铁铬钼软磁合金表面镀铬后的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.021

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (47): 7660-7664.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.021

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铁铬钼软磁合金表面镀铬后的生物相容性

夏银花^1，2，聂二民²，姜瑞²，张春元²，曾尽娣²，谈济洲²

1江西省人民医院口腔科，江西省南昌市 330006；2中山大学附属第一医院口腔科，广东省广州市 510080

收稿日期:2015-08-28 出版日期:2015-11-19 发布日期:2015-11-19
通讯作者: 张春元，硕士，教授，中山大学附属第一医院口腔科，广东省广州市 510080
作者简介:夏银花，女，1987年生，江西省九江市人，汉族，2014年中山大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔临床医学方面研究。
基金资助:
广东省科技厅社会发展项目(2011B080701010、2012B061700066)

Biocompatibility of Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy with chromium plating

Xia Yin-hua^1,2, Nie Er-min², Jiang Rui², Zhang Chun-yuan², Zeng Jin-di², Tan Ji-zhou²

1Department of Stomatology, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 2Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2015-08-28 Online:2015-11-19 Published:2015-11-19
Contact: Zhang Chun-yuan, Master, Professor, Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Xia Yin-hua, Master, Physician, Department of Stomatology, Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Social Development Project of Guangdong Provincial Science and Technology Department, No. 2011B080701010, 2012B061700066

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，铁铬钼系列软磁合金具有理想的磁性能和机械加工性能，表面镀Cr⁶⁺处理可明显增强其在口腔环境中的耐腐蚀性，但其表面镀铬后的生物安全性仍需进一步检验。

目的：评价铁铬钼软磁合金表面镀铬后的生物相容性。

方法：取对数生长期L-929细胞悬液，以6×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板中，分别加入纯钛浸提液、铁铬钼软磁合金原样浸提液、铁铬钼电镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液与聚氯乙烯浸提液培养。培养5 d后，观察细胞形态和贴壁情况，采用CCK-8法检测细胞A值，并计算各组细胞相对增殖率，评价材料细胞毒性分级。

结果与结论：纯钛浸提液组细胞形态正常，贴壁生长良好，表现为无细胞毒性；铁铬钼软磁合金原样浸提液组细胞形态和生长状态均良好，偶见个别细胞溶解，培养液内出现散在红褐色颗粒，表现为无或极轻微的细胞毒性；铁铬钼镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液组细胞生长状态良好，表现为无或极轻微的细胞毒性；聚氯乙烯浸提液组超过70%细胞固缩或溶解呈空泡状，大量细胞碎片，超过50%细胞生长抑制，表现中度以上的细胞毒性。铁铬钼电镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液的细胞毒性为0至1级。表明镀铬的铁铬钼软磁合金具有良好的生物相容性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 铁铬钼软磁合金, 镀铬, 细胞毒性, 生物安全性

Abstract:

BACKGROUND: Studies have demonstrated that Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy has desired magnetic properties and machining properties. Surface Cr⁶⁺ plating treatment can significantly enhance the corrosion resistance in oral environment, but its biosecurity needs further testing.

OBJECTIVE: To evaluate the biocompatibility of Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy with chromium plating.

METHODS: Logarithmic growth phase L929 cell suspension was obtained and seeded in 96-well plates at a cell concentration of 6×10⁷/L. Pure titanium extract, Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy original extract, Cr⁶⁺-plated Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy and PVC extract were added respectively. After 5 days of culture, cell morphology and adherent circumstances were observed. The absorbance value was detected using cell counting kit-8 assay. The relative growth rate of cells in each group was calculated. The cytotoxicity grades of materials were evaluated.

RESULTS AND CONCLUSION: In the pure titanium extracts group, the cells with normal morphology showed good adherent growth and no cytotoxicity. In the Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy original extract group, the cell morphology and growth status were both good, with occasionally individual cell lysis. Scattered reddish brown particles were visible in the culture solution, showing no or very mild cytotoxicity. In Cr⁶⁺-plated Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy extract group, the cells grew well and showed no or very mild cytotoxicity. In PVC extract group, more than 70% of cells were vacuole-shaped and presented with pyknosis or dissolution, there was a large number of cell debris, and cell growth was inhibited in over 50% cells, showing moderate cytotoxicity or above. The cytotoxicity of Cr⁶⁺-plated Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy extract was grade 0-1. These results demonstrate that Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy with chromium plating has good biocompatibility.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Vitallium, Biocompatible Materials, Chromium, Tissue Engineering

夏银花，聂二民，姜瑞，张春元，曾尽娣，谈济洲. 铁铬钼软磁合金表面镀铬后的生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7660-7664.

