羊水干细胞诱导肾移植免疫耐受及对氧化应激的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.023

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (45): 7342-7349.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.023

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羊水干细胞诱导肾移植免疫耐受及对氧化应激的影响

邓春阳¹，冯建勋²，张海英²，陈庭芳²，李静³

1浦东新区书院社区卫生服务中心，上海市 201304；2上海市第六人民医院东院肾脏风湿科，上海市 201306；3新疆医科大学附属第一医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2015-09-11 出版日期:2015-11-05 发布日期:2015-11-05
通讯作者: 冯建勋，博士，博士后，主任医师，上海市第六人民医院东院肾脏风湿科，上海市 201306
作者简介:邓春阳，女，1982年生，重庆市人，汉族，2005年石河子大学毕业，主治医师，主要从事慢性肾脏病方面的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2009211A23)

Effects of amniotic fluid stem cell transplantation on immune tolerance and oxidative stress in kidney transplantation

Deng Chun-yang¹, Feng Jian-xun², Zhang Hai-ying², Chen Ting-fang², Li Jing³

1Health Service Center of the Academy Community, Pudong New Area, Shanghai 201304, China; 2Department of Nephrology, Eastern Branch, Sixth People’ s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201306, China; 3First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2015-09-11 Online:2015-11-05 Published:2015-11-05
Contact: Feng Jian-xun, M.D., Chief physician, Department of Nephrology, Eastern Branch, Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201306, China
About author:Deng Chun-yang, Attending physician, Health Service Center of the Academy Community, Pudong New Area, Shanghai 201304, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2009211A23

摘要/Abstract

摘要：

背景：干细胞在器官移植中诱导免疫耐受、延长移植物的存活时间、减轻排斥反应的作用已成为国内外众多学者研究的热点。
目的：以供体羊水干细胞诱导异基因大鼠肾脏移植免疫耐受，探讨免疫耐受的形成机制。
方法：分离培养Wistar大鼠羊水干细胞。选择雄性近交系Wistar大鼠和SD大鼠分别作为肾移植的供、受体，共分4组：假手术组(健康纯系雄性SD大鼠)、同系肾移植组(健康纯系雄性SD大鼠作供受体)、对照组(异系移植组加生理盐水)和实验组(异系移植组加羊水干细胞输注)。建立肾移植模型后，实验组由阴茎静脉缓慢推注3×109 L-1羊水干细胞 1 mL，对照组则缓慢推注生理盐水1 mL。术后第5天检测血清中肌酐、尿素氮、白细胞介素2、干扰素γ水平及氧化应激指标，流式细胞术检测外周血CD4和CD8淋巴细胞百分比，观察移植肾的病理变化。
结果与结论：实验组大鼠血清中尿素氮、肌酐、白细胞介素2、干扰素γ及氧化应激指标和尿蛋白定量、外周血淋巴细胞亚群CD4+，CD8+百分比及CD4+/CD8+比值显著低于对照组，而肌酐清除率则显著高于对照组，肾脏病理损害程度明显轻于对照组。结果显示羊水干细胞可以诱导大鼠肾移植免疫耐受，同时还可以抑制氧化应激水平，改善肾功能，减轻肾损害。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 羊水干细胞, 肾移植, 大鼠, 免疫耐受, 氧化应激, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stem cells can induce immune tolerance, prolong graft survival time and reduce rejection in organ transplantation, which have become a hot research.
OBJECTIVE: To induce immune tolerance to allogenic kidney transplantation with amniotic fluid stem cells in recipient rats and to explore the mechanism underlying immune tolerance.
METHODS: Amniotic fluid stem cells were isolated from Wistar rats. Two inbred male rat strains, Wistar rats and Sprague-Dawley rats, were selected as donors and recipients of kidney transplantation. The rat models of renal orthotopic transplantation were divided into the following four groups: a sham-operated group (n=10, Sprague-Dawley rats); an isograft group (n=10, Sprague-Dawley to Sprague-Dawley rats); a control group (n=10, Wistar to Sprague-Dawley rats, treated with 1 mL saline); and an experimental group (n=10, Wistar to Sprague-Dawley rats, treated with 1 mL of 3×106/L amniotic fluid stem cells). Serum levels of creatinine, urea
nitrogen, interleukin-2, interferon-γ, parameters of oxidative stress were detected at 5 days after operation. Flow cytometry was employed to determine the percentage of CD4+ and CD8+ lymphocytes in the peripheral blood. Kidney transplants were observed pathologically.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the levels of creatinine, urea nitrogen, interleukin-2, interferon-γ, parameters of oxidative stress and proteinuria were lower in the experimental group (P < 0.05). Percentages of CD4+, CD8+ and CD4+/CD8+ ratio were also significantly lower in the experimental group than the control group. However, the rate of cretinemia clearance in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Furthermore, the degree of kidney injury in the experimental group was significantly lower than that in the control group. Our findings demonstrate that the amniotic fluid stem cell transplantation can induce immune tolerance, extenuate oxidative stress, attenuate pathological damage to the kidney transplant and preserve kidney function from acute rejection in rats undergoing kidney transplantation.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Amniotic Fluid, Kidney Transplantation, Immune Tolerance, Tissue Engineering

