脑外源性神经因子基因修饰神经干细胞对脑卒中的神经保护机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：脑外源性神经因子-胶质源性神经营养因子对大脑神经元具有特异性的营养作用，是脑卒中治疗中重要的神经营养因子。
目的：探讨胶质源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用机制。
方法：构建大鼠胶质源性神经营养因子基因pAdEasy-l-pAdTrackCMV重组体，并对新生大鼠皮质神经干细胞进行分离、培养。利用胶质源性神经营养因子基因重组腺病毒对神经干细胞进行转染，再将细胞悬液注射至暂时性(2 h)大脑中动脉缺血模型大鼠右侧脑室中，同时设单纯神经干细胞组和对照组进行对比。
结果与结论：与神经干细胞移植组比较，联合移植组再灌注2，3周的神经功能缺损评分，再灌注7 d脑缺血损伤面积均显著减小(P < 0.05)；不同再灌注时间点缺血区域的神经干细胞数量神经干细胞移植组均显著少于联合移植组(P < 0.05)。再灌注7，14 d，两组Syn，PSD-95蛋白表达均高于对照组(P < 0.05)，联合移植组升高较为明显。结果表明，利用经胶质源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞治疗大鼠脑卒中可以发挥出较好的神经保护作用，效果略优于单纯神经干细胞治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 脑卒中, 胶质源性神经营养因子, 干细胞移植, 神经保护, 脑缺血, 基因治疗, 基因修饰, 突触蛋白, 神经营养因子

Abstract:

BACKGROUND: Glial-derived neurotrophic factor has a specific effect on brain neurons, and is an important neurotrophic factor in the treatment of cerebral apoplexy.
OBJECTIVE: To investigate the neuroprotective effect of glial-derived neurotrophic factor gene modified neural stem cells on rat cerebral apoplexy.
METHODS: The recombinant human plasmid pAdEasy-l-pAdTrackCMV was constructed, and the neural stem cells were isolated and cultured from the cortex of neonatal rats. The neural stem cells were transfected with the recombinant adenovirus of glial-derived neurotrophic factor, and the cell suspension was injected into the right brain ventricle of rats with transient cerebral ischemia (2 hours). Meanwhile, neural stem cell transplantation group and control group were set up.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the neural stem cell transplantation group, the modified neurological severity score of combined transplantation group was reduced significantly 2 and 3 weeks after reperfusion, and the area of cerebral ischemia injury was also significantly decreased at 7 days after reperfusion (P < 0.05). The number of neural stem cells in the neural stem cell transplantation group was significantly less than that in the combined transplantation group (P < 0.05). The expression of Syn, PSD-95 proteins in the two transplantation groups, especially in the combined transplantation group, was higher than that of the control group (P < 0.05). However, there was no significant difference between the two transplantation groups (P > 0.05). The results show that the neural stem cells modified by glial-derived neurotrophic factor can play a better role in the neuroprotection against cerebral apoplexy in rats, and the effect is better than that of simple neural stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Stroke

吴中华. 脑外源性神经因子基因修饰神经干细胞对脑卒中的神经保护机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7331-7336.

Wu Zhong-hua. Neuroprotective effect of neural stem cells modified by glial-derived neurotrophic factor on cerebral apoplexy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7331-7336.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析大鼠75只均进入结果分析，未出现脱落死亡。

2.2 大鼠神经干细胞鉴定结果使用添加Ori Cell^TMEGF和Ori Cell^TM 碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养SD大鼠神经干细胞，传代培养至第8代后，行特异性Nestin抗体免疫荧光染色，结果显示原代培养形成的细胞球中大部分细胞表达Nestin阳性。

2.3 胶质源性神经营养因子基因重组腺病毒转染大鼠神经干细胞形态利用胶质源性神经营养因子基因重组腺病毒对大鼠神经干细胞进行转染，转染2 d之后置于荧光显微镜下进行观察，可见细胞呈绿色荧光状态。将细胞置于在含体积分数10%小牛血清的培养基中进行5 d的培养后观察，可见细胞呈放射样突起，即提示细胞出现了分化(图1)。