Xia Yin-hua, Nie Er-min, Jiang Rui, Zhang Chun-yuan, Zeng Jin-di, Tan Ji-zhou. Biocompatibility of Fe-Cr-Mo soft magnetic alloy with chromium plating[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7660-7664.

图/表（结果） 5

2.1 L-929细胞实验接种浓度的确定根据实验测得的数据，以吸光度值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制不同接种浓度L-929细胞的生长曲线，见图1。确定标准：在无其他因素干扰条件下，对数期生长的L-929细胞应呈稳定的线性增长趋势，培养至实验观察终点时刚好长满培养板。

由图可知，对数生长期的L-929细胞各个接种浓度培养整体细胞增殖情况均呈上升趋势；当细胞接种浓度为 6×10⁷L^-¹时，细胞增殖数呈稳定的线性趋势，培养至第5天时基本长满培养板，细胞形态正常，生长状态良好，高于此细胞浓度提早达到饱和状态；而低于此细胞浓度时，线性关系不规则，重复实验结果不稳定，因此，确定6×10⁷ L^-¹为最佳实验接种细胞浓度。

2.2 镜下观察各组细胞形态培养至5 d时，纯钛浸提液组细胞形态正常，贴壁生长良好，细胞分裂相多见，未见明显细胞溶解、脱落，表现为无细胞毒性；铁铬钼软磁合金原样浸提液组细胞形态和生长状态均良好，细胞分裂相多见，偶见个别细胞溶解，培养液内出现散在红褐色颗粒，表现为无或极轻微的细胞毒性；铁铬钼镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液组细胞生长状态良好，未见明显细胞脱落，核分裂相多见，培养液内无明显游离染色颗粒，表现为无或极轻微的细胞毒；聚氯乙烯浸提液组超过70%细胞固缩或溶解呈空泡状，大量细胞碎片，超过50%细胞生长抑制，提示该材料有中度以上细胞毒性，见图2。

2.3 各组细胞相对增殖率与细胞毒性分级根据各组吸光度值(表1，2)计算实验各组的细胞相对增殖率，并按照细胞相对增殖率与细胞毒性级的对应关系对各组材料的细胞毒性进行分级(表3)。

由表1可知：除聚氯乙烯浸提液组外，其余3组吸光度值随着时间的延长均有明显上升趋势，且差异有显著性意义 (P < 0.05)；培养至5 d时，铁铬钼软磁合金原样浸提液组与铁铬钼镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液组、纯钛浸提液组吸光度值相当，差异无显著性意义(P > 0.05)。

由表3可知，纯钛浸提液组、铁铬钼合金原样浸提液组、铁铬钼合金电镀Cr⁶⁺浸提液组毒性级别均为0或1级，根据中华人民共和国国家标准对细胞毒性试验标准化要求，这3种材料均适用于人体；聚氯乙烯材料的细胞毒性级为3级，不属于安全范围，不适用于人体。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照实验。

1.2 时间及地点于2012年9月至2013年12月在中山大学口腔医学院实验室完成。

1.3 材料小鼠成纤维细胞L-929由中山大学动物实验中心提供。

镀铬铁铬钼软磁合金生物相容性实验的主要材料及仪器：
材料及仪器	来源
铁铬钼软磁合金	上海宝钢钢铁股份有限公司
镀铬仪	宁波山河镀铬有限公司
纯钛	日本森田公司
聚氯乙烯	沈阳化工集团永新有限公司
CCK-8试剂	广州威佳科技有限公司
倒置相差显微镜	德国卡尔·蔡司公司

1.4 实验方法

材料准备：将铸造的方片状铁铬钼合金表面经耐水砂纸及抛光膏磨光、碱性除油、去离子水清洗、超声波清洗后，酸洗、活化，放入镀液中进行电镀，设定电流密度为45 A/dm²，电镀60 min，得到电镀Cr⁶⁺的铁铬钼(Fe-Cr-Mo)合金。将纯钛、铁铬钼软磁合金、铁铬钼电镀Cr⁶⁺软磁合金及聚氯乙烯试件分别加工成2 cm×2 cm×0.2 cm的材料块，清洗消毒后备用。向RPMI-1640培养基中加入胎牛血清(体积比1∶9)及双抗(100 mg/L青霉素，100 mg/L链霉素)，制备成新鲜培养液。

