过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2表达及与免疫应答的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：Toll样受体及其信号通路在自身免疫性疾病、超敏反应、炎症反应、细胞凋亡及移植排斥反应中发挥重要的作用，其在过敏性紫癜患儿免疫发病机制中的地位尚未完全阐明。

目的：探讨过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2的表达及其与免疫应答的相关性。

方法：64例过敏性紫癜患儿分为2组，即过敏性紫癜无肾损害组(36例)、过敏性紫癜肾损害组(28例)，选择同期入院的30例健康体检儿童设置为对照组，采用流式细胞术检测外周血单核细胞TLR2表达，荧光定量PCR技术检测外周血单核细胞TLR2 mRNA相对表达量， ELISA检测血浆干扰素γ、白细胞介素4水平， ELISA法测定Treg细胞分泌的转化生长因子β、白细胞介素10水平。

结果与结论：过敏性紫癜组干扰素γ、干扰素γ/白细胞介素4水平均显著低于对照组(P < 0.05)，白细胞介素4水平显著高于对照组(P < 0.05)；过敏性紫癜组TLR2 mRNA和蛋白表达显著高于对照组(P < 0.05)；过敏性紫癜肾损害组TLR2 mRNA和蛋白表达显著高于过敏性紫癜无肾损害组(P < 0.05)；过敏性紫癜组患者白细胞介素10和转化生长因子β表达显著高于对照组(P < 0.05)。结果表明过敏性紫癜患儿外周单核细胞TLR2 mRNA及蛋白表达增高，且患儿存在免疫表达失衡现象，TLR2参与过敏性紫癜免疫发病机制，转化生长因子β表达量能够评估Treg的免疫应答，可作为过敏性紫癜患儿诊断、治疗及预后参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 过敏性紫癜, 外周血单核细胞, 免疫应答, TLR2, 转化生长因子β

Abstract:

BACKGROUND: Toll-like receptor (TLR) and its signaling pathway play an important role in autoimmune diseases, hypersensitivity, inflammation, apoptosis and transplant rejection; however, its effects on immune pathogenesis of Henoeh-Schonlein purpura in children have not been fully elucidated.

OBJECTIVE: To investigate the TLR2 expression in peripheral blood mononuclear cells in children with Henoeh-Schonlein purpura and its correlation with immune response.

METHODS: Sixty-four children with Henoeh-Schonlein purpura were divided into two groups: non-renal damage group (n=36) and renal damage group (n=28). Meanwhile, another 30 healthy children subjected to health examination acted as control group. Flow cytometry and florescent quantitative PCR were employed to detect TLR2 protein and mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells, respectively. ELISA was used to detect plasma interferon-γ and interleukin-4 levels and transforming growth factor β and interleukin-10 levels secreted from Treg cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Levels of interferon-γ and interferon-γ/interleukin-4 in the children with Henoeh-Schonlein purpura were significantly lower than those in the control group (P < 0.05), while the level of interleukin-4 was higher than the control group (P < 0.05). The expression of TLR2 protein and mRNA was significantly higher in the Henoeh-Schonlein purpura children than the healthy children (P < 0.05) and significantly higher in the renal damage group than the non-renal damage group (P < 0.05). Compared with the control group, the levels of interleukin-10 and transforming growth factor β were significantly higher in the children with Henoeh- Schonlein purpura (P < 0.05). These findings indicate that Henoeh-Schonlein purpura children have increased levels of TLR2 protein and mRNA in the peripheral blood mononuclear cells, and exhibit immune imbalance. TLR2 is involved in the pathogenesis of Henoeh-Schonlein purpura, and transforming growth factor β can be used to evaluate Treg immune response and provide reference for diagnosis, treatment of prognosis of Henoeh-Schonlein purpura children.
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Key words: Purpura, Schoenlein-Henoch, Toll-Like Receptor 2, Transforming Growth Factor beta, Monocytes, Tissue Engineering

