脐带间充质干细胞移植对不同证型系统性红斑狼疮患者的效果分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.015

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (45): 7298-7303.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.015

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脐带间充质干细胞移植对不同证型系统性红斑狼疮患者的效果分析

汤郁，刘瑞霞，裘影影，芮金兵，李晶

江苏大学附属医院风湿免疫科，江苏省镇江市 212001

收稿日期:2015-09-28 出版日期:2015-11-05 发布日期:2015-11-05
通讯作者: 李晶，教授，主任医师，硕士生导师，江苏大学附属医院风湿免疫科，江苏省镇江市212001
作者简介:汤郁，女，回族，1972年生，江苏省镇江市人，2011年南京中医药大学毕业，博士，副主任医师，主要从事以系统性红斑狼疮为主的自身免疫病的临床和实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81202358，81571582)；2014江苏省六大人才高峰项目(WSN-039)

Therapeutic effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation in systemic lupus erythematosus patients with different patterns of syndromes

Tang Yu, Liu Rui-xia, Qiu Ying-ying, Rui Jin-bing, Li Jing

Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China

Received:2015-09-28 Online:2015-11-05 Published:2015-11-05
Contact: Li Jing, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
About author:Tang Yu, M.D., Associate chief physician, Department of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81202358, 81571582; Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province, No. WSN-039

摘要/Abstract

摘要：

背景：系统性红斑狼疮按中医辨证分为热毒炽盛等4个症型，治疗以补肾养阴，清化淤毒为主，但仍有许多患者治疗效果不佳。间充质干细胞具有多向分化、造血支持和免疫调节的功能，目前已有多项研究用于治疗难治性、复发性系统性红斑狼疮，取得良好疗效。

目的：探讨脐带间充质干细胞移植对不同证型系统性红斑狼疮患者的疗效。

方法：系统性红斑狼疮患者21例，经中医辨证分成热毒炽盛证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证及气滞血瘀证4型，分别统计患者脐带间充质干细胞移植前后各型的临床及实验室指标变化。

结果与结论：脐带间充质干细胞移植1，3，6个月均可有效减少系统性红斑狼疮患者实验尿蛋白含量，降低系统性红斑狼疮疾病活动指数评分(P < 0.01)。与移植前比较，移植脐带间充质干细胞后1，3，6个月可显著减少肝肾阴虚型患者尿蛋白含量(P < 0.01)，移植后1，3个月对热毒炽盛及气滞血瘀型尿蛋白含量为轻度减少(P < 0.05)，脾肾阳虚型患者在植后1个月时的尿蛋白含量轻度减少(P < 0.05)。脐带间充质干细胞移植可提高所有中医分型患者的血浆白蛋白含量(P < 0.01)，其中对热毒炽盛型效果稍差(P < 0.05)。脐带间充质干细胞移植后各型患者外周血血小板有上升趋势，但与移植前相比差异无显著性意义。结果说明，脐带间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮有效，对不同症型的系统性红斑狼疮患者的疗效有一定的差异。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 系统性红斑狼疮, 干细胞移植, 脐带脐血干细胞, 间充质干细胞, 移植, 中医证型, 尿蛋白, 疾病活动度, 评分, 血小板, 血浆白蛋白, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Systemic lupus erythematosus (SLE) is classified into four types, and the major treatment is to tonify kidney and nourish yin, clear blood stasis and toxin by the traditional Chinese medicine (TCM). Even though, there are still many patients with poor efficacy. Mesenchymal stem cells have the capacity of multiple differentiation, hematopoietic support and immune regulation, thus having been used for the treatment of refractory, recurrent SLE and achieving good effects.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation on SLE patients with different patterns of syndromes.
METHODS: Twenty-one SLE patients were clustered to four syndrome types of TCM, including heat-toxin, yin deficiency of liver and kidney, yang deficiency of spleen and kidney, and qi stagnation and blood stasis. The changes in clinical and laboratory indicators were analyzed statistically before and after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: The level of 24-hour proteinuria and SLE disease activity index scores in SLE patients were significantly decreased at 1, 3, 6 months after cell transplantation (P < 0.01). Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation could significantly reduce the 24-hour proteinuria in SLE patients with yin deficiency of liver and kidney at 1, 3 and 6 months (P < 0.01), while slightly reduce the 24-hour proteinuria in SLE patients with heat-toxin and qi stagnation and blood stasis at 1, 3 months (P < 0.05) as well as in SLE patients
with yang deficiency of spleen and kidney at 1 month (P < 0.05). Additionally, umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation could increase the serum albumin levels in all the SLE patients (P < 0.01), although the changes in patients with heat-toxin were moderate (P < 0.05). All the SLE patients of four types had an increasing trend of their platelet counting after cell transplantation, but there was no statistical difference before and after cell transplantation. Taken together, umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation is effective for treatment of SLE, but has different therapeutic efficacy on SLE patients with different syndrome types of TCM.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stem Cells, Lupus Erythematosus, Systemic, Mesenchymal Stem Cell Transplantation