邓春阳，冯建勋，张海英，陈庭芳，李静. 羊水干细胞诱导肾移植免疫耐受及对氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7342-7349.

Deng Chun-yang, Feng Jian-xun, Zhang Hai-ying, Chen Ting-fang, Li Jing. Effects of amniotic fluid stem cell transplantation on immune tolerance and oxidative stress in kidney transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7342-7349.

图/表（结果） 8

2.1 大鼠羊水干细胞的形态大鼠羊水干细胞原代培养17 h后，可见散在的梭形细胞、类成纤维细胞的间充质干细胞集落和多角形细胞为主的类上皮细胞集落，集落间不接触(图1A)，4 d后可达80%以上汇合。传代细胞在6 h内完全贴壁，培养3 d可达90%融合，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状、辐射状排列，细胞为梭形，相互之间界限不清(图1B)。

2.2 大鼠羊水干细胞的表面抗原特性流式细胞仪检测结果显示大鼠羊水干细胞表达CD44、CD29、CD105，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达(图2)。2.3 实验动物数量分析 13只雌性Wsitar大鼠用于细胞培养。假手术组10只SD大鼠，进入结果分析10只SD大鼠；同系肾移植组，造模12对SD大鼠，造模过程中失败和死亡2对，进入结果分析10只SD大鼠；对照组(异系移植组加生理盐水)，造模13只SD大鼠和13只Wistar大鼠，造模过程中失败和死亡3对，进入结果分析10只SD大鼠。实验组(异系移植组加羊水干细胞输注)，造模12只SD大鼠和12只Wistar大鼠，造模过程中失败和死亡2对，进入结果分析10只SD大鼠。

2.4 移植肾肾功能变化与对照组相比，实验组大鼠肾功能损害显著减轻，血清肌酐(μmol/L)(347.75±27.53比225.53±25.11，P < 0.05)、血清尿素氮(mmol/L)(25.6±4.53比19.5±3.51，P < 0.05)和蛋白定量水平(mg/24 h) (301.75± 27.53比215.8±25.41，P < 0.05)均显著降低；肌酐清除率明显增加(mL/24 h)(0.51±0.2比1.02±0.28，P < 0.05)，见图3。

2.5 移植肾形态学比较同系移植组肾组织结构基本正常，肾间质内有少量局灶单核细胞浸润，肾小管及血管结构基本正常(图4B)。而对照组(异系移植组加生理盐水)肾组织肾间质水肿、炎性细胞浸润，炎性细胞以淋巴细胞和单核细胞为主，聚集在肾小球中、肾小管及毛细血管周围，浸润程度呈加重趋势。肾小管上皮细胞肿胀、核固缩、坏死。小动脉纤维素样坏死(图4D)。

实验组(异系移植组加羊水干细胞输注)可以观察到病理性损害较对照组显著减轻，肾间质淋巴细胞浸润、肾小管坏死程度明显减轻(图4C)。

实验组Banff总分与对照组相比较，差异有显著性意义(P < 0.01)，而与同系移植组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，但对照组Banff总分与同系移植组相比较，差异有显著性意意义(P < 0.01，图4E)。

