骨髓间充质干细胞移植修复慢性阻塞性肺病气道损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞能够分化为肺实质细胞并参与肺部损伤的修复，为间充质干细胞在慢性阻塞性肺病中的应用提供了新的方法。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植对大鼠慢性阻塞性肺病气道损伤的修复作用。
方法：将24只雌性大鼠随机分为4组：①骨髓间充质干细胞移植组(12只)：采用熏烟+脂多糖法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型，于造模后第1天经尾静脉输注1 mL CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞。②骨髓间充质干细胞对照组(4只)：在第1天和第14天经气管注入生理盐水300 μL，经尾静脉输注1 mL CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞。③慢性阻塞性肺病模型组(4只)：采用熏烟+脂多糖法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型，于造模后第1天经尾静脉输注1 mL PBS。④健康对照组(4只)：在第1天和第14天经气管注入生理盐水300 μL，经尾静脉输注1 mL PBS。在各组大鼠注射骨髓间充质干细胞后的第1，7，15，30天，进行病理学和血清学检测。
结果与结论：①苏木精-伊红染色结果显示：骨髓间充质干细胞移植组大鼠肺气肿和气道病变较慢性阻塞性肺病模型组轻，但较骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组严重。②移植后第1天，骨髓间充质干细胞移植组外周血白细胞总数和中性粒细胞比例高于骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组(P < 0.05)，随着时间延长，骨髓间充质干细胞移植组白细胞总数和中性粒细胞比例不断降低。③移植后第1天，骨髓间充质干细胞移植组外周血白细胞介素10水平低于骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组(P < 0.05)，肿瘤坏死因子α和粒细胞集落刺激因子水平高于骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组(P < 0.05)。随着移植时间的延长，骨髓间充质干细胞移植组外周血肿瘤坏死因子α水平不断降低，白细胞介素10水平不断升高，粒细胞集落刺激因子水平先升高再降低，其中第7天水平最高。④CM-Dil染色联合免疫组化检测提示，部分 CM-Dil阳性细胞同时CC16表达阳性。结果显示经尾静脉注射骨髓间充质干细胞能够改善慢性阻塞性肺病大鼠的肺部病理损伤，通过分化为气管黏膜上皮细胞以及参与免疫调节对气道进行修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 慢性阻塞性肺病, 骨髓间充质干细胞, 大鼠, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can differentiate into lung parenchymal cells involved in lung injury repair, providing a new approach for the application of mesenchymal stem cells in patients with chronic obstructive pulmonary disease.
OBJECTIVE: To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the repair of airway injury in rats with chronic obstructive pulmonary disease.
METHODS: Twenty-four female rats were randomized into four groups: bone marrow mesenchymal stem cell transplantation group (cell transplantation group, n=12); bone marrow mesenchymal stem cells group (cell control
group, n=4); model group (n=4); healthy control group (n=4). Rat models of chronic obstructive pulmonary disease were established in the cell transplantation group and model group using fumigation+lipopolysaccharide method; and at 1 day after modeling, model rats were given 1 mL CM-Dil-labeled bone marrow mesenchymal stem cells and 1 mL PBS via the tail vein in these two groups, respectively. In addition to tracheal injection of normal saline (300 μL) at 1 and 14 days, rats in the cell control and healthy control groups were given 1 mL CM-Dil-labeled bone marrow mesenchymal stem cells and 1 mL PBS via the tail vein, respectively. At 1, 7, 15 and 30 days after cell transplantation, lung tissue and serum markers of all rats were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining showed that emphysema and airway injury was milder in the cell transplantation group than the model group, but severer than the cell control and healthy control groups. (2) The total number of leukocytes and neutrophils in the peripheral blood was higher in the cell transplantation group than the cell control and healthy control groups (P < 0.05); with time, the total number of leukocytes and neutrophils was decreased gradually. (3) Compared with the cell control and healthy control groups, the interleukin-10 level in the peripheral blood was lower and the levels of tumor necrosis factor-α and granulocyte colony-stimulating factor were higher at 1 day after cell transplantation (P < 0.05). With time, in the cell transplantation group, the interleukin-10 level was increased gradually, the level of tumor necrosis factor-α was decreased gradually, and the level of granulocyte colony-stimulating factor was increased first and then decreased, which was highest at 7 days after cell transplantation. (4) Partial CM-Dil-positive cells were positive for CC16. Taken together, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation via the tail vein can improve lung injury of rats with chronic obstructive pulmonary disease, and it is involved in the repair of airway injury through differentiation into epithelial cells and immune regulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Pulmonary Disease, Chronic Obstructive, Tissue Engineering

张起，李丹. 骨髓间充质干细胞移植修复慢性阻塞性肺病气道损伤[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7325-7330.