2.4 各组移植后不同时间的神经功能缺损评分情况移植后3 d，3组 mNSS评分差异无显著性意义(P > 0.05)；再灌注后各时间点，神经干细胞移植组和联合移植组的mNSS评分比对照组显著降低(P < 0.05)；联合移植组的mNSS评分比神经干细胞移植组分值低但无显著性意义(P > 0.05)；再灌注2，3周，联合移植组的mNSS评分较神经干细胞移植组显著降低(P < 0.05)，见表1。

2.5 各组移植后神经干细胞分布情况对照组未进行神经干细胞移植，因此脑内未出现GFP阳性以及BrdU阳性神经干细胞。神经干细胞移植组和联合移植组移植之后神经干细胞主要分布于在缺血区域，且在移植干细胞分布情况方面，呈现出相似状态。在再灌注7 d，两组的神经干细胞均首先位于缺血侧的侧脑室内，部分细胞会发生迁移，向纹状体以及缺血皮质见移动；再灌注14 d后，两组在缺血皮质和纹状体区域，存在显著增多的阳性细胞。再灌第21，35，49 d，较再灌注第7，14 d，两组神经干细胞数量出现显著增加的情况。对不同再灌注时间点缺血区域的神经干细胞数量进行比较，神经干细胞移植组均显著少于联合移植组(P < 0.05)，见表2。

2.6 各组移植后突触蛋白表达情况免疫组织化学染色显示，与对照组相比，联合移植组和神经干细胞移植组Syn，PSD-95免疫阳性产物吸光度值均显著增加(P < 0.05)。再灌注14，21 d，联合移植组Syn蛋白吸光度值均显著高于神经干细胞移植组(P < 0.05)。在不同时间点，联合移植组PSD-95蛋白吸光度值表达均显著高于神经干细胞移植组(P < 0.05)。见表3。

参考文献

[1] 陈波,高小青,杨朝鲜,等.移植GDNF基因修饰的神经干细胞对大鼠脑卒中的神经保护作用[J].解剖学杂志,2009,32(3):286-290, 312.

[2] 陈贵军,高小青,杨朝鲜,等.GDNF基因修饰的神经干细胞抑制脑卒中后大鼠的Caspase-3表达[J].四川医学,2012,33(9): 1538-1541.

[3] 陈岚,李玫.神经干细胞移植在脑损伤治疗中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(27):5112-5114.

[4] Lin S, Wang Y, Zhang C, et al. Modification of the neurotrophin-3 gene promotes cholinergic neuronal differentiation and survival of neural stem cells derived from rat embryonic spinal cord in vitro and in vivo. J Int Med Res. 2012;40(4):1449-1458.

[5] 邓兴力,王应莉,杨智勇,等.SPIO、EGFP双标GDNF基因修饰中脑神经干细胞移植治疗帕金森病[J].中风与神经疾病杂志, 2010, 27(2):109-113.

[6] 谭雪锋,金国华,田美玲,等.白介素-1α及与白介素-11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经生长因子联合诱导人神经干细胞向多巴胺神经元的分化[J].解剖学报,2005,36(4):351-355.

[7] 先雄斌,高小青,杨朝鲜,等.胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达[J].中国组织工程研究与临床康复,2009, 13(49): 9677-9680.

[8] 樊志刚,师瑞红.低氧诱导因子1α基因修饰脐血间充质干细胞移植治疗脊髓缺血再灌注损伤[J].中国组织工程研究,2015,(10): 1592-1596.

[9] 吴成吉,晋学飞,王璇等.Noggin基因修饰神经干细胞移植对局灶性脑缺血的研究[J].中国实验诊断学,2015,(4):540-542.

[10] 李金艳,王亮.促红细胞生成素基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死[J].中国组织工程研究,2014,(23):3664- 3669.

[11] 刘如恩,Deng XL,郭京,等.超顺磁氧化铁、绿色荧光蛋白双标胶质细胞源性神经营养因子基因修饰中脑神经前体细胞的建立[J].中华实验外科杂志,2008,25(8):964-966.