汤郁，刘瑞霞，裘影影，芮金兵，李晶. 脐带间充质干细胞移植对不同证型系统性红斑狼疮患者的效果分析[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7298-7303.

Tang Yu, Liu Rui-xia, Qiu Ying-ying, Rui Jin-bing, Li Jing. Therapeutic effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation in systemic lupus erythematosus patients with different patterns of syndromes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7298-7303.

图/表（结果） 4

2.1 患者数量分析纳入患者21例，均进入结果分析。2.2 患者基线资料分析将患者分为中医4种症型，各症型患者在年龄、系统性红斑狼疮疾病活动度评分上差异无显著性意义，热毒炽盛证、肝肾阴虚证患者病程明显低于脾肾阳虚证患者(P < 0.01)，脾肾阳虚证患者病程长于气滞血瘀证患者(P < 0.05)，见表1。

2.3 间充质干细胞移植前后系统性红斑狼疮患者系统性红斑狼疮疾病活动度评分，实验尿蛋白定量的变化移植后1，3，6个月，患者系统性红斑狼疮疾病活动度评分、实验尿蛋白定量下降(P < 0.01)，并在随诊1年和2年的2例患者中保持稳定(图1)。

2.4 间充质干细胞移植前后不同证型系统性红斑狼疮患者实验尿蛋白定量的变化间充质干细胞移植后1，3，6个月，肝肾阴虚型患者尿蛋白在明显下降(P < 0.01)；热毒炽盛、气滞血瘀型患者的尿蛋白含量在移植后1，3个月轻度减少(P < 0.05)；脾肾阳虚型患者在移植后1个月蛋白尿含量显著减少(P < 0.01)，而移植后3，6个月的尿蛋白定量与移植前相比差异无显著性意义(表2)。

2.5 间充质干细胞移植前后不同证型系统性红斑狼疮患者血浆白蛋白的变化不同证型系统性红斑狼疮患者血浆白蛋白水平在移植后6个月均上升，其中肝肾阴虚、气滞血瘀和脾肾阳虚型患者显著升高(P < 0.01)，热毒炽盛型患者较移植前有轻度上升(P < 0.05；图2)。

2.6 间充质干细胞移植前后不同证型系统性红斑狼疮患者外周血细胞计数的变化在移植的21例患者中，有外周血小板减少的9例，其中肝肾阴虚型患者4例，占44.4%，气滞血瘀型患者3例，占33.3%，脾肾阳虚和证热毒炽盛型1例，各占11.1%。移植后6个月，9例患者血小板均出现不同程度的恢复趋势[(48.55±7.00)×10⁹ L^-¹ vs. (88.33± 5.40)×10⁹ L^-¹]，但差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.7 不良反应分析患者移植后均未出现明显不良反应。

