藻酸钙敷料的促凝血机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.025

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (47): 7681-7686.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.025

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藻酸钙敷料的促凝血机制

崔飞艳¹，王斌¹，魏立²，王海涛¹，陈豪¹，初晓夏¹，王祯祯¹，杨丽华³

1青岛大学医学院特种医学教研室，山东省青岛市 266071；2解放军第401医院，山东省青岛市 266071；3青岛大学医学院免疫学教研室，山东省青岛市 266071

收稿日期:2015-08-29 出版日期:2015-11-19 发布日期:2015-11-19
通讯作者: 王斌，教授，青岛大学医学院特种医学教研室，山东省青岛市266071 魏立，教授，解放军第401医院，山东省青岛市 266071
作者简介:崔飞艳，女，1982年生，山东省青岛市人，汉族，2013级青岛大学在读硕士，主要从事高气压医学与神经系统损伤方面研究。

Hemostatic mechanism of calcium alginate dressing

Cui Fei-yan¹, Wang Bin¹, Wei Li², Wang Hai-tao¹, Chen Hao¹, Chu Xiao-xia¹, Wang Zhen-zhen¹, Yang Li-hua³

1Department of Special Medicine, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 2the 401st Hospital of Chinese PLA, Qingdao 266071, Shandong Province, China; 3Department of Immunology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China

Received:2015-08-29 Online:2015-11-19 Published:2015-11-19
Contact: Wang Bin, Professor, Department of Special Medicine, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China Wei Li, Professor, the 401st Hospital of Chinese PLA, Qingdao 266071, Shandong Province, China
About author:Cui Fei-yan, Studying for master’s degree, Department of Special Medicine, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, Shandong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：藻酸钙敷料近年来被广泛应用于手术止血、外伤止血、鼻腔术后止血、穿刺部位止血等，但有关其止血机制的国内外研究较少。
目的：初步探讨藻酸钙敷料的促凝血机制。
方法：将人抗凝血分别滴加至藻酸钙敷料、纳吸棉与医用棉纱布上，室温静置2 min，扫描电镜下观察材料与血液的相互作用；在人红细胞悬液中分别加入藻酸钙敷料、纳吸棉与医用棉纱布，静置15 s，扫描电镜下观察材料与红细胞的相互作用；在人红细胞中分别加入10，5，2.5 g/L的藻酸钙敷料浸提液，观察作用30，60，120 min的红细胞沉降率；在人富血小板血浆中分别加入10，5，2.5 g/L的藻酸钙敷料浸提液，37 ℃孵育10 min，流式细胞仪检测CD62P阳性血小板百分率。
结果与结论：藻酸钙敷料与抗凝血接触后可见致密的纤维蛋白网形成，其中网罗大量血细胞；纳吸棉组与医用棉纱布组仅见少量红细胞及血小板黏附。藻酸钙敷料与红细胞相互作用后可见红细胞变形，有伪足样改变，纳吸棉组与医用棉纱布组红细胞形态无变化。藻酸钙敷料浸提液呈剂量与时间依赖性提高红细胞沉降率，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)；藻酸钙敷料浸提液呈剂量依赖性提高CD62P阳性血小板百分率，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01)。表明藻酸钙敷料可通过释放钙离子、引起红细胞聚集和变形、活化血小板等促进止凝血过程。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 藻酸钙敷料, 浸提液, 枸橼酸钠, 钙离子, 红细胞, 血小板, CD62P