[12] 高明勇,肖建德,李振宇,等.胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(24):4856-4860.

[13] Kim E, Lee S, Hong S, et al. Sticky "delivering-from" strategies using viral vectors for efficient human neural stem cell infection by bioinspired catecholamines. ACS Appl Mater Interfaces. 2014;6(11):8388-8394.

[14] Brito C, Simão D, Costa I, et al. Generation and genetic modification of 3D cultures of human dopaminergic neurons derived from neural progenitor cells. Methods. 2012;56(3): 452-460.

[15] 王旭辉,李世亭.胶质细胞源性神经营养因子与脑缺血损伤[J].卒中与神经疾病,2004,11(4):253-255.

[16] Casalino L, Magnani D, De Falco S, et al. An automated high throughput screening-compatible assay to identify regulators of stem cell neural differentiation. Mol Biotechnol. 2012;50(3): 171-180.

[17] 欧雅莉,杨天伦,方立,等.GDNF基因真核表达载体的构建及其在脐血CD34⁺干细胞的表达[J].中风与神经疾病杂志,2008,25(6): 651-654.

[18] 黄成,杨建东,冯新民,等.胶质细胞源性神经营养因子基因修饰后间充质干细胞的生长与分化[J].中国组织工程研究,2013,(45): 7932-7938.

[19] 郁时兵,肖建德,刘尚礼,等.胶质细胞源性神经营养因子和肿瘤坏死因子可溶性受体基因修饰的神经干细胞联合移植治疗脊髓损伤的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2007,9(12): 1148-1152.

[20] 刘争,张洁元,段朝霞,等.表皮神经嵴干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GDNF表达的影响及意义[J].中华器官移植杂志,2014,35(4): 243-246.

[21] 王勇,赵伟,冯健洲,等.神经生长因子修饰脂肪干细胞移植促进损伤脊髓的修复[J].中国组织工程研究,2015,(14):2224-2229.

[22] 刘凯,阴晓峰,相恒伟等.Artemin基因修饰的骨髓间充质干细胞对多巴胺能神经元的保护作用[J].中华神经医学杂志,2015, 14(2):125-130.

[23] 丁继固,丁文杰,李光,等.胶质源性神经营养因子体外诱导小鼠胚胎中脑神经干细胞分化的研究[J].中国康复医学杂志,2008, 23(4): 341-343,插2.

[24] 王淑艳,任萍,谢淑,等.含GDNF基因的慢病毒载体的构建和其在人胚胎神经干细胞中的表达[J].生物工程学报,2008,24(12): 2061-2067.

[25] 邓莉,梅志强,常能彬,等.GDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞对脑出血大鼠脑源性神经营养因子及其受体的影响[J].泸州医学院学报,2012,35(5):451-454.

[26] 熊敏,曾云,刘志刚,等.经脑源性神经营养因子基因修饰的脂肪间充质干细胞对大鼠急性脊髓损伤的影响[J].中华实验外科杂志, 2013,30(5):1032-1034.

[27] 刘晓刚,邓宇斌,蔡辉,等.控释GDNF联合MSCs源神经元样细胞移植对猴脊髓损伤后前角运动神经元及bcl-2/bax表达的影响[J].中风与神经疾病杂志,2008,25(4):428-430.

[28] 陈立,杜娟,陈丽,等.GDNF及dbcAMP对神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元作用的实验研究[J].中风与神经疾病杂志,2014, 31(7):580-584.

[29] 程赛宇,阮怀珍,杨忠,等.GDNF基因逆转录病毒表达载体的构建及转染神经干细胞的研究[J].生物医学工程学杂志,2008, 25(3): 642-646.

[30] 杜杰,高小青,陈波,等.GDNF基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究[J].重庆医科大学学报,2010, 35(3): 346-349.

[31] 晋光荣,李云涛,韩群颖,等.GDNF和NO对局灶性脑缺血大鼠皮质和尾壳核神经干细胞增殖和分化的影响[J].中风与神经疾病杂志,2007,24(1):8-11.