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图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的形态接种后24 h可见部分星形或纺锤形细胞贴壁生长，1个星期后，细胞增殖明显增快，融合成片，核大浆少，呈纺锤形或梭形，折光性比较强(图1A)；2个星期时细胞已经基本铺满瓶底，可以开始传代培养。传代培养2-4 h开始贴壁生长，6-8 h贴壁已超过90%，细胞汇合后呈辐射状或漩涡状，胞核呈椭圆或圆形(图1B)，继续传代，第3代后细胞形态比较均一。

2.2 细胞生长曲线骨髓间充质干细胞接种后第1天处于静止期，接着增殖迅速进入对数增长期，接种后四五天开始进入平台期。

2.3 细胞的鉴定流式细胞仪检测结果显示：CD44、CD29及Sca-1在细胞中高表达，而CD117、CD34及CD45在细胞中不表达，表明所培养的细胞是骨髓间充质干细胞。

2.4 实验动物数量分析实验大鼠均造模顺利，造模及实验过程中均未出现大鼠死亡。

2.5 各组大鼠右肺的病理学变化骨髓间充质干细胞移植组和慢性阻塞性肺病模型组大鼠间肺泡腔扩大，形成肺大泡，出现明显炎症细胞浸润，气道和血管壁增厚，黏膜脱落，上皮紊乱，其中慢性阻塞性肺病模型组改变最严重；骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组肺泡腔均匀，无炎症细胞浸润，气道黏膜正常，无腺体增生。骨髓间充质干细胞移植组的肺部病变随时间推移逐渐好转。

2.6 各组大鼠外周血常规检测由表1和表2可以看出：骨髓间充质干细胞移植后第1天，骨髓间充质干细胞移植组和慢性阻塞性肺病模型组外周血白细胞总数和中性粒细胞比例均高于骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；随着时间的延长，骨髓间充质干细胞移植组白细胞总数和中性粒细胞比例不断降低。

2.7 外周血相关炎症因子水平由表3可以看出：骨髓间充质干细胞移植后第1天，骨髓间充质干细胞移植组和慢性阻塞性肺病模型组外周血肿瘤坏死因子α和粒细胞集落刺激因子水平高于健康对照组，白细胞介素10水平低于健康对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞对照组和健康对照组相似。由表4可以看出：随着移植时间的延长，骨髓间充质干细胞移植组外周血肿瘤坏死因子α水平不断降低，白细胞介素10水平不断升高，粒细胞集落刺激因子水平先升高再降低，其中第7天水平最高。

2.8 骨髓间充质干细胞在大鼠气道的分化骨髓间充质干细胞移植组大鼠肺切片组织支气管壁上可见少量CM-Dil标记的红色荧光细胞同时被绿染(CC16-FIFC标记)，表明骨髓间充质干细胞可以分化为支气管上皮细胞。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年7月至2014年12月在郑州大学附属郑州中心医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选体质量180-200 g、6周龄、雄性SD大鼠4只制备骨髓间充质干细胞；体质量200-220 g、8周龄、雌性SD大鼠25只制备动物模型，所有大鼠由河南动物实验中心提供。

1.3.2 主要试剂胎牛血清(Gibco公司)；DMEM-LG培养基(Hyclone公司)；脂多糖、L-谷胺酰胺、青霉素/链霉素、维生素C、牛胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、胰酶、1-甲基- 3-异丁基-黄嘌呤、MTT、二甲基亚砜(Sigma公司)；荧光标记抗大鼠单抗 CD29-PE、CD44-PE、CD117-PE、Sca-1-PE、Flk-1-PE、CD45-PE/Cy5、MHC-II-PE (Biolegend公司)；荧光标记抗大鼠单抗CD34-PE(Serotec公司)；S-P法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。

1.3.3 主要仪器 Milli-Q labconco纯水仪(美国Millipore 公司)；20 ℃及4 ℃冰箱(中国Haier公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；超低温冰箱(美国Forma Scientific.Inc)；FA1004N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；普通光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)；E70 TF-3微波炉(广东微波制品有限公司)；TH-880超净台(苏州群众医电设备厂)；电热干燥箱(上海医疗器械总厂)；FACSCalibur流式细胞仪(美国 Beckton Dickson公司)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；Mettler Toledo 320-pH计(上海Mettler Toledo器械公司)；BIO-RAD Model550酶联免疫检测仪(日本 BIO-RAD公司)；37 ℃恒温CO₂孵箱(德国Heraeus公司)；电热恒温水浴槽(上海医疗器械七厂)；冻存管、培养瓶、培养板(美国Corning公司)；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；血球计数板(浙江玉环县求精医用仪器厂)；微量加样器(德国GILSON公司)；手揿计数器(绍兴市医疗器械一厂)；Leica EG1140石蜡包埋机(德国Leica公司)；LEICA-RM2025组织切片机(德国Leica公司)；磁力搅拌器(常州国华)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养将4只SD大鼠脱颈处死，剪开皮肤，取下双胫骨和股骨，剪去骨两端，将吸有DMEM-LG培养基的针头插入骨的一端，冲出骨髓，经滤网过滤后移至离心管离心，弃去上清液，重悬并计数细胞，以12×10⁶/cm²的密度接种到培养瓶中培养，根据细胞贴壁情况在24-48 h后进行完全换液，以后每两三天进行1次换液。一般在7-10 d能够出现明显克隆，待细胞生长达80%融合时进行消化贴壁细胞，重新接种到培养瓶中培养，待培养瓶中细胞生长到80%-90%时进行洗涤、消化，置入3个相同培养瓶中进行传代培养，每48-72 h传代1次。