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, calcium alginate dressing has been widely used in surgical hemostasis, traumatic hemostasis, postoperative nasal hemostasis and puncture site hemostasis, etc.; however, there are few reports on their hemostatic mechanisms.
OBJECTIVE: To preliminarily study the hemostatic mechanism of calcium alginate dressing.
METHODS: Human anticoagulant blood was respectively dropped on sodium alginate dressing, nasopore dressing and medical cotton gauze. After 2 minutes, the interaction between materials and blood was observed at the room temperature using scanning electron microscopy. Calcium alginate dressing, nasopore dressing and medical cotton gauze were added in human red blood cell suspensions respectively. After 15 minutes, the interaction between materials and red blood cells was observed using scanning electron microscopy. The red blood cells were suspended by different concentrations (10, 5, 2.5 g/L) of alginate dressing extracts. The erythrocyte sedimentation rate was observed at different time points (30, 60, 120 minutes). Platelets rich plasma was incubated with different concentrations (10, 5, 2.5 g/L) of alginate dressing extract at 37 ℃, then CD62P positive platelet percentage was measured by flow cytometry after 10 minutes of incubation.
RESULTS AND CONCLUSION: Dense fibrin network was formed after calcium alginate dressing contacting with an anticoagulant. A large number of blood cells were recruited. There were only a small amount of red blood cells and platelets adhesion in the nasopore dressing and medical cotton gauze groups. After the calcium alginate dressing interacting with red blood cells, red blood cell deformability was visible, with a pseudopodia-like change. The red blood cell morphology was unchanged in the nasopore dressing and medical cotton gauze groups. The calcium alginate dressing extract dose-dependently and time-dependently increased the red blood cells aggregation, comparative differences between groups was statistically significant(P < 0.01). The calcium alginate dressing extract dose-dependently enhanced the CD62P positive platelet percentage, comparative differences between groups was statistically significant (P < 0.01). These results demonstrate that calcium alginate dressing promotes hemostasis and coagulation process by releasing of calcium ions, causing red blood cell aggregation and deformation and activating platelets.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biological Dressings, Blood Coagulation, Erythrocyte Aggregation, Platelet Activation, Tissue Engineering

崔飞艳，王斌，魏立，王海涛，陈豪，初晓夏，王祯祯，杨丽华. 藻酸钙敷料的促凝血机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7681-7686.

Cui Fei-yan, Wang Bin, Wei Li, Wang Hai-tao, Chen Hao, Chu Xiao-xia, Wang Zhen-zhen, Yang Li-hua. Hemostatic mechanism of calcium alginate dressing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7681-7686.

图/表（结果） 5

2.1 不同材料与血液相互作用后的扫描电镜观察藻酸钙敷料与枸橼酸钠抗凝血接触2 min后，扫描电镜下可见致密的纤维蛋白网形成，其内网罗大量的血细胞，说明藻酸钙敷料可以在短时间内使失去钙离子的血液发生凝固；纳吸棉组、棉纱布组仅见少许红细胞及血小板黏附，虽可见血小板发生形态改变，有伪足伸出，但未见明显的纤维蛋白网，见图1。

2.2 不同材料与红细胞相互作用后的扫描电镜观察扫描电镜下可见经过1 h的共孵育，藻酸钙敷料表面黏附的红细胞部分呈现树叶样或梭样改变，细胞膜有伪足样突出，但未发现红细胞发生溶血、破裂等现象，表明藻酸钙敷料可引起红细胞形态改变，这有可能在其促进凝血过程中发挥一定作用；纳吸棉组和棉纱布组红细胞形态正常，保持双凹圆盘状，见图2。

2.3 各组红细胞沉降结果与阴性对照组比较，不同质量浓度的藻酸钙敷料浸提液均引起红细胞沉降速率加快(P < 0.01)，且同一质量浓度不同时间点及不同质量浓度同一时间点的红细胞沉降速率也有明显差异(P < 0.01)，说明藻酸钙敷料浸提液可迅速引起红细胞沉降，且该作用存在剂量和时间依赖性，见表1，图3。

2.4 各组CD62P表达结果富血小板血浆与高、中、低(10，5，2.5 g/L)质量浓度的藻酸钙敷料浸提液共同孵育后，CD62P阳性血小板百分率分别是(15.08±2.04)%、(8.55±2.49)%、(2.15±0.51)%，空白对照组为(1.93±0.55)%，其中高、中质量浓度组与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，高、中质量浓度组与低质量浓度组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，高、中质量浓度组间比较差异有显著性意义(P < 0.01)，低质量浓度组与空白对照组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。本实验结果显示，藻酸钙敷料浸提液能激活血小板，且对血小板活化的影响存在剂量依赖性，见图4。

