人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞促进创伤性颅脑损伤的神经再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往研究表明骨髓间充质干细胞治疗神经疾病方面已经取得了一定成效，能明显促进神经功能改建，但关于基因及药物调控的相关研究目前尚未取得突破性进展。
目的：探讨人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞分化对创伤性颅脑损伤后神经再生的影响。
方法：采用液压冲击法建立大鼠颅脑创伤模型，随机分为颅脑损伤组、骨髓间充质干细胞组、人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组。移植后2周采用Western blot检测创伤脑组织神经生长因子及脑源性神经营养因子表达水平，免疫组织化学法检测BrdU标记的阳性细胞数量；移植后1，3 d及1，2周进行动物神经学缺损评分。
结果与结论：人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组大鼠脑创伤组织神经生长因子及脑源性神经营养因子蛋白表达水平明显高于骨髓间充质干细胞组和颅脑损伤组(P < 0.05)；人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组BrdU标记的阳性细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组和颅脑损伤组(P < 0.05)；移植后3 d及1，2周，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞组和颅脑损伤组(P < 0.05)。结果表明经人参皂苷诱导分化后的骨髓间充质干细胞移植可以促进创伤性颅脑损伤大鼠的神经再生，较单独应用骨髓间充质干细胞移植效果显著。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 颅脑损伤, 人参皂苷, 骨髓间充质干细胞, 大鼠, 神经再生, 神经生长因子, 脑源性神经营养因子

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of neurological diseases have achieved some success, which can promote neurological alterations; however, there is no breakthrough on gene and drug regulation.
OBJECTIVE: To investigate the influence of ginsenosides-induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells on nerve regeneration after traumatic brain injury.
METHODS: A traumatic brain injury model was built in rats using hydraulic shock method, and then rat models were randomly divided into model group (traumatic brain injury group), bone marrow mesenchymal stem cell group, ginsenosides group (ginsenosides induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells). At 2 weeks after transplantation, western blot assay was used to detect protein expression levels of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor, immunohistochemistry assay used to detect the number of BrdU-positive cells. At 1, 3 days and 1, 2 weeks after transplantation, modified neurological severity scores were recorded.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression levels of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor protein were significantly higher in the ginsenosides group than the bone marrow mesenchymal stem cell
group and model group (P < 0.05). The number of BrdU positive nerve cells was also higher in the ginsenosides group than the bone marrow mesenchymal stem cell group and model group (P < 0.05). At 3 days and 1, 2 weeks after transplantation, the modified neurological severity scores in the ginsenosides group were lower than those in the bone marrow mesenchymal stem cell group and model group (P < 0.05). These findings indicate that ginsenoside-induced bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can promote nerve regeneration in rats with traumatic brain injury, which has better outcomes than bone marrow mesenchymal stem cell transplantation alone.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Craniocerebral Trauma, Ginsenosides, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

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图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的形态培养第5天时在培养瓶底可见细胞散在分布，呈菱形或三角形，集落数目明显增多，胞体透亮。培养10-14 d时集落间渐融合成单层，集落细胞不断扩增，细胞胞体细长，呈放射状向周围扩展，有的细胞呈宽大扁平状，呈成纤维细胞样，可见多个长的胞浆突起。随着传代次数的增加，贴壁细胞均匀分布，形态趋于一致，多以梭形为主，胞体饱满。骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达97%以上，见图1。

2.2 MTT法检测人参皂苷对骨髓间充质干细胞增殖作用随着人参皂苷质量浓度的增加，所测吸光度值逐渐增大，当人参皂苷质量浓度为120 mg/L时，其增殖作用最为显著，继续增大浓度细胞数量反而减少，见图2。实验最终用120 mg/L人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞分化。

2.3 Western blot检测脑组织中神经生长因子及脑源性神经营养因子蛋白表达移植后2周，对照组、骨髓间充质干细胞组、人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组的神经生长因子蛋白表达分别为0.05±0.03，0.78±0.15，1.59± 0.14，脑源性神经营养因子蛋白表达分别为0.04±0.05，0.83±0.11，1.63±0.20。人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞组比较神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白表达显著升高，而对照组的神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白呈弱表达，各组间的差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 免疫组织化学法检测移植的骨髓间充质干细胞增殖状况脑内BrdU阳性细胞散在分布于各区，无明显密集分布。移植后2周，对照组无BrdU标记的细胞(BrdU标记的细胞呈现棕黄色)；骨髓间充质干细胞组BrdU标记的阳性细胞数(21.82±2.63)少于人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组(46.45±2.78)；人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组可见有大量散在的BrdU标记的阳性细胞，见图4。