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引言

系统性红斑狼疮一种是临床多见的，累及多脏器、多系统的自身免疫性疾病，患者体内由于T、B淋巴细胞异常活化，产生大量的自身抗体和炎性细胞因子导致靶器官损伤。中医对系统性红斑狼疮虽无专门病名与之相应，但有与之相类似的症状描述，如根据皮疹特征出发称之为“蝴蝶丹”、“阴阳毒”；根据本病可累及周身的特点，称为“周痹”；有肾功损害者，属“水肿”；有胸水者属“悬饮”等[1]。中医辨证多将系统性红斑狼疮分为热毒炽盛证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证和气滞血瘀证4型[2]，多认为肾阴亏虚为发病基础，外感六淫邪毒为致病原因。临证中，补肾养阴，清化淤毒为常用大法[3]。因证论治虽可在一定程度上缓解或解除患者的临床症状，但目前尚不能从根本上治愈患者。传统西医的治疗以糖皮质激素辅以免疫抑制剂如环磷酰胺、吗替麦考酚酯为主，但仍有部分患者对以上药物无效或反复复发，预后不良。不仅如此，大量的激素和免疫抑制剂易招致严重的感染、导致心血管疾病肿瘤等不良反应。间充质干细胞是中胚层来源的成体干细胞，具有免疫调节功能。近年来，已有多项研究使用脐带来源间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮[4-7]、干燥综合征[8]、多发性肌炎/皮肌炎等自身免疫疾病[9]，取得一定疗效。但间充质干细胞对不同中医症型系统性红斑狼疮患者的疗效如何，目前还未见报道。
文章就间充质干细胞对不同中医症型系统性红斑狼疮的疗效进行分析，探讨间充质干细胞移植治疗系统性红斑狼疮的中医理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计回顾性病例分析。

1.2 时间及地点于2012年4月至2014年12月在江苏大学附属医院检验科完成。

1.3 对象全部病例来自2012年4月至2014年12月期间江苏大学附属医院风湿免疫科进行间充质干细胞移植的患者21例，其中男2例，女19例；年龄17-55岁，平均(30.47± 11.61)岁。本项目由江苏大学附属医院伦理委员会审查通过，医院具有干细胞移植资质，间充质干细胞移植前所有患者签署知情同意书。

诊断标准：系统性红斑狼疮符合1982年美国风湿病学院修订的系统性红斑狼疮诊断标准^[10]。

纳入标准：①年龄17-65岁，性别不限。②经临床确诊的系统性红斑狼疮病例。③疾病处于活动期：系统性红斑狼疮疾病活动度评分^[11]：≥8分；实验尿蛋白定量≥0.5 g；血肌酐升高，超过正常值上限；血细胞减少；轻中度肺动脉高压，心功能为1或2级；难治性皮肤溃疡；抗磷脂抗体综合征；狼疮性肺炎或狼疮肝损害。

排除标准：①有严重药物过敏史或过敏体质者。②有较严重感染者。③有恶性肿瘤者。④心功能3，4级患者。⑤有精神异常和严重认知功能障碍者。⑥非弥漫性结缔组织病所致的肝功能异常者。⑦终末期肾功能不全者。⑧血清人类免疫缺陷病毒和其他致病性病原学检查阳性者。⑨非弥漫性结缔组织病所致的凝血功能障碍者。⑩入组前3个月内参加过其他临床研究者，怀孕或打算孕育的女性患者，研究者认为还存在有其他原因不能纳入本项研究者。

中医辨证：参照国家中医药管理局发布的中医病证诊断疗效标准^[2]，将系统性红斑狼疮分为4个证型：①热毒炽盛证：壮热、面红气粗、斑疹红赤、肌肉红肿疼痛、烦躁口渴、甚则神昏抽搐、舌红绛苔黄燥和脉细数或弦数。②肝肾阴虚证：头晕耳鸣、脱发、口眼干涩、五心烦热、腰膝酸软、月经量少或闭经、或低热盗汗、舌干红少苔和脉细数。③脾肾阳虚证：面浮肢肿、胸腹胀满、小便不利、大便溏薄、舌淡胖、苔白润和脉沉细弱。④气滞血瘀证：红斑暗紫、肌肤甲错、肢端青紫、甲床暗黑、胸胁刺痛、心烦口苦、月经量少有血块、舌暗有瘀斑、舌下瘀筋显露和脉涩。