[32] 邓莉,涂江义,郭侃,等.胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的骨髓基质干细胞移植抑制大鼠脑出血后神经细胞的凋亡[J].解剖学报,2011,42(6):731-736.

[33] 钟慧霖,陈文明,李翠莹,等.移植BDNF和GDNF基因修饰的hMSCs对大鼠大脑中动脉阻塞的影响[J].中国病理生理杂志, 2014,30(1):102-109.

[34] 姜宇,曾水林,鲁佑瑜,等.GDNF促进帕金森病大鼠模型脑内移植的中脑源神经干细胞表达Pitx3、Nurr1和TH[J].神经解剖学杂志,2011,27(1):92-97.

[35] 罗特坚,丁继固,李光,等.白细胞介素-1β和胶质源性神经营养因子体外诱导鼠胚中脑神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化[J].解剖学杂志,2011,34(1):41-44.

[36] 贺月秋,陈惠金,钱龙华,等.经脑室神经干细胞移植治疗脑室周围白质软化新生大鼠电镜下脑病理评估[J].实用儿科临床杂志, 2008,23(20):1610-1612, 1629.

[37] 贺月秋,陈惠金,钱龙华,等.胶质细胞源性神经营养因子联合神经干细胞移植治疗脑室周围白质软化新生大鼠的疗效观察[J].临床儿科杂志,2009,27(10):963-970.

[38] 周玲,邓莉,涂江义,等.GDNF基因修饰的BMSCs在脑出血大鼠脑内存活与分化的实验研究[J].实用医学杂志,2012,28(1): 48-51.

[39] 庞源广,高小青,陈波,等.GDNF基因修饰的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后GFAP表达的影响[J].四川医学,2013,34(8): 1099-1101.

[40] Médoc M, Dhilly M, Matesic L, et al. In Vivo Evaluation of Radiofluorinated Caspase-3/7 Inhibitors as Radiotracers for Apoptosis Imaging and Comparison with [18F]ML-10 in a Stroke Model in the Rat. Mol Imaging Biol. 2015.

[41] Lv H, Wang L, Shen J, et al. Salvianolic acid B attenuates apoptosis and inflammation via SIRT1 activation in experimental stroke rats. Brain Res Bull. 2015;115:30-36.

[42] Kang YH, Park MG, Noh KH, et al. Low serum TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) levels are associated with acute ischemic stroke severity. Atherosclerosis. 2015;240(1): 228-233.

[43] Liu B, Zhang YH, Jiang Y, et al. Gadd45b is a novel mediator of neuronal apoptosis in ischemic stroke. Int J Biol Sci. 2015; 11(3):353-360.

[44] Wu X, Li L, Zhang L, et al. Inhibition of thioredoxin-1 with siRNA exacerbates apoptosis by activating the ASK1-JNK/p38 pathway in brain of a stroke model rats. Brain Res. 2015;1599:20-31.

[45] Hafeez A, Elmadhoun O, Peng C, et al. Reduced Apoptosis by Ethanol and Its Association with PKC-δ and Akt Signaling in Ischemic Stroke. Aging Dis. 2014;5(6):366-372.

[46] Raghavan A, Shah ZA. Withania somnifera Improves Ischemic Stroke Outcomes by Attenuating PARP1-AIF-Mediated Caspase-Independent Apoptosis. Mol Neurobiol. 2015;52(3):1093-1105.

[47] Mishiro K, Imai T, Sugitani S, et al. Diabetes mellitus aggravates hemorrhagic transformation after ischemic stroke via mitochondrial defects leading to endothelial apoptosis. PLoS One. 2014;9(8):e103818.

[48] Calió ML, Marinho DS, Ko GM, et al. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells decreases oxidative stress, apoptosis, and hippocampal damage in brain of a spontaneous stroke model. Free Radic Biol Med. 201;70: 141-154.