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引言

出血是导致创伤后早期死亡的重要原因^[1-2]。出血的早期控制可以提高重创患者手术成功率，降低休克的发病率和患者死亡率^[3]，被视为院前救治伤亡的有效策略和军事紧急医疗救治的关键环节。

目前，外科常用的局部止血方法主要包括指压法、加压包扎法、填塞法、止血带法等^[4]，敷料的包扎止血在其中占有举足轻重的地位。优良的止血敷料不仅可通过压迫作用实现止血，还可通过其本身物理、化学特性等多渠道发挥作用，快速封闭创面、减少出血，从而提高重创患者的生存率。随着科学技术的发展，人们对材料的研究越来越深入，各种天然的、合成的聚合物被广泛应用于医学领域，大量性能优良的新型敷料涌入临床。与此同时，临床的需要也给敷料的研发提出了更高的要求。理想的医用敷料不应仅限于止血和保护创面，还应具有促进伤口愈合和抗菌的功效^[5]。

藻酸钙敷料是一种海洋生物高分子共聚材料，其主要成分海藻酸广泛存在于褐藻中，是一种由β-D-mannuronic(M)和α-L-gururonic(G)两种单体通过α(1-4)糖苷键无规则连接而成的天然多糖化合物^[6]。基于其良好的生物相容性、低毒、可降解吸收、价格低廉等优点^[7-8]，颇受外科医生的青睐。1944 年，Speakman 等研发出可用于制备敷料的多种藻酸盐纤维^[9]。20世纪80年代开始，国外陆续将藻酸钙应用于创面愈合及伤口出血、流脓等，成为烧伤创面植皮术后应用最广泛的敷料^[10-13]。在中国，藻酸钙敷料近年来也被广泛应用于手术、外伤出血、鼻腔术后出血、穿刺部位的止血等，但其止血机制国内外研究较少，本实验将对其止血机制进行探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对比。

1.2 时间及地点于2014年9月至2015年2月在特种医学实验室及青岛市市立医院检验科完成。

1.3 材料血液标本来源于健康志愿者24名，男女各12名，年龄(25±5)岁，2周内未服用过血小板激活或抑制剂。

止血材料和仪器：藻酸钙敷料、医用棉纱布(山东长运医药用品有限公司)；纳吸棉(康华医疗器材有限公司)；单克隆抗体CD62P PE、CD61 PerCP、Mouse IgG1 PE(美国BD公司)；JSM-840扫描电镜(日本JEOL公司)；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

1.4 实验方法

藻酸钙敷料浸提液的制备：分别将1，0.5，0.25 g藻酸钙敷料加到0.1 L生理盐水中，37 ℃水浴48 h，过滤后得到10，5，2.5 g/L的藻酸钙敷料浸提液。

敷料与枸橼酸钠抗凝血的相互作用：静息状态下抽取健康志愿者肘静脉血液5 mL，弃去针管前部2 mL防止针头被组织污染，其余血液与38 g/L的枸橼酸钠按1∶9体积比例混匀，制备枸橼酸钠抗凝血。实验分为藻酸钙敷料组、纳吸棉组及医用棉纱布组3组，取3种敷料各取5 mg，分别滴加枸橼酸钠抗凝血1 mL，室温下静置2 min，然后100xg离心10 min，用5 mL生理盐水离心洗涤敷料5次，2.5%戊二醛固定15 min，经PBS漂洗、锇酸固定、乙醇梯度脱水、二氧化碳临界点干燥等处理后，在扫描电镜下观察。

敷料与红细胞的相互作用：静息状态下抽取健康志愿者肘静脉血液10 mL，弃去针管前部约2 mL防止针头被组织污染，其余血液与38 g/L的枸橼酸钠按1∶9体积比例混匀，1 000×g离心10 min，弃掉上层血浆，下面沉淀的红细胞用5倍体积的生理盐水离心洗涤3次，然后用生理盐水悬浮红细胞，制备红细胞悬液，并调整红细胞比容为40%。实验分为藻酸钙敷料组、纳吸棉组及医用棉纱布组3组，取3支离心管，各加入1 mL红细胞悬液，然后分别加入3种敷料各5 mg，静置15 s，然后100×g离心10 s，弃掉上清，加入5 mL生理盐水离心洗涤敷料5次，洗掉未黏附的红细胞，将洗涤后的材料加入1 mL生理盐水，室温下孵育1 h，经PBS漂洗、锇酸固定、乙醇梯度脱水、二氧化碳临界点干燥等处理后，在扫描电镜下观察。