2.6 各组血清白细胞介素2、干扰素γ水平变化对照组(异系移植组加生理盐水)大鼠血清中白细胞介素2、干扰素γ水平较同系移植组大鼠和实验组大鼠显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，而羊水干细胞输注则显著降低大鼠血清中白细胞介素2、干扰素γ水平，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，但与同系移植组大鼠相比差异无显著性意义(图5)。

2.7 各组外周血淋巴细胞亚群CD4⁺，CD8⁺，CD4⁺/ CD8⁺比值分析对照组(异系移植组加生理盐水)大鼠外周血淋巴细胞亚群CD4⁺，CD8⁺百分比及CD4⁺/ CD8⁺比值较同系移植组大鼠和实验组大鼠显著升高(P < 0.05)，而羊水干细胞输注则显著降低大鼠外周血淋巴细胞亚群CD4⁺，CD8⁺百分比及CD4⁺/ CD8⁺比值，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，但与同系移植组大鼠相比差异无显著性意义(图6)。

2.8 各组移植肾组织ED-1阳性细胞和MCP-1表达的变化假手术组大鼠肾组织中几乎未见ED-1阳性细胞(图7A)，仅在肾小管上皮细胞有微弱的MCP-1表达(图7E)。对照组大鼠肾小球及肾间质中均可见单核/巨噬细胞的浸润(图7D)，同时肾小球及肾小管细胞均有明显的MCP-1的表达(图7H)。

羊水干细胞输注则明显减轻移植肾组织单核/巨噬细胞的浸润(图7C)，减轻肾小球和肾小管细胞MCP-1表达(图7G)。对照组大鼠肾组织ED-1阳性细胞计数和MCP-1表达积分显著高于同系移植组和实验组(P < 0.05)，实验组和同系移植组之间差异无显著性意义(图7I和图7J)。

2.9 各组移植肾氧化应激指标改变与同系移植组比较，对照组血清和肾组织匀浆硒谷胱甘肽过氧化物酶显著降低，而血清晚期氧化蛋白终产物水平、尿丙二醛水平和肾组织匀浆丙二醛水平均显著升高。羊水干细胞输注则显著减轻肾移植大鼠氧化应激水平，与对照组相比差异有显著性意义。实验组和同系移植组大鼠各项氧化应激指标差异无显著性意义(表1)。

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引言

静脉输注干细胞在器官移植中诱导免疫耐受、延长移植物的存活时间、减轻排斥反应的作用已成为国内外众多学者研究的热点。体外实验表明，间充质干细胞的免疫原性很低，这可能与间充质干细胞低表达主要组织相容性复合物Ⅰ，但不表达主要组织相容性复合物Ⅱ和一些重要的免疫协同刺激分子如CD40、CD80、CD86等有关^[1]。将间充质干细胞加入由同种异体刺激引起的混合淋巴细胞反应体系中，T细胞的增殖反应会被显著抑制^[2]。间充质干细胞在体内不仅具有低免疫原性，而且能够抑制炎症和诱导免疫耐受^[3-4]。研究表明在植物血凝素或异体抗原存在的情况下，骨髓间充质干细胞均可抑制T细胞分泌干扰素γ，促进分泌白细胞介素10，且呈剂量依赖关系^[5]。赵霞等^[6]研究显示植物血凝素刺激作用下的T细胞与间充质干细胞共培养后，白细胞介素2分泌水平明显下降，Th1细胞的增生、激活明显受抑制。

肾移植过程中，缺血再灌注损伤是不可避免的过程，是影响移植肾存活最主要的抗原非依赖性非免疫因素之一，其病理学生理学改变涉及以下方面：近端肾小管上皮细胞和血管内皮细胞结构和功能的改变；细胞骨架改变；腺嘌呤核苷酸代谢障碍及细胞内钙的改变；细胞与细胞间或细胞与基质间联系的丢失；活性氧自由基的形成，激活的内皮细胞引起的炎性反应导致炎性因子的浸润及细胞凋亡的增加。氧化应激在肾脏缺血再灌注损伤中起着非常重要的作用^[7]，并且氧化应激与细胞免疫在机体内并不是两个毫不相关的方面，二者联系密切。有研究证实干细胞疗法可减轻肾脏缺血再灌注损伤，注射间充质干细胞可以抑制体内氧化应激水平^[8]。

