结肠癌干细胞蛋白表达及生物学特性：培养与筛选分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来国内外学者相继分离出EpCAMhighCD44+结肠癌干细胞，但大多为有关大肠癌细胞系中肿瘤干细胞的分离研究，关于结肠癌干细胞功能的报道相对较少。
目的：从结肠癌组织对结肠癌干细胞进行筛选和分离培养，探讨结肠癌干细胞蛋白表达情况以及生物学特性。
方法：获得结肠癌组织标本，进行原代细胞分离。分离EpCAMhighCD44+细胞，利用流式细胞仪进行检测、分选，并利用无血清培养基对细胞进行培养和传代，观察细胞球形成情况。对小鼠进行细胞皮下回植，观察其日常表现以及肿瘤生长情况。待肿瘤生长到直径1 cm以上之后，获得肿瘤组织进行免疫组化检验，观察EpCAMhighCD44+肿瘤细胞流式细胞仪分选情况和不同时间EpCAMhighCD44+肿瘤细胞在无血清培养基中的生长情况，以及小鼠成瘤情况和移植瘤免疫组化检查中性上皮黏蛋白和结肠特异性分化标志物CK-20表达情况。
结果与结论：经检测在获得的结肠癌组织中存在EpCAMhighCD44+结肠癌干细胞，在结肠癌原代细胞中EpCAMhighCD44+细胞的比例为1.7%-38%。在无血清培养基中对EpCAMhighCD44+肿瘤细胞进行24 h的培养之后进行观察，可以发现产生一定体积较小松散的悬浮细胞球，但数量较少；培养21 d之后进行观察，可以发现形成形态一致的细胞球，且形态致密。经裸鼠皮下回植和观察，可以发现形成移植瘤。对移植瘤进行苏木精-伊红染色和观察，可以发现呈现出典型的结肠癌细胞形态特征。对移植瘤进行免疫祖化检查，所有移植瘤均能表选中性上皮黏蛋白和结肠特异性分化标志物CK-20。经检测发现，经10PPC、1PPC、0.1PPC 5-氟尿嘧啶干预，EpCAMhighCD44+Colo205细胞的增殖均得到促进，且随着药物作用时间的延长促进作用逐渐增强。提示结肠癌组织中存在EpCAMhighCD44+结肠癌干细胞，其具有一定的增殖、更新、分化以及致瘤能力和耐化疗能力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 结肠癌, 中性上皮黏蛋白, 成瘤能力, 生物学特性, 培养, 筛选

Abstract:

BACKGROUND: EpCAMhighCD44+ colon cancer stem cells have been isolated in recent years, and most of them are related to the study of isolating tumor stem cells in colorectal cancer cell lines. There are less reports on the function of colon cancer stem cells.
OBJECTIVE: To isolate, screen and culture colon cancer stem cells from colorectal carcinoma tissues and to explore the protein expression and biological characteristics of colon cancer stem cells.
METHODS: The primary cells were isolated from the colon cancer tissues. EpCAMhighCD44+ cells were detected and sorted by flow cytometry. Then, these cells were cultured in serum-free medium. After the cells were
replanted subcutaneously into the mice, we observed the daily performance and tumor growth in the mice. When the tumor diameter was above 1 cm, tumor tissues were taken for immunohistochemical testing. The growth of EpCAMhighCD44+ cells cultured in the serum-free medium was observed; expressions of neutral epithelial mucin and CK-20 in EpCAMhighCD44+ cells were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: EpCAMhighCD44+ colon cancer stem cells were detected in the colon cancer tissues, and the proportion of EpCAMhighCD44+ cells in primary colon cancer cells was 1.7%-38%. After 24 hours of serum-free culture, there were a few of small suspended cell spheres which were incompact. After 21 days, dense cell spheres with uniform size were found. The formation of transplanted tumor was found in the nude mice. Hematoxylin-eosin staining showed the transplanted tumor had the typical characteristics of colon cancer cells. The expression of neutral epithelial mucin and CK-20 was observed in all the transplanted tumors. Additionally, the proliferation of EpCAMhighCD44+ cells could be promoted by 5-fluorouracil (10, 1, and 0.1 PPC) with time. These findings indicate that EpCAMhighCD44+ colon cancer stem cells in the colon cancer have a certain ability of proliferation, regeneration, differentiation, tumor formation and chemotherapy resistance.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tumor Stem Cells, Neoplastic Stem Cells, Colonic Neoplasms, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年6月至2015年7月在贵州省人民医院实验室完成。