[49] Ansar S, Chatzikonstantinou E, Thiagarajah R, et al. Pro-inflammatory mediators and apoptosis correlate to rt-PA response in a novel mouse model of thromboembolic stroke. PLoS One. 2014;9(1):e85849.

引言

急性脑血管疾病的病变会累及到皮质或皮质下，引发脑细胞缺血缺氧以及颅内高压的出现^[1]，其中脑卒中是一种发病率较高的脑血管疾病。以往，临床对脑卒中患者进行治疗的过程中，大多采用常规药物治疗，但常无法获得而理想的效果，且存在诸多禁忌证和并发症^[2-3]。为此，临床积极寻找有效的脑卒中治疗新方案至关重要。1992年，国外学者通过研究，从成鼠纹状体和海马中分离出一种特殊的细胞群^[4]，通过观察学者们发现，该细胞群可以不断发生增殖，并具有良好的分化潜能。随着干细胞的理论和相关研究的不断发现，“神经干细胞”这一概念逐渐诞生。通过大量的研究，人们也逐渐发现，对各种类型不同原因导致的神经细胞损伤后，可以利用一定的方式进行修复，以达到治疗疾病的目的^[5]。但是，利用神经干细胞移植治疗脑卒中的过程中，容易出现神经干细胞存活率低等情况，不利于提高治疗效果^[6]。临床要注意积极的采取有效措施以提高移植细胞的存活率。脑外源性神经因子-胶质源性神经营养因子对大脑神经元具有特异性的营养作用，可以有效促进各组大脑发育重要神经元营养的吸取以及增殖和分化等，是脑卒中治疗中重要的神经营养因子^[7-8]。但目前，关于基因修饰技术应用于脑卒中神经干细胞治疗方面的报道相对较小。为此，实验即利用胶质源性神经营养因子对神经干细胞进行修饰，然后对脑卒中模型大鼠进行移植治疗，对不同移植治疗所产生的神经保护效果进行观察和比较，从而为临床脑卒中的干细胞移植治疗提供一定的参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点于2015年5至6月在江苏省南通市通州区人民医院实验室完成。

1.3 材料 SD成年大鼠75只，体质量80-100 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SC-XK(沪) 2014-021。新生大鼠5只，均为雄性，体质量约5.5 g，由广东医学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2015-0021，健康状况良好。

1.4 实验方法

大鼠胶质源性神经营养因子基因重组体构建与神经干细胞分离培养和鉴定：参考文献[1]的方法构建大鼠胶质源性神经营养因子基因pAdEasy-l-pAdTrackCMV重组体，并参照文献对新生大鼠皮质神经干细胞进行分离、培养^[9]。获得干细胞神经球，利用多聚甲醛进行固定后予以免疫细胞化学显色。使用添加Ori Cell^TM表皮细胞生长因子和Ori Cell^TM碱性成纤维细胞生长因子的培养基培养SD大鼠的神

干细胞移植实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
多聚甲醛	武汉博士德生物工程有限公司
Nestin单克隆抗体	南京赛泓瑞生物科技有限公司
兔抗小鼠IgG	上海弘顺生物科技有限公司
多聚赖氨酸	深圳雷杜生命科学股份有限公司
DMEM培养基	北京清大天一生物技术有限公司
胎牛血清	索莱宝生物科技有限公司
戊巴比妥钠	上海北诺生物科技有限公司
单克隆抗BrdU抗体	北京杰辉生物技术有限公司
多克隆兔抗GFP抗体	上海一研生物科技有限公司
单克隆抗Syn抗体	山西兆益生物有限公司
克隆抗PSD-95抗体	上海快灵生物科技有限公司
光学显微镜	淄博恒拓分析仪器有限公司
孵育箱	北京北方利辉试验仪器设备有限公司
脑立体定位仪	上海康路仪器设备有限公司
切片机	上海威奥生物科技有限公司

经干细胞，传代培养至第8代后，利用Nestin免疫荧光实验进行细胞鉴定。

胶质源性神经营养因子基因重组腺病毒转染神经干细胞：对神经干细胞球进行吹打，制备单细胞悬液，调整细胞密度后接种在24孔板上，添加胶质源性神经营养因子病毒液后进行孵育。对细胞悬液进行离心，对转染细胞进行收集。