红细胞聚集：静息状态下抽取健康志愿者肘静脉血液 4 mL，弃去针管前部约2 mL防止针头被组织污染，其余血液与38 g/L的枸橼酸钠按1∶9体积比例混匀，1 000×g离心 10 min，弃去上层血浆，下面富红细胞层用5倍体积的生理盐水离心洗涤3次，弃去上清，得下面红细胞层。实验分为4组，每组于玻璃管中加入上述分离的红细胞各1 mL，然后分别加入10，5，2.5 g/L的藻酸钙敷料浸提液4 mL，阴性对照组加入等量的生理盐水，轻轻混匀，观察作用30，60，120 min的分层界面高度。

血小板CD62P表达：静息状态下抽取健康志愿者肘静脉血液5 mL，弃去针管前部约2 mL防止针头被组织污染，其余血液与38 g/L的枸橼酸钠按1∶9体积比例混匀，然后200×g离心10 min，分离上层富血小板血浆。实验分为4组，每组各取富血小板血浆45 μL，分别加入5 μL不同质量浓度(10，5，2.5 g/L)的藻酸钙敷料浸提液，阴性对照组加入等量生理盐水，轻轻混匀，37 ℃孵育10 min。在同型对照管加入上述处理后的血标本5 μL，CD61-PerCP、IgG1 PE各20 μL；测定管加入上述处理后的血标本5 μL，CD62P PE、CD61 PerCP各20 μL，轻轻混匀，37 ℃避光孵育 15 min，加入4 ℃预冷的10 g/L多聚甲醛1 mL，上机测试。调前向角、侧向角光散射和荧光信号均为对数放大。以CD61-PerCP和侧向角光散射双参数设血小板门；以同型对照管设定阴性群体，收集门内10 000个血小板，分析门内CD62P阳性血小板百分率。

1.5 主要观察指标各组敷料表面血液凝固情况、材料表面红细胞形态、红细胞沉降速率及CD62P阳性血小板百分率。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多个样本间的两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

材料的局部止血过程是血液与材料间复杂的相互作用过程，因此，材料的表面特征、理化性质等决定了其止血效果。本实验主要从化学特性和生物学特性探讨了藻酸钙敷料的促凝止血机制。实验首先观察了藻酸钙敷料对枸橼酸钠抗凝血的作用。钙离子在凝血机制中被称为凝血因子Ⅳ，是多种因子的辅因子，可以同其他凝血因子一起逐级将凝血酶原转化成凝血酶，参与到内外源性凝血途径中的多个环节。藻酸钙敷料是海藻酸钠溶解于水中后，通过无纺工艺，把海藻酸钠水溶液挤入含钙离子的凝固液中后得到海藻酸钙纤维，在凝固液中发生离子交换，把水溶性的海藻酸钠制成不溶于水的的超细纤维敷料^[14-15]。该敷料中，钙离子与海藻酸结合不牢固，容易被钠离子置换^[16]。枸橼酸钠抗凝机制为枸橼酸根离子与血液中的钙离子反应生成枸椽酸钙，使血中钙离子减少，从而中断凝血过程，达到抗凝目的。从扫描电镜结果可以看出，藻酸钙敷料可以使失去钙离子的枸橼酸钠抗凝血在短时间内形成致密的纤维蛋白网。而大家知道，纤维蛋白原转变为纤维蛋白，纤维蛋白交织成网，将血液的有形成分红细胞、白细胞、血小板包罗起来形成血凝块，是血液凝固的终末环节^[17]，也就是说，藻酸钙敷料可以使枸橼酸钠抗凝血发生凝血；而失去了钙离子，纳吸棉和医用棉纱布不能使血液凝固。由此可以得出结论，藻酸钙敷料所含的钙离子可与血液中的钠离子进行交换、释放入血，进而与其理化特性一起激活凝血瀑布，这是藻酸钙敷料引起凝血的主要机制。