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图/表（结果） 6

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引言

过敏性紫癜(Henoeh-Schonlein purpura, HSP)是临床上常见的儿科疾病，这种疾病发病率较高，患儿发病后临床上主要以皮肤、胃肠道、关节以及肾脏系统病变为主，严重者将威胁其生命^[1-2]。目前，对于过敏性紫癜的发生机制并不完全知晓。医学界普遍认为：感染是过敏性紫癜发生的主要原因，主要是由于机体免疫功能紊乱引起，患儿体液免疫检测主要表现为B细胞活化功能异常，造成其免疫球蛋白数量急剧增加^[3]。患儿发病后，细胞免疫功能异常主要表现为：TH1/TH2应答发生失衡，即TH1功能降低，TH2功能上升，并且TH2类细胞因子中的白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6等因子则相应得到增加，而TH1类细胞因子中白细胞介素2等则相应的减少^[4-5]。

Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)是人体中相对比较重要的蛋白质，它是一种Ⅰ型跨膜蛋白，该蛋白质通过识别病原中的一些相关分子，能够有效激活细胞内信号的传导机制，从而能够使炎性细胞因子释放，并一起适应性免疫应答，它是连接人体固有免疫和适应性免疫的桥梁。TLR2主要表达在单核巨噬细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞等多种免疫细胞表面，且不同的TLR2能够识别不同的配体^[6-7]。相关研究结果显示：TLR2细胞信号能够在许多自身免疫性疾病中转导^[8]，如炎性反应、细胞凋亡以及移植排斥反应等；同时，TLR2信号还能够介导多种疾病，如狼疮性肾炎、糖尿病肾病等，但TLR2在过敏性紫癜疾病中的转导研究相对较少^[9-10]。

选取解放军第152医院儿科2014年10月至2015年4月收治的过敏性紫癜患儿64例进行研究，探讨过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2的表达与免疫应答的相关性。
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材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点于2014年10月至2015年4月在解放军第152医院完成。

1.3 对象在纳入的的过敏性紫癜患儿中按随机数字表法选择64例进行研究，将入选患儿分为2组，即过敏性紫癜无肾损害组(36例)、过敏性紫癜肾损害组(28例)。过敏性紫癜无肾损害组中男19例，女17例，年龄3.1-13.4岁，平均年龄为(7.02±2.9)岁；过敏性紫癜肾损害组中男16例，女12例，年龄为3.0-14.5岁，平均年龄为(5.6±2.7)岁；选择同期入院的30例健康体检儿童设置为对照组，男17例，女13例，年龄为4.0-12.2岁，平均年龄为(6.12±1.7)岁。过敏性紫癜无肾损害组和过敏性紫癜肾损害组患儿家属对研究方案、研究目的等有知情权，患儿性别、年龄等差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

诊断标准：所有病例均符合2006年EULAR/PReS过敏性紫癜诊断标准。

纳入标准：①入选患儿均符合过敏性紫癜临床诊断标准。②入选患儿近2周内未使用糖皮质激素及免疫抑制剂。③所有试验均经过医院伦理委员会批准同意，且入院患儿及家属对试验知情同意。

排除标准：①不符合临床诊断标准及纳入标准者。②严重心、肝、肾功能异常者。③伴有其他免疫系统疾病及血液系统疾病者。

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RPMI-1640培养液	北京索莱宝生物技术有限公司
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1.4 方法

1.4.1 标本采集患儿入院后在次日早晨空腹抽取2.0- 3.0 mL静脉血，并加入20 U/mL肝素抗凝管中，充分混合均匀；同时，取2 mL静脉血放入普通管中，在常温下做进一步操作处理^[11]。

1.4.2 外周血细胞分离及其培养采用密度梯度离心法进行外周血单个核细胞分离及其培养，相关操作必须遵循无菌操作规则，且实验所需要仪器均经过高压蒸汽灭菌。具体操作如下：在抗凝管中放入RPMI-1640培养液进行稀释，采用吸管取稀释血液，并在距离1 cm的淋巴细胞分离液上沿着管壁慢慢加入，根据2∶1的比例将稀释血液悬浮在淋巴细胞分离液上，并以2 000 r/min离心速度离心12 min。然后，沿着管壁慢慢吸出白膜层，加入RPMI-1640培养液再进行10 min离心，再加入2倍RPMI-1640培养液混合均匀，进行5 min离心，离心速度控制在2 000 r/min。最后加入1 mL RNAiso Reagent液^[12-13]。