1.4 材料

脐带间充质干细胞移植不同证型系统性红斑狼疮患者的效果分析实验仪器及试剂：
仪器及试剂	来源
CO₂培养箱(3110型)、流式细胞仪	美国FORMA公司
DMEM低糖达氏修正依氏培养基(L-DMEM)	Gibco公司，美国
胎牛血清	Gibco公司，美国
CD105等抗体	Stemcell公司，美国

细胞：脐带间充质干细胞由无锡博雅干细胞集团提供。

1.5 实验方法

1.5.1 脐带间充质干细胞的分离和培养按常规方法培养^[12-13]，取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以PBS充分冲洗，剔除脐动、静脉，剩余的间质组织切割成直径为1.0-2.0 mm大小的组织块，置DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清、25 mmol/L谷胺酰胺、100 U/mL青霉素，100 U /mL链霉素)中，于含有体积分数5%CO₂，37 ℃饱和湿度培养箱中培养，细胞达80%汇合后，以体积分数0.2%的胰酶/EDTA消化并按1∶2-1∶3的比例传代。

细胞消化后经锥虫蓝染色分析细胞活力均>92%，病原微生物学检测(包括需氧菌、厌氧菌检测，HBsAg、HBcAb、HCVAb、抗HIV、CMV-IgM、梅毒抗体等)均为阴性，流式细胞仪鉴定干细胞表面标记CD105、CD73、CD90阳性率≥95%，而CD45、CD34、CD14、CD79、HLA-DR等阳性率≤2%^[14-15]。输注细胞为P2至P4代。

1.5.2 细胞移植方案所有患者按1×10⁶/kg静脉输注脐带间充质干细胞^[16]，输注前及输注后2 d静脉使用头孢美唑2.0 g(2次/d)+左氧氟沙星0.5(1次/d)，输注前15 min予盐酸异丙嗪25 mg肌肉注射。脐带间充质干细胞输注当日制备细胞悬液，4 ℃运输保存。脐带间充质干细胞直接静脉回输，约20 min内输注完成。

1.5.3 随诊所有患者在1，3个月随诊，6个月随诊患者19例，1，2年随诊各2例。

1.5.4 治疗(修复)效果评价标准系统性红斑狼疮疾病活动度评分评价疾病活动情况：检测肾脏实验尿蛋白定量及血浆白蛋白，血小板计数。

1.6 主要观察指标实验尿蛋白定量、血浆白蛋白、外周血血小板计数结果，不良反应。

1.7 统计学分析数据以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0和Grafpad 5.0软件进行统计学分析，组间数据差异的比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

祖国医学认为系统性红斑狼疮的病机是本虚标实，本虚以肾虚阴亏为要，标实以热毒、瘀血为主，但中医理论缺乏有效的评判标准。有研究结合现代西医的指标发现系统性红斑狼疮的实症、虚症与ANA滴度、TNF的值有关^[17]；系统性红斑狼疮的血管炎可以表现为中医一派热毒之象；血液流变学指标可以解释为中医的血瘀证候的微观特征^[18]。将中医辨证和现代检测指标相结合进行研究是一种研究中医证型的新思路。

间充质干细胞具有多向分化^[19-20]、免疫调节^[21-23]、支持造血的功能^[24-25]，可来源于骨髓、脐带、胎盘及脂肪等多种组织^[26]。脐带来源间充质干细胞较骨髓来源间充质干细胞具有其独特的优势：其体外易得、体外克隆形成速度较骨髓间充质干细胞快^[12]、成骨分化力更强^[27]、不存在伦理方面的争论。因此试验选用脐带间充质干细胞进行移植。