动物模型建立与分组干预：建立暂时性(2 h)大脑中动脉缺血模型^[10]，并将75只大鼠随机分为3组，每组25只，分别设为对照组、联合移植组及神经干细胞移植组。调整神经干细胞悬液浓度，移植前用BrdU进行标记。缺血再灌注第3天，对大鼠进行戊巴比妥钠麻醉后固定在脑立体定位仪上，暴露前囟。利用颅钻进行颅骨表面钻孔，分别对3组大鼠进行胶质源性神经营养因子/神经干细胞和神经干细胞以及生理盐水进行干预。利用体积分数1%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，固定在脑立体定位仪上，前囟充分暴露。在颅骨表面利用颅钻钻孔，坐标点为右侧脑室(AP=-0.8-1.0 mm，L=-1.8-2.0 mm，V=-4.0- 5.0 mm)。联合移植组以及神经干细胞移植组分别用微量注射器注射20 μL细胞悬液(5×10⁵个细胞)到右侧脑室中，注射速度5 μL/min。对照组采用上述方法注射20 μL生理盐水。再灌注后7，14，21，35，49 d，分别处死各组5只大鼠。

苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色：处死大鼠后获得完整大脑标本，切成均等4部分，常规石蜡包埋和切片后进行苏木精-伊红染色，利用NIHImage图像分析软件(美谷分子仪器上海有限公司提供) 对各组脑损伤面积进行分析。利用免疫组织化学显色法对各种移植神经干细胞和突触蛋白表达情况进行检测和观察。获得动物前囟后脑组织切片，添加一抗，包括BrdU单克隆抗抗体(1∶100)、GFP多克隆兔抗抗体(1∶100)、Syn单克隆抗抗体(1∶100)、多克隆抗PSD-95抗体(1∶100)。过氧化物酶结合的兔抗小鼠IgG(1∶100) 为二抗，进行DAB显色。显色后置于光镜下进行观察。不加一抗作为阴性对照，其余步骤同上。

1.5 主要观察指标 ①各组移植后不同时间的神经功能缺损(mNSS)评分情况^[11]，评分从0-18分，其中0分为正常，1分为无损伤，2-6分为存在轻度损伤，7-12分为中度损伤；13-17分为重度损伤，18分为最大神经功能缺失。②移植后不同时间脑损伤面积变化情况。③移植后不同时间点缺血区域的神经干细胞数量。④移植后突触蛋白吸光度值。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 17.0软件进行数据处理，组间数据差异的比较采用单因素方差分析法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

神经系统疾病是一种常见的疾病类型，对人体的危害极大。神经系统疾病发生于中枢神经系统、周围神经系统、植物神经系统，并以感觉、运动、意识、植物神经功能障碍为主要表现的疾病，是医学界公认的最难治疾病类型之一，一直没有效果显著的治疗方法^[12]。现代医学发展至今，都无法让神经细胞再生。因此，临床对脑卒中等疾病进行治疗的过程中，始终缺乏有效的治疗方案，无法获得理想的神经保护效果。

随着干细胞理论和学说的不断发展，临床开始积极的利用神经干细胞对脑卒中患者进行治疗^[13-14]。神经干细胞是具有强大的分裂潜能以及自更新的能力，可以在一定的条件下发生分化，形成神经元以及星形胶质细胞等^[15]。以往大量的研究结果显示，通过神经干细胞移植，可以有效改善卒中的神经缺失，并对神经功能的恢复产生积极的促进作用^[16-18]。在鉴定神经干细胞的过程中，Nestin蛋白是一种常用的特异性标志抗原。Nestin蛋白即为巢蛋白，属于一种神经元中间丝蛋白，是在中枢神经系统干细胞中发现的。Nestin蛋白的表达开始于神经胚形成时，被认为是神经干细胞特有标志物之一，是神经干细胞的重要阳性标志物^[19-22]。另外，Tubulin，GFAP及Galc是SD大鼠神经干细胞的阴性标志物^[23]。因此，实验过程中对神经干细胞进行鉴定的时候，选择将 Nestin等作为特异性标志抗原。本次实验结果显示，经Nestin蛋白免疫细胞化学鉴定呈阳性，Tubulin，GFAP及Galc呈阴性，即表明，分离培养所得的细胞为实验所需的大鼠神经干细胞。