1.4.3 反转录合成互补DNA 参照实时荧光定量PCR相关操作要求对RNA等进行反转录反应，反应体积依据所得到的RNA浓度进行30-50 μL反转录，并将得到的反转录合成互补DNA作为PCR反应模板，在-20 ℃下保存^[14]。

1.4.4 PCR产物电泳称取0.8 g琼脂糖，将40 mL 0.5× TBE液放入烧杯中进行均匀混合，放在微波炉中加热到沸腾，取出摇匀后再放入微波炉中到沸腾。反复进行3次操作后取GELRED染料并将其放入1.5 mL烧杯中，温度下降到70 ℃时将其导入平板中，放置30 min后取出凝胶，并将其放在电泳槽中^[15-16]。取3 mL电泳后PCR产物，放入2 μL缓冲液，混合均匀后加入2%琼脂糖凝胶，凝胶一侧孔中加入6 μL Marker，设置电泳相关参数，利用紫外线图像成像系统进行观察^[17]。

1.4.5 实时荧光定量PCR反应采用荧光染料法对起始模板进行定量和定性分析。在PCR体系中加入SYBRGreenⅠ荧光染料(当和双链DNA结合后才会发出荧光)，采集发光阶段荧光信号，保证荧光信号的增加和PCR产物能够完全同步，根据试剂说明书相关参数在PCR反应管中合成cDNA模板，制备PCR反应混合液，并将最终得到的引物放置在反应管中，根据TaKaRa两步法进行PCR扩增^[18-19]。

1.4.6 绘制PCR动力曲线及TLR2、GAPDH mRNA表达采用PCR扩增仪完成PCR反应后生成荧光强度曲线，根据软件计算出样本中TLR2、GAPDH基因的Ct值，并利用??Ct进行基因相对定量的检测。采用2^-^??Ct表示基因的相对表达量^[20]。

1.4.7 外周血CD14阳性单核细胞表面TLR2蛋白表达取2个流式细胞仪检测管，分别加入100 μL外周静脉血，加入5 μL CD14-FITC抗体，再加入5 μL TLR4-PE抗体，在对照管中放入5 μLPE标记的Mouse IgG2a, K Isotype，向各管中放入3 mL溶血素，并进行5 min离心，离心速度控制在2 000 r/min。去除上层清液，加入缓冲液再进行5 min离心，离心速度为2 000 r/min。加入500 mL PBS，吹打均匀，并将其放置在流式细胞仪中进行检测。相关参数由软件分析得出^[21-22]。

1.4.8 采用ELISA法测定Treg细胞分泌的转化生长因子β、白细胞介素10水平相关操作步骤必须严格遵循转化生长因子β、白细胞介素10试剂盒要求进行检测，并且在550型酶标测定仪上测定550 nm波长处的吸光度值。将检测得到的数据绘制曲线，从曲线中获得血浆中干扰素γ、白细胞介素4水平^[23-24]。

1.5 主要观察指标 ①血浆干扰素γ、白细胞介素4水平。②外周血单核细胞TLR2 mRNA及蛋白表达变化。③过敏性紫癜组与对照组白细胞介素10、转化生长因子β表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