1.3 材料结肠癌标本均由贵州省人民医院肿瘤外科标本室提供，均为腺癌，均经术后病理切片检测证实。

Balb小鼠20只，体质量20-25 g，雌雄各半，一般情况良好，由北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号：SYXK(京)2013-0032。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。

1.4 实验方法

原代细胞分离：将获得的结肠癌组织标本置于DMEM/

结肠癌干细胞培养实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM/F12培养基	上海恪敏生物科技有限公司
HSSS	上海远慕生物科技有限公司
DTT	上海乔羽生物科技有限公司
PBS	上海弘顺生物科技有限公司
谷胺酰胺	北京乾兆信业生物科技有限公司
青霉素	晨光生物科技集团股份有限公司
链霉素	北京大清生物技术有限公司
头孢嚷甲羧肟	广东肇庆星湖生物科技股份有限公司
两性霉素	湖南华莱生物科技有限公司
胶原蛋白酶Ⅲ	浙江夸克生物科技有限公司
胎牛血清	潍坊瑞华生物科技有限公司
氯化铵	湖北双环科技股份有限公司
胰蛋白酶	上海博升生物科技有限公司
中性上皮黏蛋白试剂盒	上海江林生物科技有限公司
CK-20试剂盒	北京欣兴唐生物科技有限公司
流式细胞仪	天津钧星瑞科技有限公司
多聚甲醛	北京东胜创新生物科技有限公司
切片机	广州市锐迩威机械有限公司
光学显微镜	深圳市海量光电有限公司

F12培养基中，添加胎牛血清，利用HSSS进行洗涤，机械分离，于室温条件下在添加DTT的PBS中进行培养。之后去除DTT，利用HSSS进行洗涤，重悬于无血清培养基，并添加谷胺酰胺、青霉素、链霉素、头孢嚷甲羧肟、两性霉素、胶原蛋白酶Ⅲ。培养2 h之后终止消化，常规离心之后添加氯化铵。利用HSSS进行洗涤、离心，重悬于无血清培养基中进行培养。
分离EpCAM^highCD44⁺细胞：收集细胞进行活细胞计数和重悬，对细胞进行离心，收集细胞，与人免疫球蛋白进行共同孵育。之后洗涤细胞并调整细胞浓度，添加HBSS液和入FITC-Antihumn-ESA、APC-Antihuman-CD44抗体，离心后弃掉上清液，再次进行细胞重悬，并利用流式细胞仪进行检测、分选。
无血清培养及传代：利用无血清培养基对细胞进行培养和传代，收待增殖形成细胞球三至四天后，收集细胞，自然沉降后弃去上清，利用胰蛋白酶进行化，并进行吹打获得单细胞悬液。利用 DMEM/F12培养基进行终止消化，常规离心洗涤，重复操作2次，观察细胞球形成情况。动物成瘤实验和免疫组化观察：对小鼠进行细胞皮下回植(图1A)，每只接种10 000个细胞。接种结束后对小鼠进行常规饲养，观察其日常表现以及肿瘤生长情况。待肿瘤生长到直径1 cm以上之后，将动物断颈处死(图1B)。获得肿瘤组织之后，进行免疫组化检验，了解中性上皮黏蛋白和结肠特异性分化标志物CK-20的表达情况。

化疗敏感性检测：将EpCAM^highCD44⁺肿瘤细胞接种在96孔板上，接种浓度为10⁴个/孔。接种24 h后添加浓度分别为10PPC、1PPC、0.1PPC的5-氟尿嘧啶，分别在加药后的24，48 h，利用MTT比色法检测细胞的增殖情况，计算药物的细胞增殖抑制率。