2007年美国科学家发现羊水中存在一类具有胚胎干细胞增殖分化特性的细胞，并将其命名为羊水干细胞^[9]。羊水干细胞具有来源广泛、增殖能力强、分化稳定等优点。本研究观察羊水干细胞对肾移植受体大鼠肾功能、外周血淋巴细胞、血清细胞因子和氧化应激水平的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计单因素设计。

1.2 时间及地点实验于2012年10月至2014年8月在新疆医科大学附属第一医院中心实验室完成。

1.3 实验动物及材料选择雄性近交系Wistar大鼠和SD大鼠分别作为肾移植的供、受体，大鼠体质量为200-250 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。大鼠术前禁食8-10 h，自由饮水。实验分4组：假手术组(健康纯系雄性SD大鼠)、同系肾移植组(健康纯系雄性SD大鼠作供受体)、对照组(异系移植组加生理盐水)和实验组(异系移植组加羊水干细胞输注)。

羊水干细胞诱导大鼠肾移植免疫耐受及抑制氧化应激实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
H-DMEM培养基	Gibco公司
标准胎牛血清	Hyclone公司
胎牛血清、胰蛋白酶	Sigma公司
FITC或PE标记的抗大鼠抗体：CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR	武汉博士德生物工程有限公司
白细胞介素2、干扰素γ ELISA试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
Becton dickinson FACSort流式细胞仪	美国Beckman-Coulter公司
ED-1单克隆抗体、多克隆兔抗鼠MCP-1抗体，即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒，DAB显色试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
HF90二氧化碳培养箱	美国Biometra公司

1.4 实验方法

1.4.1 羊水干细胞培养一共20只雌性Wistar大鼠和40只雄性Wistar大鼠按1只雌性与2只雄性同笼，第2天观察雌性大鼠阴栓，最终成功受孕13只雌鼠，从发现阴栓开始记为怀孕第1天，怀孕第16天时用异戊巴比妥钠(20 mg/kg)过量腹腔麻醉致死，开腹全部切除子宫，在无菌条件下抽取全部羊水(平均0.5-0.8 mL)后加入到AMNIOMAX™-II Complete培养基，制成单细胞悬液，接种到2 mL培养皿中，置饱和湿度、体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱培养。每天观察至出现以梭形细胞为主、类成纤维样细胞的羊水干细胞集落，且达80%汇合后，用0.05%胰蛋白酶、1 mmol EDTA，37 ℃消化2 min后，改用α-MEM培养液(添加体积分数为20%胎牛血清、4 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，制成细胞浓度为2×10⁷ L^-¹的细胞悬液，接种到25 cm²培养瓶中，置饱和湿度、体积分数为5% CO₂、37 ℃培养箱培养，记为第1代(P1)。细胞生长达到80%融合时按1∶4的比例传代。

1.4.2 羊水干细胞的鉴定取90%融合的第3代大鼠羊水干细胞，PBS洗涤后制备单细胞悬液，分别加入FITC或PE标记的抗大鼠抗体：CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA-DR，设立阴性对照。用流式细胞仪检测，CellQuest软件分析结果。

1.4.3 大鼠肾移植模型的建立采用左肾原位移植。行左肾原位灌注后，切取供体左肾带肾动脉、肾静脉和输尿管。采用cuf套管法，将供肾的肾静脉与受体左肾静脉端端吻合。采用改进的套袖法将供肾的肾动脉与受肾的肾动脉端端吻合，输尿管则采用植入式于受体膀胱吻合。假手术组大鼠仅切开腹腔撕开左肾包膜即关腹。