在出现不同原因导致的脑损伤之后，可以积极的利用神经干细胞进行移植治疗，以获得理想的修复效果。但是，受到脑损伤的影响^[24-26]。因此，临床治疗过程中，需要积极的寻找有效的措施，以促进神经干细胞在机体内的分化，更好的对受损的神经功能予以修复^[27-31]。胶质源性神经营养因子是一个选择性较强的靶源性营养因子，具有一定的生理功能，可以为运动神经元提供营养支持^[32-35]。贺月秋等^[36]利用颈部正中切开双侧颈总动脉结扎法制备腩室周围白质软化模型，并采用孕14 d SD大鼠大脑皮质制备神经干细胞，并经脑室植入神经干细胞，以探讨神经干细胞移植对治疗早产儿脑室周围白质软化的临床应用可行性。通过研究学者发现，经脑室神经干下拨移植对早产儿脑室周围白质软化具有很大的治疗潜力，胶质源性神经营养因子则可以发挥出有效的增强神经干细胞治疗效果的作用来。

本次实验结果也显示，经过灌注后不同时间点，神经干细胞移植组和联合移植组的mNSS评分比对照组显著降低，Syn，PSD-95免疫阳性产物吸光度值均呈现出显著增加，两组之间两个蛋白表表达无统计学差异。分析出现这一结果的原因，可能是因为在进行神经干细胞移植治疗之后，神经元功能得到显著的提高，或者是移植之后神经元环路得到很好的重建^[37-39]。脑部急性坏死的出现是优于局部血流出现急性阻断所导致的，而理论上，延迟性的细胞凋亡程序是可控制的。因此，通过对细胞凋亡的有效调节，可以达到较好的治疗效果^[40-49]。通过本次实验还发现，在灌注14-49 d，移植细胞主要位于缺血区。较之对照组，神经干细胞移植组和联合移植组的脑缺血损伤面积均显著减小。再灌注7 d，联合移植组脑缺血损伤面积较神经干细胞移植组显著减小；其余时间点，两组无差异。结果表明，经胶质源性神经营养因子/神经干细胞或者神经干细胞移植治疗之后，对迟发性细胞凋亡产生了十分积极的干预作用。而外源性的胶质源性神经营养因子以及宿主自身的神经营养因子可以共同发挥出一定的作用来，对神经元凋亡产生阻止作用，并缩小脑损伤面积。另外，通过本次实验研究还发现，神经干细胞移植组和联合移植组移植之后神经干细胞主要分布于在缺血区域，且在移植干细胞分布情况方面，呈现出相似状态。在再灌注7 d，两组的神经干细胞均首先位于缺血侧的侧脑室内，部分细胞会发生迁移，向纹状体以及缺血皮质见移动。再灌注14 d之后，在缺血皮质和纹状体区域，存在显著增多的阳性细胞。再灌第21，35，49 d，较再灌注第7，14天，神经干细胞数量出现显著增加的情况。对不同再灌注时间点缺血区域的神经干细胞数量进行比较，可得神经干细胞移植组均显著少于联合移植组。上述结果表明，在经胶质源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞对大鼠进行移植治疗之后，细胞达到了更高的存活率，并在宿主脑组织中发生了分化。相应的大鼠神经功能恢复以及缺血脑组织修复等，均可能是受到存活较多的神经干细胞的积极影响而出现的。结果提示，利用经胶质源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞治疗大鼠脑卒中可以达到更好的神经保护作用。

综上，利用经胶质源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞治疗大鼠脑卒中可以有效改善神经功能、促进移植细胞的存活、增强突触蛋白的表达，发挥出较好的神经保护作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程