1.5 主要观察指标 ①EpCAM^highCD44⁺肿瘤细胞流式细胞仪分选情况。②不同时间EpCAM^highCD44⁺肿瘤细胞在无血清培养基中的生长情况。③小鼠成瘤情况。④移植瘤免疫组化检查中性上皮黏蛋白和结肠特异性分化标志物CK-20表达情况。⑤EpCAM^highCD44⁺肿瘤细胞的化疗敏感性。

讨论

当前，恶性肿瘤已成为危害人类健康的重大疾病。诊治恶性肿瘤的难点在于初性肿瘤早期发现极为困难，早期症状往往十分轻微或者不典型，甚至毫无病态^[5]。患者一般不会主动到医院就诊检查，而一旦状态明显，常常为时已晚。同时，恶性肿瘤复发率与转移率高，患者一旦得病，死亡率非常大^[6]。因此，探讨恶性肿瘤发生、发展情况，进而研发新的治疗策略成为肿瘤诊治的关键所在。

随着生活水平的不断改善，人们的日常饮食逐渐向着高脂肪、高蛋白结构方向发展，导致结肠发病率的不但上升^[7]。除了家族史，其他危险因素则包括高脂肪、高蛋白的饮食，缺乏运动等，因此，结肠又被称为“富癌”之一，发病率会随着人们生活水平提高而上升。近些年，国内结肠发病率迅速上升，上升速度约为每年4.2%，远超2%的国际水平^[8-10]。结肠癌早期常常无明显症状，目前临床发现的患者大多为中晚期，治疗效果差，生存率低。为此，临床积极寻找安全有效的治疗方案至关重要^[11]。关于结肠癌的治疗，一直是临床研究的焦点。目前，临床治疗结肠癌可以采取腹腔镜手术以及化疗等方式^[12]。朱其勇等^[13]即通过研究发现，对于T3期大肠癌患者，受到疾病的影响，患者的细胞免疫功能显著下降。而通过积极的予以新辅助化疗并进行手术治疗，术后2周患者的细胞免疫功能得到了显著的改善，基本恢复至治疗前的水平。但是，需要注意到的是，受到多种因素的影响，采用常规方法对结肠癌患者进行治疗，往往无法获得理想的效果，容易出现耐药和术后复发等，且容易导致各种术后并发症的出现^[14-15]。沈雄飞^[16]即通过研究报道，腹腔镜辅助治疗结直肠癌的过程中，可能会受到多种因素的影响，导致一定术后并发症的出现，其中，独立危险因素包括手术时间以及患者的肺部疾病情况等。为此，临床需要积极寻找有效的治疗方法，以提高治疗效果。

肿瘤干细胞学说是一门新近发展起来的全新理论，该学说认为癌症是一种干细胞异常所导致的疾病^[17]。大多数的肿瘤由不同性质的细胞亚群组成，它们的增殖潜力和移植后重建肿瘤的功能大不相同^[18]。在肿瘤细胞中，存在一类十分特殊的细胞。这些细胞具有自我更新能力以及较强的分化能力，被称为肿瘤干细胞。肿瘤细胞与干细胞具有类似之处，如它们都能自我更新，具有不定分化的潜能，其细胞表面标志也相似等^[19-20]。尽管这两种细胞均能够进行增殖，但不同之处在于：肿瘤细胞的增殖不受控制，而干细胞的增殖则受到严格的调控；肿瘤细胞增殖后异常分化，而干细胞则可以分化成正常的成熟细胞^[21-23]。肿瘤干细胞的存在被认为是肿瘤发生、发展和治疗失败的根本原因，临床治疗过程中，肿瘤细胞被药物杀死后，癌干细胞能够再次产生出癌细胞，而且药物难以对其发挥作用，所以肿瘤干细胞被认为是癌转移、复发和产生抗药性的元凶^[24]。总体来看，肿瘤干细胞可以发挥出多重种功能。首先，肿瘤干细胞可以通过自我更新和增殖来对肿瘤细胞群的生长和壮大提供强大的活力来源，帮助其维持旺盛的生命力^[25-28]。其次，肿瘤干细胞还具有较强的迁徙和运动能力，极大的促进了肿瘤细胞的转移，导致各种肿瘤的浸润和转移等。另外，在正常状态下，肿瘤干细胞还可以长期维持相对稳定的休眠状态，并具备较强的耐药性^[29-32]。因此，临床对各种肿瘤患者进行常规放疗或者化疗治疗的过程中，因为肿瘤干细胞对治疗的敏感性不强，因此无法对其造成杀灭^[33]。于是，在治疗结束一段时间之后，肿瘤干细胞便会继续发挥作用，导致肿瘤的复发，并引发一系列不良后果的出现^[34-35]。

