经嵴干细胞，Chen等^[10]通过流式细胞分离技术，成功的从胎儿脑细胞中提取到CD34-/CD133+/CD45-表型免疫细胞，同时他们发现这些免疫细胞也具有多向分化、自我更新等神经干细胞基本特性。Oktem等^[11]在研究脑肿瘤-恶性髓母细胞瘤和毛细胞型星形细胞瘤这两种常见的小儿恶性神经系统肿瘤时发现，CD133抗体免疫磁珠可以从肿瘤细胞悬液中分离出肿瘤干细胞，这表明了CD133是这两种肿瘤细胞的表面标志蛋白，研究同时发现了另一种神经干细胞表面标志物-巢蛋白表达于这两种肿瘤细胞表面上。虽然这些研究显示CD133阳性的神经干细胞占所有肿瘤细胞的比例很小，但是体外悬液培养发现，该类细胞具有较强的自我复制和多向分化能力，对肿瘤的发展具有重要意义。Shin等^[12]通过动物实验证实了以上观点，他们向严重免疫功能缺陷合并1型糖尿病模型的小鼠脑内注射1 000个CD133阳性的神经肿瘤干细胞，导致了全部小鼠脑肿瘤的发病，而注射1 000个CD133阴性的神经肿瘤细胞却不能导致小鼠脑肿瘤的发病^[13-14]。
本次研究结果显示，神经母细胞瘤肿瘤组织中有部分细胞免疫组化结果为CD133阳性。目前关于神经母细胞瘤细胞的形态学分型国内外学者已达成共识，神经母细胞瘤划分以下3类基本类型：N型(神经母细胞型)、S型(平坦的贴壁型)、介于N型和S型之间的I型^[15-16]。N型表现为交感神经细胞特性，S型包含许旺细胞、平滑肌前体细胞、黑色素细胞等胚胎神经嵴非神经元组分，而I型细胞不仅具有N型细胞的表面标志物，也具有S型细胞的表面标志物^[17-18]。通过研究对比这3类细胞的体内外生物活性，Rihani等^[15]发现I型细胞符合神经肿瘤干细胞的基本特征，具有最强的恶性自我更新和多向分化能力，其发展为神经系统肿瘤的潜能最大^[19-20]。有研究者通过免疫组化分析17种不同亚型(均包含于N型、S型、I型)神经母细胞瘤细胞的胞膜表面标志物，只有I型的神经母细胞瘤细胞显示有CD133的表达，其余两种CD133染色显示均为阴性^[21-22]。作者认为在神经母细胞瘤细胞中能显示为CD133阳性的I型细胞可能就是神经母细胞瘤的肿瘤干细胞，至于该项推测是否正确，有待于单独提取并分析CD133表达阳性的I型细胞的生物学特性来证实^[23]。
本次研究发现，部分神经母细胞瘤的免疫组化分析结果显示肿瘤的血管间皮细胞、间质纤维结缔组织等非肿瘤实质细胞亦有CD133的表达，目前有关该现象的机制尚未充分阐明^[24-25]。既往有文献报道，作为人类祖细胞和干细胞膜表面的一种抗原，CD133常出现在肿瘤的血管内皮祖细胞和间质干细胞上，而在分化成熟的血管内皮细胞上，不会有CD133的存在^[26-27]。在肿瘤的发生、生长、转移上面，血管内皮祖细胞有着重要作用，而间质干细胞能够调节肿瘤组织内环境，改变肿瘤细胞的生物学特性^[28-29]。作者推测，对于神经母细胞瘤的血管内皮祖细胞和间质干细胞，CD133也是它们的重要表面标志物，当然，该推论尚需深入研究来加以考证^[30] 。
综上所述，作为神经母细胞瘤细胞表面的一种重要标志物，CD133在评估神经母细胞瘤患儿预后方面起到重要作用，在研究神经母细胞瘤的发病机制、早期诊断、治疗方面，具有一定的意义。