人脐带源间充质干细胞向急性肾损伤肾脏的归巢及保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：多项研究表明间充质干细胞具有治疗急性肾损伤潜能，脐带源间充质干细胞具有干细胞的共性而且优点很多，如容易分离培养、体外扩增快、免疫原性低、不存在伦理问题等，因此越来越受到国内外研究者的重视。
目的：观察人脐带源间充质干细胞对急性肾损伤大鼠肾组织的修复作用。
方法：将30只大鼠随机分为3组，正常对照组、模型对照组、人脐带源间充质干细胞移植组。正常对照组大鼠仅做暴露肾脏处理，模型对照组、人脐带源间充质干细胞移植组大鼠夹闭双侧肾蒂45 min，细胞移植组手术完成后尾静脉注射经DAPI标记的脐带源间充质干细胞1 mL，模型对照组注射等量的生理盐水。7 d后处死大鼠，全自动生化仪法检测血肌酐、尿素氮水平；取左肾于光镜下观察肾组织病理改变；取右肾于免疫荧光显微镜下观察肾组织上DAPI阳性细胞数。
结果与结论：细胞移植组与模型对照组比较血清肌酐、尿素氮水平明显降低(P < 0.05)，提示人脐带源间充质干细胞对肾功能有一定改善作用；细胞移植组与模型对照组比较病理情况明显好转，肾小管坏死评分指数明显降低；细胞移植7 d后肾组织冰冻切片上仍可见散在分布的蓝色荧光细胞。结果表明人脐带源间充质干细胞可向损伤的肾小管上皮迁移，对肾组织起到保护和促进修复作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 急性肾损伤, 脐带, 间质干细胞, 细胞移植, 归巢

Abstract:

BACKGROUND: An increasing number of studies have shown that mesenchymal stem cells have the potential to treat acute kidney injury. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells have general characteristics of stem cells and many advantages, such as easy to isolate and culture, in vitro fast amplification, low immunogenicity and no ethical problems, which have garnered increasing attentions.
OBJECTIVE: To study the repairing effects of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on acute kidney injury in rats.
METHODS: Thirty rats were randomized into three groups: a normal control group, a model group and a cell transplantation group. Rats in the model and cell transplantation were subjected to clamping the renal pedicles for 45 minutes, and then injected 1 mL of DAPI-labeled umbilical cord-derived mesenchymal stem cells or 1 mL of saline via the tail vein. In the normal control group, the kidney was only exposed with no treatment. At 7 days after treatment, the rats were killed to take left kidney tissues for pathological observation under light microscope and right kidney for observation of DAPI-positive cell counting. Automatic biochemical analyzer was used to detect serum creatinine and urea ammonia levels.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the levels of serum creatinine and urea ammonia were significantly lower in the cell transplantation group (P < 0.05), suggesting that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can improve the kidney function to a certain extent. Pathological findings
showed that the pathological damage was improved more remarkably in the cell transplantation group than the model group, and the tubular necrosis index decreased significantly in the cell transplantation group. At 7 days after cell transplantation, blue fluorescent cells were scattered on renal tissue frozen sections. These results indicate that human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can migrate to the injured tubular epithelial tissues, and promote the repair of the injured kidney.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Kidney Diseases, Tissue Engineering

张冰，李文庆. 人脐带源间充质干细胞向急性肾损伤肾脏的归巢及保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7304-7308.

Zhang Bing, Li Wen-qing. Homing of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells to the injured kidney and their protective effects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7304-7308.