1.4.4 羊水干细胞移植造模后即刻实验组由阴茎静脉缓慢推注3×10⁹ L^-¹羊水干细胞1 mL，对照组则缓慢推注生理盐水1 mL。

1.4.5 标本采集各组受体大鼠于术后第5天处死。①处死前1 d禁食，自由饮水放代谢笼收集24 h尿液检测24 h尿蛋白定量、尿肌酐、尿丙二醛水平。②0.3%戊巴比妥钠注射液(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血检测血肌酐、血尿素氮、白细胞介素2、干扰素γ、淋巴细胞亚群(CD4⁺，CD8⁺，CD4⁺/CD8⁺)、硒谷胱甘肽过氧化物酶活性、晚期氧化蛋白终产物含量、丙二醛含量。③然后以50 mL冰生理盐水经腹主动脉灌注左肾，尽可能减少肾组织残留的血液，摘除左肾，于肾蒂平面剖成两半，一半置入体积分数为10%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋，连续切片(2 μm厚)，行苏木精-伊红染色和免疫组化染色。另一半投入液氮中速冻，1 h后取出，放入-70 ℃冰箱中保存待测，检测时取一小块肾组织，加9倍质量的冷生理盐水，制成质量浓度为100 g/L的组织匀浆，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清检测硒谷胱甘肽过氧化物酶活性、丙二醛含量。若受体存活时间少于3 d，或有明显手术不成功的征象，如肾盂积水、腹腔内感染等，则弃用。

1.4.6 生化检查使用试剂盒测定血清肌酐和尿肌酐水平，根据文献方法计算肌酐清除率^[10]，用体质量校正。考马斯亮蓝法测定24 h尿蛋白定量^[11]，自动生化分析仪测定尿素氮水平。分光光度法测定血清中晚期氧化蛋白终产物含量^[12]。

硫代巴比妥酸反应法测定24 h尿和肾组织匀浆中硫代巴比妥酸反应物质含量^[5^，^13]。依据Flohe等^[14]方法测定血清及肾组织匀浆中硒谷胱甘肽过氧化物酶活性。

1.4.7 酶联免疫吸附实验检测白细胞介素2、干扰素γ水平测定方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清白细胞介素2、干扰素γ水平，操作步骤严格按说明书进行。

1.4.8 流式细胞术测定外周血淋巴细胞亚群腹主动脉抽血2 mL，肝素抗凝，用PBS 1︰2稀释。在10 mL离心管中加Ficoll分离液，其上叠加6 mL稀释血，1 500 r/min离心30 min，取单个核细胞层，用PBS(1︰4)洗1至2遍，用计数板在显微镜下计数达5×10⁶，冻存于-80 ℃备用。利用小鼠抗大鼠CD4⁺、CD8⁺单克隆抗体进行染色，Becton dickinson FACSort流式细胞仪检测，CELL Quest软件分析CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞百分比及CD4⁺/CD8⁺比值。

1.4.9 肾组织形态学观察肾组织切片用苏木精-伊红染色，光学显微镜观察，参照Banff分类标准以双盲方式进行确定^[15]，并计算Banff总分。

1.4.10 免疫组织化学染色按照试剂盒说明书进行操作，显微镜下观察计数30个肾小球或在肾小管间质随机选取20个视野(0.25 mm×0.25 mm大小)中的ED-1和MCP-1阳性细胞数，评价单核/巨噬细胞浸润程度。

1.5 主要观察指标 ①大鼠羊水干细胞生物学特征。②肾功能及肾组织病理学改变。③血清白细胞介素2、干扰素γ水平变化。④外周血淋巴细胞亚群CD4⁺，CD8⁺，CD4⁺/CD8⁺比值变化。⑤氧化应激指标改变。

1.6 统计学分析实验数据用x(_)±s表示。采用SPSS软件包11.0版进行统计分析。组间的对应资料采用t 检验(两组完全随机化资料的t 检验)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞无免疫原性，有独特的免疫调节作用，在器官移植中的潜在作用备受关注。急性排斥反应仍然是肾移植后的主要并发症，这是一个复杂的炎症反应过程，是T淋巴细胞介导为主的复杂免疫级联反应，并有诸多细胞、细胞亚群以及它们分泌的各种物质参与形成^[16]，移植排斥反应是受体免疫系统抵抗移植器官而导致的肾移植物急性失功能的主要危险因素^[17]。