2.5 神经学缺损评分结果移植后1 d，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；移植后3 d，1周，2周，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，与骨髓间充质干细胞组比较，差异亦有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年2月至2015年4月在广西医科大学中心实验室完成。

1.3 实验动物及材料

人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞促进创伤性颅脑损伤大鼠神经再生实验所用主要试剂及仪器：
试剂、仪器	来源
胎牛血清	美国Hyclone公司
胰蛋白酶	北京赛百盛基因技术有限公司
DMEM培养基	美国GIBCO公司
Western blot试剂盒	美国Coulter公司
MMLV 试剂盒	美国Contnental Lab Products公司
AMV反转录试剂盒	美国abcam公司
抗BDNF抗体及抗NGF抗体	武汉博士德生物技术有限公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体	美国BIORAD公司
辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体	美国Promega公司
人参皂苷	中国药品生物制品检定所
C4酶标仪	美国BIORAD公司

实验动物：选取健康SD大鼠51只(50只用于造模，1只用于细胞培养)，体质量为215-220 g，1月龄，雌雄不限，由广西医科大学动物实验中心提供，合格证号为SCXK桂2003-0003。所有大鼠饲养于20-22 ℃室温下，保持湿度为50%左右。采用普通大鼠饲料及消毒无菌水喂养，让其自由进食及饮水，实验操作过程中对动物处置方法符合动物伦理学规定。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养随机选取1月龄健康SD大鼠处死，将全身浸入体积分数为75%乙醇中消毒约 10 min。在无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10号注射器抽取1 mL DMEM完全培养基自一端冲出骨髓，制成单细胞悬液，以3×10⁷ L^-¹细胞浓度数接种至100 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。并按1︰2比例传代。逐日观察细胞的生长情况，待细胞融合达到80%-90%时，进行下一次传代，再次传代时按1︰3比例进行。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化。骨髓间充质干细胞在体外培养融合达到80%后换液，加入含BrdU的培养基进行标记。

1.4.2 MTT法检测人参皂苷对骨髓间充质干细胞增殖的作用取培养3代的骨髓间充质干细胞，用培养液配成细胞悬液，每孔按1.0×10⁴个细胞接种至96孔板中，对照组每孔加入100 μL培养液，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组加入20，40，80，120，160，200 mg/L人参皂苷100 μL，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度的孵育箱中，培养7 d后，每孔加入配置好的0. 25%MTT溶液20 μL(MTT以5 g/L用PBS配制，pH=7.4)，培养4 h后弃上清，每孔加150 μL 二甲基亚砜，置于微型振荡器振荡10 min，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定570 nm波长处各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.4.3 人参皂苷促进骨髓间充质干细胞诱导分化选用5代的骨髓间充质干细胞进行诱导分化，以2.5×10⁸ L^-¹接种到6孔培养板中，细胞达80%融合时，弃培养液，加入含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的完全培养液预诱导24 h，PBS洗3次，更换成含120 mg/L人参皂苷的无血清培养液诱导。对照组不加任何诱导剂，继续用完全培养液培养，显微镜下观察细胞形态变化。

1.4.4 建立大鼠颅脑损伤模型采用液压颅脑损伤仪对50只SD大鼠建立颅脑损伤模型，大鼠以30 mg/kg的苯巴比妥钠腹腔注射麻醉后，按国际通用标准，给予253.312 5- 303.975 kPa峰值的冲击压力，对损伤后出现自主呼吸暂停的SD大鼠，立即采用小动物呼吸机给予面罩吸氧。以神经功能缺损评分为10-12分作为入选实验对象。实验动物在建模过程中死亡5只，将剩余45只纳入实验研究进行分组。

1.4.5 实验分组大鼠颅脑创伤模型建立后，随机分为颅脑损伤组、骨髓间充质干细胞组、人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组，每组15只。造模后6 h，分别经尾静脉注射细胞培养液1 mL、骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2.0×10⁹ L^-¹)、人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞悬液1 mL(细胞浓度为2.0×10⁹ L^-¹)。

1.4.6 取材移植后2周，20%乌拉坦按1.2 g/kg经腹腔内注射麻醉后，断头取损伤部位脑组织。

1.4.7 Western blot检测人参皂苷对神经生长因子及脑源性神经营养因子蛋白表达的影响取脑组织，研磨，加入 1 μL PMSF裂解液于冰上裂解30 min，转移至1.5 mL离心管中，在4 ℃下以12 000 r/min速度离心5 min，取上清液进行蛋白定量，上样，10%聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，37 ℃封闭30 min，分别加入1∶1 000的抗NGF及1∶500的抗BDNF抗体，β-actin兔抗鼠多克隆抗体稀释溶于TBST中，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入1︰500稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体，室温下培育60 min，二甲基联苯胺显色。实验重复3次。以Quantity one软件分析，目的条带与β-actin条带吸光面积比值评定蛋白表达水平。