材料浸提液制备：采用无菌操作技术，将消毒好的试件分别置于6孔板中，按培养液体积与试件表面积比为 0.3 mL/cm² 的比例加入新鲜配制的培养液，培养箱静置24 h，获得到材料浸提液。

实验细胞的培养及接种密度的确定：从-80 ℃冰箱中取出小鼠成纤维细胞L-929后解冻，1 000 r/min离心3 min，弃上层液，加入新鲜培养液调整细胞浓度，放入恒温培养箱中传代培养。选取对数生长期的L-929细胞，胰酶消化后制备成不同浓度的细胞悬液(2×10⁷，4×10⁷，6×10⁷，8×10⁷，10×10⁷，12×10⁷ L^-¹)，分别接种于96孔板中，每组重复4孔，每孔100 μL，共接种5块培养板。培养箱培养1，2，3，4，5 d后各取出1块培养板，在显微镜下观察细胞形态和贴壁情况。采用CCK-8法测定各孔吸光值，根据各孔A值绘制各细胞浓度的生长曲线。根据第5天细胞生长形态、贴壁情况及A值确定细胞接种密度。

材料浸提液与细胞共培养：①参考L-929细胞生长曲线，确定实验细胞浓度为6×10⁷ L^-¹。②取5块96孔培养板，每板选出4组孔，分别为纯钛浸提液组(阴性对照)、铁铬钼软磁合金原样浸提液组、铁铬钼电镀Cr⁶⁺软磁合金浸提液组与聚氯乙烯浸提液组(阳性对照)，每组重复8孔，选取每组的前4孔接种细胞悬液，后4孔加入新鲜培养液(空白对照)，每孔各100 μL，培养箱静置培养。③细胞贴壁生长24 h后，去除各孔原培养液，PBS洗涤2遍，每孔分加入对应的材料浸提液100 μL，继续放入培养箱内培养。

1.5 主要观察指标

细胞形态学观察：加入材料浸提液后，每隔24 h在倒置相差显微镜下观察各组细胞的形态变化及贴壁生长情况，并根据医疗器械生物学评价对细胞形态学的毒性分级标准评价各组试件的细胞毒性^[8]。

CCK-8法检测各组细胞增殖：每隔24 h取出1块培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光培养1.5 h，TECAN酶标仪测定各孔吸光值。计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率=(A(_)_{11-A(_)₁₀)/(A(_)_{01-A(_)₀₀)×100%，其中A(_)₁₁为实验组平均吸光值；A(_)₁₀为实验组空白培养平均吸光度值；A(_)₀₁为阴性对照组平均吸光度值；A(_)₀₀为阴性对照组空白培养平均吸光度值。}}

根据细胞相对增殖率值，参照6级细胞毒性评级标准，对各组细胞毒性程度进行评价：当细胞相对增殖率≥100%时，毒性0级；当细胞相对增殖率在75%-99%之间时，毒性1级；当细胞相对增殖率在50%-74%之间时，毒性2级；当细胞相对增殖率在25%-49%之间时，毒性3级；当细胞相对增殖率在1%-24%之间时，毒性4级；当细胞相对增殖率为0时，毒性5级。根据国家标准GB11749-89的细胞毒性评价标准规定：细胞毒性分级级别在0至1范围内时是安全的，无细胞毒性；级别大于1者说明该材料有细胞毒性，不适用于人体。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析，采用重复测量设计的单因素方差分析，进一步采用 LSD-t法进行两两比较。