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在其肿瘤组织中，即存在肿瘤干细胞。在本次实验中，选择以EpCAM和CD44 为表型特征，对细胞进行流式分选，以获得实验所需的结肠癌干细胞。通过本次实验，经检测，在结肠癌原代细胞中EpCAM^highCD44⁺细胞的比例为1.7%-38%。即表明，在获得的结肠癌组织中存在EpCAM^highCD44⁺结肠癌干细胞。在对肿瘤干细胞相关生物学特性进行研究的过程中，其自我更新能力是一个十分重要的研究内容。在对干细胞的自我更新能力进行研究的时候，细胞球形成实验是一种常用的方法。对于肿瘤干细胞而言，经无血清培养基培养，可以正常生长并形成一定的细胞球体，即表明其存在一定的自我更新能力。本次实验过程中，在无血清培养基中对EpCAM^highCD44⁺肿瘤细胞进行24 h的培养之后进行观察，可以发现产生一定体积较小松散的悬浮细胞球，但数量较少；培养21 d之后进行观察，可以发现形成形态一致的细胞球，且形态致密。上述结果提示，在一定的体外培养条件下，肿瘤干细胞可以正常生长，具备一定的自我更新能力。干细胞的生物学特性中，表达干细胞相关标志、启动肿瘤发生以及肿瘤形成的能力是重要的研究内容。在对肿瘤干细胞的成瘤能力进行研究的过程中，皮下回植建立动物模型是常用的方法^[36]。将分选的细胞接种到存在免疫缺陷的动物体内，通过观察一定时间内动物体内移植瘤的形成数量和大小等，可以较好的了解到相应肿瘤干细胞的呈瘤能力。通过皮下回植方式，操作简单，不影响动物的正常活动和饮食等，且可以保证最终的成瘤效果^[37-38]。本次实验过程中，经小鼠皮下回植和观察，可以发现形成移植瘤。通过对移植瘤进行苏木精-伊红染色和观察，可以发现呈现出典型的结肠癌细胞形态特征。即表明，经肿瘤干细胞皮下回植，细胞在动物体内发生作用，导致肿瘤的出现。上述结果也表明，实验中所使用的EpCAM^highCD44⁺细胞具有很强的致瘤能力，具有肿瘤干细胞特性。另外，实验中还对移植瘤进行免疫组化检查。经检查发现，所有移植瘤均能表选中性上皮黏蛋白和结肠特异性分化标志物CK-20^[39]。黏蛋白是上皮细胞产生的主要成分，对细胞起着保护和润滑的作用。CK-20是一种角蛋白，在正常组织，在人结肠隐窝的上半部分表达^[40]。结肠干细胞位于结肠隐窝基底部最底端，随着分化和自我更新，逐渐向隐窝上端和顶部迁移，最终产生分化的结肠细胞。即表明，EpCAM^highCD44⁺细胞细胞具有一定的分化能力。另外，肿瘤干细胞还会导致化疗耐药性的出现。5-氟尿嘧啶是一类抗代谢药物，是常用的化疗药物。本次实验通过化疗敏感性实验发现，，经10PPC、1PPC、0.1PPC 5-氟尿嘧啶干预，EpCAM^highCD44⁺Colo205 细胞的增殖均得到促进，且随着药物作用时间的延长促进作用逐渐增强。即提示，所获得EpCAM^highCD44⁺细胞具有耐药性。

综上所述，通过本次实验发现，结肠癌组织中存在EpCAM^highCD44⁺结肠癌干细胞，具有一定的增殖、更新、分化以及致瘤能力。EpCAM^highCD44⁺细胞保持了自身母代细胞的一定特性，同时也表明，肿瘤干细胞具有一定的分化能力。因此，通过本次研究可以进一步了解到结肠癌干细胞的相关特性，为临床治疗提供新思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程