1.4.8 免疫组织化学法检测移植的骨髓间充质干细胞增殖状况于骨髓间充质干细胞移植后2周，每组随机取5只大鼠脑组织，40 g/L多聚甲醛固定10 min，行常规冰冻切片，严格按BrdU说明书染色步骤操作。切片常规脱蜡后，先利用蒸馏水清洗，再以PBS冲洗3次，每次3 min。体积分数为3%H₂O₂-PBS封闭内源性过氧化物酶10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。将切片放置于BD-Retrievagen A工作液的染色缸内，微波炉加热到89 ℃，共10 min，取出后盖紧盖子慢慢冷却到室温。PBS冲洗3次，每次5 min。弃掉PBS，每张切片加入100 μL新鲜配制的DAB溶液，放置于显微镜下观察10 min至DAB显色呈鲜艳的棕黄色。利用蒸馏水彻底清洗3次，每次2 min，终止反应。每张切片在高倍镜(×200)下任取5个视野，荧光显微镜观察计算每个视野的BrdU阳性细胞数，取其均值作为每组的BrdU阳性细胞数。

1.4.9 动物神经学缺损评分各组分别于移植后1，3 d及1，2周行动物神经学缺损评分。采用改良神经功能缺损评分标准(mNSS)进行神经功能缺损评分。mNSS量表分为4个部分：运动、感觉、平衡和反射，其总分是18分，正常大鼠为0分，评分越低说明动物的神经行为学功能越好，评分越高，说明神经功能障碍越严重。

1.5 主要观察指标 ①人参皂苷对脑组织神经生长因子及脑源性神经营养因子蛋白表达的影响。②移植后骨髓间充质干细胞增殖情况。③动物神经学缺损评分。

1.6 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件包进行分析，所有实验数据均以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，单因素两组间比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

从传统研究理论看，颅脑受损后的生物学结构不具有再生修复能力，成熟的脑细胞一旦发生损伤就不能重生[14-15]。但近来研究表明骨髓间充质干细胞具有的高度自我复制能力及多向分化潜能，使其可以分化成神经细胞，改善神经功能缺失症状。利用骨髓间充质干细胞治疗脑损伤，是现阶段学术界广泛关注的治疗新策略[16-17]。骨髓间充质干细胞存在生长周期短且不稳定，影响其发挥神经保护功能，因此目前治疗重点是调控骨髓间充质干细胞治疗的有效性[18-20]。
人参皂苷(Rh2)是从中国传统中药人参和三七中提取出的人参皂苷类单体之一，是一种固醇类化合物，三萜皂苷也是人参中的主要生物活性成分[21-25]。人参总皂苷具有改善微循环、阻止钙离子内流、抑制炎症反应等多重作用，对心血管、神经系统及免疫功能等均具有广泛的药理作用[26-30]。既往研究发现，人参总皂苷能减轻创伤性脑损伤后的继发性损伤[31-35]。
为了更深入研究颅脑损伤的治疗效果，神经学科专家们研究建立了多种大鼠脑损伤模型以最大程度的模拟颅脑损伤机制，包括液压冲击脑损伤模型、惯性加速脑损伤模型、固定脑损伤模型、落重法闭合性脑损伤模型等，本研究采用目前国内外广泛认可的液压冲击法建立脑损伤模型，液压冲击法具有实验重复性好、稳定性高、致伤程度稳定等优点，本实验建模后SD大鼠主要表现为蛛网膜下腔出血、神经元细胞水肿、微血管外间隙扩大等中型脑损伤表现。
通过MTT法检测结果表明人参皂苷促进了骨髓间充质干细胞增殖；实验中通过Western blot检测结果显示，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组大鼠脑创伤组织神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白表达水平明显大于骨髓间充质干细胞组和对照组，表明经人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞增殖后，能促进神经生长因子、脑源性神经营养因子蛋白的表达；免疫组织化学法检测结果可以看到人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组BrdU标记的阳性神经细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组及对照组，表明人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞促进脑细胞生长更具有优势作用；通过mNSS法对各组大鼠的神经功能进行评分，其结果显示移植后1，2周，人参皂苷诱导分化的骨髓间充质干细胞组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞组及对照组，表明人参皂苷诱导骨髓间充质干细胞后可以更好的促进脑损伤后大鼠脑神经功能的恢复。
综上所述，骨髓间充质干细胞单独移植可以促进脑损伤后神经功能的再生，但是通过人参皂苷干预后，能更好的调控骨髓间充质干细胞发挥神经再生功能，为探讨神经保护修复的机制提供实验依据。由于研究资料有限，其调控的具体机制还有待进一步深入研究。
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