试验的结果显示，脐带间充质干细胞移植可很好的降低系统性红斑狼疮患者尿蛋白水平，降低患者的疾病活动度，与Sun等^[5]的研究结果一致；9例存在血液系统损伤的患者，血小板有不同程度的上升趋势，虽然无统计学差异，但对血液系统损伤的治疗效果，需更多的样本量进一步证实。同样，但因为患者例数较少，无法在不同中医症型的患者中进行效果的比较。

张进等^[28]研究认为，干细胞，包括造血干细胞和间充质干细胞，属于中医“肾精”的概念，尤其是先天之精与干细胞直接相关。肾精包含“生殖之精”、“骨髓之精”、“脑髓之精”、“脏腑之精”和“生克之精”，主“繁衍生殖”、“生长发育”、“生髓化血”、“濡养脏腑”四大功能。间充质干细胞的多向分化、造血支持和免疫调节的功能正符合骨髓之精、脏腑之精和生克之精的特点。系统性红斑狼疮本虚标实，肾精不足。因此直接给以肾精，以补先天之不足，继而转化为各种后天之精，属于补肾填精治法，直接治本。实验的研究结果发现，间充质干细胞移植可以明显减少系统性红斑狼疮患者患者24 h尿蛋白，降低系统性红斑狼疮疾病活动度评分。移植到肾脏的细胞一方面可以抑制抗原抗体复合物引起的炎症反应，另一方面可以转化为肾间质细胞，发挥修复作用^[29]。间充质干细胞移植对肝肾阴虚、热毒炽盛、气滞血瘀型患者的尿蛋白均有减少作用，尤其是对肝肾阴虚型患者效果显著，对热毒炽盛、气滞血瘀型患者作用主要在6个月以内，推测输入的间充质干细胞以发挥其抗炎作用为主。对肝肾阴虚型肾脏同时有一定的修复作用；对脾肾阳虚患者，蛋白尿仅在移植1个月有所减少，其后无效。概应大多数该型患者病程较长，病势邪盛正衰日趋严重，西医多见肾病综合征类型。这类患者肾脏大都纤维化，很多属于Ⅴ型狼疮肾炎，短期内细胞输入可能有一定的抗炎作用，但最终也难以逆转。

肾藏脏腑之精，输入肾精滋养脏腑组织的生长发育或再生修复和功能。间充质干细胞可以通过减少肾蛋白尿的丢失和分泌各种生长因子，促进干细胞再生^[30]，从而提高血浆白蛋白。间充质干细胞移植可提高各证型狼疮患者血浆白蛋白，对热毒炽盛型效果稍差。因其不能有效减少脾肾阳虚患者肾脏蛋白尿，推测间充质干细胞主要是通过促进干细胞再生和合成蛋白功能而起到升高血浆蛋白作用的。

肾精主骨，主髓，化血，间充质干细胞作为肾精的一部分，是生髓化血的执行者之一。骨髓间充质干细胞能参与诱导、调节骨髓造血干细胞和基质的发育^[31-40]；体外输入的间充质干细胞部分归巢入骨髓，参与造血支持，骨重建和骨髓的免疫调节^[41]。文章外周血血细胞减少四型均见，气滞血瘀型临床表现为外周微循环障碍，或伴血栓形成、血管炎^[42]、血小板减少。间充质干细胞移植后各型血小板上升明显，因例数少，各型之间无法比较优劣。

总之，间充质干细胞移植可有效减少系统性红斑狼疮患者蛋白尿，降低疾病活动度。移植对肝肾阴虚型患者肾损有明显修复作用，对热毒炽盛、气滞血瘀型患者肾损的作用主要在6个月内；移植短期内对脾肾阳虚型患者肾脏有一定治疗作用。间充质干细胞移植可显著提高肝肾阴虚、脾肾阳虚及气滞血瘀型狼疮患者血浆白蛋白，对各型血小板减少的患者外周血血小板可能有一定提升作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脐带间充质干细胞移植对不同证型系统性红斑狼疮患者的效果分析

Therapeutic effect of umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation in systemic lupus erythematosus patients with different patterns of syndromes

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