过敏性紫癜是临床上常见的疾病，这种疾病又称为亨-舒综合征，它是一种全身小血管炎症为主要特征的疾病，患儿发病后临床上主要表现为关节肿痛、腹痛、血尿等，影响患儿正常生活和健康^[25]。根据相关数据结果显示：20%-100%患儿伴有肾损伤，且11%-35%紫癜性肾炎患儿容易发展为慢性肾衰竭^[26-27]，因此，患者发病后是否出现肾损伤将直接影响过敏性紫癜治疗预后。目前，过敏性紫癜的发病机制并不完全知晓，可能涉及到细胞免疫和体液免疫，同时还可能与细胞因子、炎症因子等多因素之间存在紧密的联系^[28-29]。孙丽萍等^[28]实验中发现类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和过敏性紫癜患儿外周血肿CD4⁺CD25⁺Treg显著高于对照组，由此看出Treg在多种自身免疫性疾病中发挥重要的作用。临床可以通过检测外周血白细胞介素10和转化生长因子β水平或Treg数量评价患者免疫抑制水平。

患儿发病后临床上主要以IgA增高为主，大量的IgA免疫复合物将会聚集在人体血管壁上，从而能够激活免疫机制引起血管炎^[30]。研究显示：过敏性紫癜患儿免疫复合物出现沉积的原因主要是由于IgA结构发生异常等引起^[31-32]，当异常的IgA在人体内无法被肝脏清除时将会引起IgA水平不断上升，从而将会以循环免疫复合物形式沉积在全身小血管壁以及组织器官上，造成患儿相应器官出现损伤^[33]。过敏性紫癜患儿发病后细胞免疫存在明显的失衡，具体表现为TH2细胞比例的增高，以及TH1细胞改变不明显；过敏性紫癜患儿急性期存在Th2、Th17细胞的优势活化以及T细胞的减少等均可能与过敏性紫癜的发生和发展有着紧密的联系。同时，过敏性紫癜发病机制中细胞因子等也发挥了重要的作用^[34-35]，患儿血清肿瘤坏死因子α水平得到显著提高，并且与患儿的病情有着紧密的联系。此外，其他细胞因子，如白细胞介素6、白细胞介素8以及血小板衍生生长因子等在过敏性紫癜患儿中也得到提高，这种炎性因子之间的相互作用、相互影响等共同参与了过敏性紫癜的发生和发展。本研究过敏性紫癜组干扰素γ、干扰素γ/白细胞介素4比值显著低于对照组(P < 0.05)；过敏性紫癜组白细胞介素4水平显著高于对照组(P < 0.05)。

感染是过敏性紫癜的重要诱发因素，大约80%过敏性紫癜患儿发生感染^[36]。TLR2是宿主用来启动机体免疫发生炎性反应的第一道防线，属于是连接人体固有免疫和适应性免疫的重要桥梁，感染引起的TLR2活化是否是过敏性紫癜患儿免疫异常的因素等尚需要进一步研究和分析^[37-38]。TLR2信号转导参与了多种自身免疫性疾病，如细胞凋亡、超敏反应等，对于过敏性紫癜患儿而言，其外周血单核细胞以及组织中的巨噬细胞将会引起THR2表达上调，并且多种细胞因子也将会出现相应的增加，采用抗TLR2抗体后细胞因子分泌明显下降。本研究过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2 mRNA与TLR2蛋白存在显著的正相关(P < 0.05)，由此看出：过敏性紫癜患儿外周血单核细胞表面的TLR2蛋白在接受外源性配体刺激后，TLR2能够通过多种机制参与并调节TH0分化，共同参与Th1/Th2反应，从而在机体内释放大量的炎性因子，引起患儿免疫应答发生失衡，从而引起过敏性紫癜发生。过敏性紫癜患儿TLR2蛋白表达与血浆干扰素γ/白细胞介素4之间表现为负相关^[39-40]。转化生长因子β是一种重要的免疫调节剂，主要由Treg分泌，在维持机体免疫平衡中发挥重要的作用。本研究过敏性紫癜组患者白细胞介素10和转化生长因子β显著高于对照组 (P < 0.05)。

综上所述，过敏性紫癜患儿外周血单核细胞TLR2及蛋白质表达增高，且患儿存在免疫表达失衡现象，TLR2参与过敏性紫癜免疫发病机制，能够为过敏性紫癜患儿诊断、治疗及预后提供参考依据。本研究受到研究时间以及样本容量等因素的限制，还存在一些缺陷和不足，还需要在今后的研究中予以不断完善。
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