1.4.2 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定每天在倒置显微镜下观察并拍照记录细胞的形态，并描绘细胞生长曲线，采用流式细胞仪法对细胞进行鉴定。

1.4.3 慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立在第1天和第14天经气管注入脂多糖300 μL(1 g/L)，除第14天外的第2-30天将大鼠放入注有香烟烟雾的熏烟染毒箱内熏烟，每天熏烟2次，每次40 min，熏烟6 d休息1 d，共熏烟1个月。造模结束取1只解剖进行苏木精-伊红染色。

1.4.4 骨髓间充质干细胞的CM-Dil染色在移植前对骨髓间充质干细胞进行CM-Dil染色，染色后在荧光显微镜下观察计算荧光标记率。

1.4.5 动物分组将剩余24只雌性大鼠随机分为4组：①骨髓间充质干细胞移植组(12只)：于慢性阻塞性肺病造模后第1天经尾静脉输注1 mL CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞(1×10⁹ L^-¹)。②骨髓间充质干细胞对照组(4只)：在第1天和第14天经气管注入生理盐水300 μL，与骨髓间充质干细胞移植组同一天经尾静脉输注1 mL CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞(1×10⁹ L^-¹)。③慢性阻塞性肺病模型组(4只)：造模结束后第1天经尾静脉输注1 mL PBS。④健康对照组(4只)：在第1天和第14天经气管注入生理盐水300 μL，与骨髓间充质干细胞移植组同一天经尾静脉输注1 mL PBS。

1.4.6 大鼠血清和病理标本的收集经尾静脉输注入骨髓间充质干细胞或PBS后的第1，7，15，30天分别处死骨髓间充质干细胞移植组大鼠3只，其他3组每个时间点1只。大鼠麻醉固定后，剖腹取血1.0-2.0 mL，然后暴露气管和肺门，结扎切取右肺，浸入甲醛溶液中固定。将留取的外周血进行离心，取上清备用。

1.4.7 病理标本的苏木精-伊红染色将各组大鼠的右肺组织进行常规包埋、切片和苏木精-伊红染色，每只大鼠选2张染色切片，每张切片选5个视野进行观察。

1.4.8 血清的ELISA检测检测外周血血常规，ELISA法检测慢性阻塞性肺病炎症相关因子水平，具体步骤参照说明书。

1.4.9 骨髓间充质干细胞的转化情况在显微镜下选择CM-Dil阳性细胞多的切片进行免疫组化染色：将切片在丙酮中固定、过氧化氢孵育、洗涤、山羊血清封闭、加一抗(CC16多抗)孵育、冲洗、加二抗(羊抗兔FIFC)孵育、洗涤、缓冲甘油封固，在荧光显微镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的培养情况。②各组大鼠的右肺病理学变化。③各组大鼠外周血血常规及炎症相关因子的表达。

1.6 统计学分析所有数据输入SPSS 18.0软件进行处理，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验或方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