讨论

用于口腔材料细胞毒性研究的细胞类别有许多，可以归为两大类：一类是来源于动物体内的细胞，如V79、L-929、NIH3T3等^[9-12]；另一类是取自人体的口腔组织细胞，如牙龈成纤维细胞、牙髓成纤维细胞、口腔上皮细胞等^[13-16]。许多学者认为原代细胞刚脱离机体，在一定程度上更能客观反映材料应用于人体后的真实状态，实验结果更接近于实际情况；但也存在许多潜在的问题，比如：病毒等外源因子污染、不同机体来源的细胞敏感性的差别等。目前已建立细胞系的小鼠成纤维细胞L-929，不仅具有无限分裂增殖功能，且具有简单易得、生长状态稳定、繁殖迅速、生物学性状清楚等特点。Franz等^[17]分别用原代培养的人牙龈成纤维细胞和L-929小鼠成纤维细胞进行细胞毒性实验，结果并未见显著差异。另有学者认为不同组织来源的细胞对材料细胞毒性的敏感性不同，磁性附着体的软磁合金部分在口腔中主要通过唾液与周围组织接触，在行使功能的过程中可能会释放一些可溶性的毒性成分，这些物质主要作用于口腔黏膜的上皮细胞、成纤维细胞等，并对这些细胞的生长、附着、代谢、增殖等功能产生影响，因此采用上皮来源的细胞L-929对该材料的细胞毒性进行检测，可以准确反映该材料的生物相容性^[18]。本实验的观测指标包括两个方面：细胞形态学观察和CCK-8测定。实验结果符合GB/T16886中规定的阳性对照组2-4级、阴性对照组0至1级的要求，证实本部分实验检测结果稳定、可靠。细胞形态学观察是主观评价的内容，是通过在倒置相差显微镜下观察实验细胞的生长状态、贴壁情况，从而评价实验材料的稳定性和细胞毒性。对本实验进行细胞形态学观察可知，阳性对照组表现为中度以上的细胞毒性，其余各组实验材料细胞毒性级别为无或轻微毒性，与人体组织接触时不会产生明显的毒副作用。对材料浸提液变化的观察是指软磁合金经细胞培养液浸泡后发生氧化腐蚀反应，溶出金属离子，在显微镜下观察这些金属离子的数量、颜色、形态等一般性状。铁铬钼合金原样浸提液内出现红褐色颗粒的现象，这与普通合金金属修复体应用于口腔时周围软组织染色的临床表现一致。其原因可能与铁铬钼合金在培养基中发生氧化腐蚀，析出Fe离子、Co离子、Ni离子、Gr离子、Mo离子等有关。其中，Fe离子在二氧化碳培养箱内氧化成Fe^3+[19]，因而在显微镜下可以观察到红褐色、大小均匀的颗粒漂浮于培养液中。而在电镀Cr⁶⁺后铁铬钼浸提液培养的细胞中均没有明显的颗粒出现，这种现象与其他学者的实验结果相同^[20]。出现此种结果的原因可以通过3方面来解释：电镀Cr⁶⁺后由于在材料表面形成了一个比较致密且稳定的钝化氧化层，减少了金属离子的析出；Cr元素的增加可以协同降低其他金属成分的溶出率；Cr能明显改善合金的抗氧化腐蚀性能，并增加其硬度和强度。

CCK-8检测法原理是该试剂盒内的WST-8，在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为高度水溶性的橙黄色甲臜产物，颜色的深浅与细胞的增殖呈正比，与细胞毒性成反比^[21]。本实验采用CCK-8检测法测定上皮来源L-929细胞的增殖和分化，对该材料的细胞毒性进行检测，其可以准确反映该材料的生物相容性。通过对各组材料细胞相对增殖率的计算和细胞毒性级别可知：培养2 d后开始，纯钛、铁铬钼软磁合金、镀铬后的铁铬钼软磁合金均陆续显示出轻微的细胞生长抑制作用(毒性分级为1)，但各组细胞毒性没有随着时间的延长而增加。纯钛、铁铬钼软磁合金、镀铬后的铁铬钼软磁合金浸提液均对L-929的生长产生了轻度的抑制现象，从培养至第2天后，均先后显示出轻微的细胞毒性作用。这可能与合金析出的铁离子、铬离子、钼离子等，对细胞内的生长代谢过程产生干扰而抑制细胞的增殖有关^[22]。纯钛金属目前已被证实是具有良好生物相容性的金属材料，并以种植体、固位钉、钛板等多种形式广泛应用于骨组织内。本实验证实镀铬后铁铬钼软磁合金的细胞毒性作用均为1级，根据国标规定，1级以下的细胞毒性属于轻微细胞毒性，是大多数医用材料可能存在的，不会对机体产生明显影响，在临床应用中是可以接受的，符合应用于人体生物材料的生物相容性要求，说明镀铬后的铁铬钼合金作为新型的软磁合金材料进入下一步的临床研究是可行的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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