图/表（结果） 6

2.1 人脐带间充质干细胞的形态组织块贴壁后1周可见散在分布、贴壁生长的细胞集落(图1A)，细胞多呈长梭形类似成纤维样细胞；14 d时细胞铺满瓶底，此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列(图1B)。

2.2 人脐带间充质干细胞的鉴定选取性质较稳定的第4代脐带间充质干细胞进行流式细胞术分析，脐带源间充质干细胞强表达CD29(97.86±3.17)%，而造血细胞的标记CD34仅为(0.99±0.56)%，内皮细胞标记CD31仅为(2.37±0.44)%，见图2。细胞强表达整合素黏附分子CD29，弱表达造血细胞标记C34和内皮细胞标记CD31，符合脐带间充质干细胞表面标志特点。

2.3 实验动物数量分析 30只大鼠实验过程中全部存活，中途无脱落，全部进入结果分析。

2.4 血清肾功能检测血清肌酐和尿素氮水平正常饮食饲养各组动物1周后取血，全自动生化分析仪检测血清肌酐和尿素氮水平(表1)。结果显示，模型对照组、细胞移植组血清肌酐、尿素氮水平明显升高，与正常对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；细胞移植组与模型对照组比较血清肌酐、尿素氮水平明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示人脐带间充质干细胞对肾功能有一定改善作用。

2.5 肾脏病理改变正常对照组肾组织形态正常。模型损伤组近端小管上皮细胞可见空泡变性，管腔扩张，刷状缘脱落明显，部分小管上皮细胞甚至肿胀破裂，胞核消失，管腔内可见脱落的上皮细胞，数处管腔内充满细胞碎屑，充满红色颗粒状坏死物，间质水肿，散在炎性细胞浸润。细胞移植组较模型损伤组病变轻，管腔坏死物较少，可见少量管型，间质炎细胞浸润较少(图3)。

2.6 肾小管坏死的评分指数请病理科同一位医师单盲读片对肾小管坏死进行评分(表2)，结果显示脐带间充质干细胞治疗后比模型损伤大鼠肾小管损伤程度明显好转，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 追踪DAPI标记的脐带间充质干细胞正常对照组、模型对照组冰冻切片未见蓝色荧光细胞，细胞移植组仅可见散在分布的一定数量的蓝色荧光细胞(图4)。

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引言

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是一组临床常见综合征，大型手术、创伤、严重感染等均可导致急性肾损伤，如果得不到及时有效地治疗，将会导致肾功能衰竭，最终危及生命^[1]。目前，急性肾损伤的治疗以控制原发病避免进一步加重损伤和给予肾替代治疗为主。透析和肾脏移植能在一定程度上提高患者的生存质量，但仅是一种不针对病因的替代治疗方法，目前尚无可彻底改善肾脏功能的治疗方法，寻找一种持之有效的治疗急性肾损伤的方法便成了当务之急^[2]。研究证明，体外培养的来自其他组织的干细胞可归巢至肾脏并增殖分化为肾脏细胞，如Kale等^[3]研究证实移植的骨髓间充质干细胞可归巢至肾脏，并定居在肾小管，移植后肾功能明显改善，可显著降低血清尿素氮水平等。Qian等^[4]移植人间充质干细胞治疗大鼠急性肾损伤模型，结果人间充质干细胞通过分化为肾小管上皮样细胞起到对肾功能恢复和保护作用；Togel等^[5]分别用自体和异体间充质干细胞治疗大鼠急性肾损伤模型，发现两种骨髓干细胞均起到了对肾功能保护的作用；很多文献均报道了骨髓干细胞对肾损伤模型的促修复作用^[6-10]。脐带源间充质干细胞具有干细胞的共性，即具有多向分化潜能和自我更新能力，可在不同环境中分化为不同种类的细胞，且人脐带源间充质干细胞具有低免疫原性，不表达MHCⅡ类分子和B7等共刺激分子，具有免疫赦免特性，不刺激同种异体免疫反应。本实验将体外培养的人脐带源间充质干细胞注入急性肾损伤大鼠模型体内，旨在观察其对损伤肾组织的修复作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞移植，体外观察。

1.2 时间及地点于2014年1至12月在河北大学医学院实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选取雄性SD大鼠30只，3月龄，体质量200 g左右，由河北大学医学院动物中心提供。

1.3.2 脐带标本来源于保定市第一医院妇产科足月妊娠分娩胎儿脐带。脐带标本获取经产妇及家属同意并签署了同意书。

1.3.3 主要试剂 DMEM培养液(Gibco公司)，体积分数为10%胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，PBS(自制)，DAPI染色液(碧云天生物公司)等。