慢性阻塞性肺病的高发人群为中老年有吸烟史的人群^[3]，其发病率在欧洲和美国最显著，分别为11.3%和10.3%^[4]，中国2012年的发病率达12%^[5]，死亡率也逐渐上升^[6]，在美国，2000年的死亡率为4%，2012年的死亡率为9%^[7]。慢性阻塞性肺病的发病与遗传因素和环境因素有关，遗传因素中α1-抗胰蛋白酶缺乏是慢性阻塞性肺病的发病危险因素^[8]；环境因素中长期吸烟是最主要的危险因素^[9-10]，除了传统的烟草外，其他如有毒粉尘或颗粒的吸入、空气污染以及呼吸道感染等都是慢性阻塞性肺病的病因^[11-14]。慢性阻塞性肺病的发病机制比较复杂，主要有以下几方面机制：①蛋白酶-抗蛋白酶学说：该学说认为肺组织的损伤主要由蛋白酶和蛋白酶抑制剂平衡失调引起的，α1-抗蛋白酶基因发生突变，肝脏分泌该酶减少，影响中性粒细胞功能，导致炎症反应发生，基质金属蛋白酶含量在慢性阻塞性肺病患者中增加，加重蛋白酶负担以及炎症反应，引起肺组织损伤^[15]。②免疫因素：免疫因素的作用不十分清楚，有研究认为吸入有毒气体或吸烟导致的炎症反应与慢性阻塞性肺病的发生有关^[16]，如吸烟可以导致IgLC和IgE的大量产生，导致白细胞介素/趋化因子等增加，引起炎症反应加重^[17-18]。③氧化和抗氧化系统失衡：炎症反应使炎症细胞释放大量活性氧，使血管和组织受到损伤，促进肺气肿的形成^[19]。④全身的炎症反应：慢性阻塞性肺病肺组织的炎症反应会进入血液循环，刺激脂肪、肝脏以及骨髓等组织，使其发生炎症反应，导致患者糖尿病、心脏病等疾病的发生率增加^[20]。⑤细胞凋亡：在慢性阻塞性肺病患者中，内皮细胞和肺泡上皮细胞的凋亡增加，导致肺损伤^[21]。⑥无效修复：慢性阻塞性肺病主要发生在中老年人群，其肺泡的自我修复能力比较差，使受损肺泡无法得到比较好的修复。⑦内皮微粒：内皮微粒是内皮细胞在凋亡中产生的一种物质，能够降低肺的换气能力^[22]。慢性阻塞性肺病的诊断主要根据患者有无气道受阻^[23]。目前的治疗包括：①减少吸烟、吸入有毒气体或粉尘等的刺激。②药物治疗：对于急性期患者常采用药物治疗，常用的药物首选支气管舒张剂，其他如抗氧化剂和糖皮质激素等^[24]。③非药物治疗：包括康复训练^[25]、氧疗和手术治疗^[26]，康复训练和氧疗主要用于稳定期患者，手术治疗主要用于病情比较严重，有手术适应证的患者。

慢性阻塞性肺病目前的药物治疗以及氧疗和康复训练主要是稳定肺实质可逆性改变以及提高呼吸功能，其治疗效果比较有限，手术治疗主要是提高生活质量、缓解临床症状，目前的治疗不能阻止病情的发展。近年来干细胞的研究为慢性阻塞性肺病的治疗提供了新的思路。间充质干细胞移植治疗已应用于肺损伤、肺纤维化以及肺动脉高压^[27-28]。

间充质干细胞治疗慢性阻塞性肺病的机制有以下方面：①抑制炎症反应的发生：慢性阻塞性肺病是多种细胞及因子共同参与的慢性炎症反应性疾病，间充质干细胞能够降低炎症因子的水平，减少炎症反应的发生^[29-30]，机制可能为通过旁分泌机制发挥作用。②纠正蛋白酶-抗蛋白酶平衡失调：间充质干细胞可能通过激活炎症反应的正反馈通路、抑制蛋白酶释放从而纠正蛋白酶-抗蛋白酶的平衡失调状态。③细胞凋亡：间充质干细胞能够通过多种途径抑制细胞凋亡^[31]。④抑制氧化应激：氧化应激在慢性阻塞性肺病的发生发展中有非常重要的作用^[32-34]，间充质干细胞能够降低氧化应激水平^[35-37]，并对细胞具有保护作用，能够通过Wnt信号通路的激活^[38]，从而分化成肺泡上皮细胞^[39]。

骨髓间充质干细胞移植可以对肺部组织起到修复作用，主要通过骨髓间充质干细胞在肺部的聚集并分化为肺泡及气道上皮细胞参与损伤的修复^[40-41]，以及通过免疫抑制作用发挥局部损伤的修复作用^[42]。本研究结果显示：骨髓间充质干细胞移植后可以进入模型大鼠肺脏，部分细胞表现为气道黏膜上皮细胞形态，CM-Dil和免疫组化共同染色也发现了骨髓间充质干细胞在肺部的分化，由此可见骨髓间充质干细胞可以通过分化为气道黏膜上皮细胞参与肺损伤的修复和替代作用，苏木精-伊红染色结果表明骨髓间充质干细胞移植治疗组大鼠肺部组织的病理变化比没有处理组有改善；本研究结果亦表明：骨髓间充质干细胞移植治疗可以降低慢性阻塞性肺病模型大鼠的炎性因子肿瘤坏死因子α水平，升高抗炎因子白细胞介素10水平，通过抑制炎症反应有利于慢性阻塞性肺病炎症的好转，骨髓间充质干细胞移植组的骨髓粒细胞、间质细胞和祖细胞动员相关的粒细胞集落刺激因子水平先升高后降低。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺病大鼠模型对大鼠气管有修复作用，其修复作用通过骨髓间充质干细胞在肺部分化为气管上皮细胞以及参与免疫调节来完成的。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程