近年来，红细胞与血栓形成的关系越来越得到重视^[18-19]。Valeri等^[20]的研究表明，贫血可诱导出血时间延长，通过输注红细胞能够纠正延长的出血时间。红细胞可通过释放二磷酸腺苷和血红蛋白等引起血管收缩，对血小板的活化产生潜在的影响^[21-22]，而这些作用均在红细胞形态改变后发生^[23-26]。从本实验可以看出，同纳吸棉及棉纱布比较，藻酸钙敷料与红细胞共孵育后，可以引起红细胞发生叶片样改变，这种形态改变可能会加速局部止血栓的形成^[27]，缩短止血时间。此外，红细胞是影响血液黏滞性及血液流变学的重要因素。红细胞沉降率是指红细胞在一定时间内沉降的速率，它从流变学角度可反映红细胞的聚集程度，其聚集性增加会增加血黏度，导致血液流变学改变^[28]。大量体外实验证实了红细胞聚集性增加会对血小板的边流产生影响，因为血小板在血流缓慢、滞流或湍流时趋向边流，有利于其附着聚集在损伤的血管内皮，形成血栓^[29-30]。红细胞沉降速率结果显示，藻酸钙敷料浸提液能使红细胞迅速沉降，即说明该浸提液可增加红细胞的聚集性，这将对局部止血栓的形成产生重要的影响。Zhao 等^[31]的研究也证实了海藻酸可以引起红细胞聚集，这可能与海藻酸的生物学特性-含有植物凝集素有关^[32]。由此可见，藻酸钙对红细胞的影响可能是其促凝止血的又一机制，至于其引起红细胞聚集与变形的具体机制，目前尚不清楚，有待进一步研究。

生理性止血过程包括血管收缩、血小板血栓形成及血液凝固，其中血管收缩和血小板血栓形成为一期止血，血液凝固为二期止血。可见，血小板在止凝血过程中发挥着重要作用。在正常生理情况下，血小板不会发生黏附、聚集，然而，血小板一旦被活化，即可黏附在损伤血管内皮下，具有形成血栓、堵塞创口、维护毛细血管壁完整性、释放与凝血有关的各种因子等功能。同时，激活后的血小板释放出ADP、TXA2等物质，可进一步促进血小板激活，引起正反馈^[33]。CD62P是血小板膜表面糖蛋白，在静息血小板表达很少，血小板激活后由α颗粒释放并迅速分布于血小板膜表面，是血小板活化的特异性分子标志物。本实验通过将富血小板血浆与藻酸钙敷料浸提液共孵育，证实了该敷料浸提液可通过活化血小板来加速止血过程。这可能与浸提液中的钙离子影响血小板的结构和功能有关^[34]。

此外，藻酸钙敷料还具有以下物理特点：①成胶性：敷料中的钙离子与血液中的钠离子发生交换后，形成凝胶体^[35]，表面不规则的胶体起到封闭创口、压迫止血的作用。②亲水性：亲水基团的存在使藻酸钙具有特殊的内部结构^[36]，从而拥有良好的亲水性。③吸水性和保水性：藻酸钙纤维中存在大量的微孔，具有强大的吸水性和保水性，可迅速吸收超过自身质量20倍的水分，并锁住水分使其不往周边扩散^[37]，从而使血小板、凝血酶、红细胞等在局部浓度升高，有助于凝血过程的进行。④表面特征：藻酸钙纤维致密、不规则的网状结构，增大了与血液的接触面积，利于凝血。

综上所述，藻酸钙敷料可通过释放钙离子、引起红细胞聚集和变形、活化血小板等促进凝血，另外，其特殊的物理特性在止血过程中也发挥着重要作用。因此，藻酸钙敷料是理想的止血材料，在外科止血领域有很高的应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

藻酸钙敷料的促凝血机制

Hemostatic mechanism of calcium alginate dressing

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