1.3.4 主要仪器超净工作台(SANYO公司)，CO₂恒温细胞培养箱(YAMATO公司)，相差倒置光学显微镜、免疫荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带源间充质干细胞的分离培养在无菌条件下取足月妊娠分娩胎儿脐带，充分洗涤，剔除脐带动静脉，解剖脐带，刮取Wharton’s Jelly(间质组织)，剪碎成约 1 mm³大小的组织块，DMEM冲洗，以一定的细胞密度接种于含体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基中，CO₂恒温细胞培养箱培养，当细胞融合时，用胰蛋白酶消化传代。

1.4.2 脐带间充质干细胞的鉴定选取第4代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤2次(800 r/min)，收集细胞，流式细胞术检测CD34、CD29、CD31的表达情况。

1.4.3 脐带间充质干细胞的标记 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diainicli no-2-phenyli ndole，DAPI)是一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中双链DNA结合发挥标记作用，标记后的细胞荧光显微镜下可见蓝色荧光。选取生长良好第4代细胞，经胰酶消化，离心，收集细胞，用含DAPI染色液的培养基(工作浓度50 mg/L)重悬细胞，加入培养板中，培养箱内孵育过夜，收集细胞，PBS反复冲洗8次，去除多余DAPI染色液，调整细胞终浓度为1×10⁹ L^-¹备用。

1.4.4 实验动物及分组 30只大鼠随机分为3组：正常对照组(n=10)、模型对照组(n=10)、人脐带源间充质干细胞移植组(n=10)。

1.4.5 缺血再灌注肾损伤模型复制 4%水合氯醛2 mL腹腔注射麻醉大鼠，在腹正中位选择切口，找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹夹断肾蒂，肾缺血后的肾脏颜色逐渐变深变暗呈紫黑色，表示夹闭成功。肾蒂夹闭45 min后取下动脉夹，5 min内肾脏颜色又逐渐变红表示肾脏缺血再灌注成功，此时关闭腹腔，缺血再灌注肾损伤模型复制完成。正常对照组开腹后仅暴露肾脏45 min后即关闭腹腔，不结扎肾血管。

1.4.6 细胞移植关闭腹腔后，细胞移植组尾静脉注射DAPI标记的脐带源间充质干细胞1 mL，模型对照组注射相同体积的生理盐水。

1.4.7 血液标本的收集、保存及检测正常饮食饲养各组动物1周后，4%水合氯醛2 mL腹腔内麻醉，麻醉满意后开胸心脏采血，进行血清肌酐和尿素氮水平测定。

1.4.8 肾组织病理学观察取动物左肾，体积分数为10%甲醛固定，经脱水、透明、石蜡包埋后切片，苏木精-伊红染色镜检，观察肾组织病理变化。在光学显微镜下观察肾小管损伤情况，肾小管损伤定义为：肾小管明显扩张、细胞扁平、刷状缘脱落、管型形成、间质水肿。肾小管坏死程度进行评分(单盲法)^[11]：每张切片(200倍镜下)取外肾皮质10个不重叠视野，0=正常，1=轻微损伤(受损肾小管 < 5%)，2=轻度损伤(受损肾小管5%-25%)，3=中度损伤(受损肾小管25%-75%)，4=重度损伤(受损肾小管>75%)，作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数。

1.4.9 追踪DAPI标记的细胞取动物右肾，立即进行冰冻切片，荧光显微镜下观察。在紫外光激发下，DAPI阳性细胞核呈耀眼蓝色荧光，从而追踪脐带源间充质干细胞归巢情况。

1.5 主要观察指标血清肌酐和尿素氮水平、肾小管坏死评分指数、脐带源间充质干细胞的组织定位。

1.6 统计学分析数据采用x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行分析处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间均数两两比较采用SNK-q 检验，取α=0.05 水准，P < 0.05为差异有显著性意义。