有关研究表明，羊水中存在的羊水干细胞具有较间充质干细胞更高的分化潜能、较胚胎干细胞更容易获取等优点。研究发现，羊水干细胞培养简单，传代快。抽取羊水与培养液混合即可开始培养，平均4 d后可达80%以上汇合。传代细胞在6 h内完全贴壁，培养3 d可达90%融合，羊水干细胞表现所有间充质干细胞的特性，表达CD44、CD29、CD105、不表达CD45、CD34、HLA-DR。同时研究也表明，羊水干细胞静脉注射可以抑制大鼠肾移植急性排斥反应，表现为保护移植肾肾功能，减轻移植肾组织脏病理损害，抑制移植肾炎性细胞浸入，这可能与羊水干细胞抑制肾移植后急性排斥反应中CD4⁺、CD8⁺细胞增殖，以及抑制炎症因子白细胞介素4和干扰素γ分泌有关。与骨髓间充质干细胞抑制大鼠肾移植急性排斥反应的结果一致^[18]。

此外肾移植过程中，缺血再灌注损伤也是不可避免的过程，缺血再灌注损伤是一个复杂的、多因子参与的病理生理过程，其中氧化应激在肾脏缺血再灌注损伤中起着非常重要的作用^[19]。缺血再灌注损伤也是一种急性炎性反应，可导致不同特征的肾小管损伤，如肾小管细胞亚致死性损伤、凋亡和坏死等。梁东彦等^[20]研究发现在大鼠肾移植急性排斥反应中，黄嘌呤氧化脱氢酶活性上升，通过增加活性氧生成，直接或间接损伤血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及肾间质，造成移植肾损害。黄嘌呤氧化脱氢酶与肾移植急性排斥反应的发生发展密切相关。近年来，人们观察到诱导型一氧化氮合酶在器官移植后如肝、心、胰腺及肾等移植物的急性排斥反应中也存在高表达^[21]，提示诱导型一氧化氮合酶也与排斥反应密切相关。移植肾组织中诱导型一氧化氮合酶可能在某种条件下被激活而产生一氧化氮，对移植物产生一定的抑制作用或破坏作用，从而导致排斥反应的发生。一氧化氮参与移植物损伤的可能机制之一就是诱发氧化应激，一氧化氮与O₂快速结合，可生成超氧亚硝酸阴离子(ONOO^-)，后者具有很强的氧化性，可直接或分解成小分子物质损害细胞

反映机体氧化应激状态的指标主要有2个：一是过氧化指标，它们能够直接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，如活性氧、过氧化脂质、晚期氧化蛋白终产物、丙二醛等；另外一个是抗氧化的指标，它们间接反映机体清除氧自由基的能力，如超氧化物歧化酶、硒谷胱甘肽过氧化物酶等。本研究结果显示，与同系移植组相比，异系移植组大鼠尿和肾组织内丙二醛含量及血清晚期氧化蛋白终产物含量显著升高，而血和肾组织中硒谷胱甘肽过氧化物酶的活性则显著降低，这提示氧化应激可能是导致移植肾损伤的原因之一。静脉输注羊水干细胞则可显著诱导硒谷胱甘肽过氧化物酶的表达，使其含量增加，加强机体抗氧化能力，促进超氧阴离子自由基的清除，显著降低肾组织和血中丙二醛和晚期氧化蛋白终产含量，稳定细胞膜，保护细胞免受损伤。本研究认为可能的机制是：一方面羊水干细胞可分泌多种生长因子，这些因子可能具有抗氧化能力；另一方面可能是干细胞通过自身分化或促进造血干细胞分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞，直接生成新的血管来供应缺血部位，从根本上改善缺血缺氧状态，使细胞线粒体功能得以恢复，减轻氧化应激。另外间充质干细胞可能在减低免疫反应保护移植物的同时参与了由于缺血再灌注损伤的器官修复^[22]。

总之，研究发现从大鼠羊水内分离出的间充质干细胞能够下调免疫应答，减轻移植肾的炎症反应，保护移植后早期移植物的功能。同时研究也表明氧化应激与肾移植急性排斥反应的发生发展密切相关。羊水干细胞可能在减低免疫反应保护移植物的同时参与了由于缺血再灌注损伤的器官修复，而间充质干细胞治疗的安全性及长期效果需进一步的认真研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

羊水干细胞诱导肾移植免疫耐受及对氧化应激的影响

Effects of amniotic fluid stem cell transplantation on immune tolerance and oxidative stress in kidney transplantation

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