成纤维细胞生长因子修饰骨髓间充质干细胞可促进颅脑损伤后功能的恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞虽然能促进神经再生，但因治疗方式局限，并未取得较好的疗效。应用单纯的骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤还远不能达到治疗和改善病情的目的。
目的：探讨成纤维细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞对颅脑损伤后功能恢复及胶质纤维酸性蛋白表达的影响。
方法：采用液压冲击法建立SD大鼠颅脑创伤模型，建模后随机分为对照组(颅脑损伤组)、骨髓间充质干细胞组及成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组。体外分离、培养骨髓间充质干细胞，利用腺病毒载体介导成纤维细胞生长因子基因转染入骨髓间充质干细胞。采用Western-Blot法检测成纤维细胞生长因子基因转染及胶质纤维酸性蛋白的表达情况；应用免疫组化检测BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脑内的分布及数量；利用Longa评分法于移植后1 d、3 d、1周、2周对大鼠进行神经功能学评分；TUNEL法检测脑组织细胞的凋亡情况。
结果与结论：Western-Blot结果显示，成纤维细胞生长因子基因成功转入腺病毒载体，并且能够在骨髓间充质干细胞中表达，且胶质纤维酸性蛋白在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组的表达明显高于其他两组(P < 0.05)。BrdU标记的骨髓间充质干细胞在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组脑组织中的表达明显高于其他两组(P < 0.05)。移植后2周，成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组大鼠的神经功能缺损Longa评分明显低于其他两组(P < 0.05)。TUNEL检测到的凋亡细胞数在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组明显少于其他两组(P < 0.05)。提示成纤维细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞移植能够减轻颅脑损伤模型大鼠的神经功能损伤程度，促进神经功能恢复，效果优于骨髓间充质干细胞单独移植治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 颅脑损伤, 骨髓间充质干细胞, 移植, 大鼠, 神经功能, 成纤维细胞生长因子, 胶质纤维酸性蛋白, 基因转染

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can promote nerve regeneration, but there are no better results because of the limitations of treatment methods. BMSC transplantation alone is not enough to achieve desired therapeutic effects.
OBJECTIVE: To investigate the effect of fibroblast growth factor (FGF)-modified BMSC transplantation on functional recovery and expression of glial fibrillary acidic protein after traumatic brain injury.
METHODS: Animal models of traumatic brain injury were established in Sprague-Dawley rats using hydraulic shock method, and then randomized into control group (traumatic brain injury group), BMSC group and FGF-BMSC group (FGF-modified BMSC group). After isolation and culture, BMSCs were modified by adenovirus vector-mediated FGF gene. Western blot assay was used to detect transfection efficiency and glial fibrillary acidic
protein expression; immunohistochemical detection was used to detect distribution and number of BrdU positive cells in the brain; Longa score was used to evaluate the neurologic function of rats at 1, 3 days, 1, 2 weeks after transplantation; TUNEL assay was used to detect cell apoptosis in the brain.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot results showed that FGF gene was successfully transferred to the adenovirus vector, and capable of expressing in BMSCs; moreover, the glial fibrillary acidic protein expression of FGF-BMSC group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05). The number of BrdU positive cells in the brain was significantly higher in the FGF-BMSC group than the other two groups (P < 0.05). Two weeks after transplantation, the Longa scores in the FGF-BMSC group were significantly lower than those in the other two groups (P < 0.05). TUNEL results showed that the number of apoptotic cells in the FGF-BMSC group was significantly lower than that in the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that FGF-modified BMSCs transplantation is able to improve neurological damage after traumatic brain injury and promote neurological recovery, which is better than BMSC transplantation alone.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Fibroblast Growth Factors, Transfection, Tissue Engineering

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Li Xue-dong, Chen Jia-kang, Qin Jun, Mai Yong-jun, Xiao Zhen-yong. Fibroblast growth factor-modified bone marrow mesenchymal stem cells promote functional recovery from traumatic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7279-7285.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析 55只SD大鼠建立颅脑损伤模型，建模过程中死亡1只，剩余54只纳入实验。随机分为对照组(颅脑损伤组)、骨髓间充质干细胞组及成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组(成纤维细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞组)，每组18只。54只大鼠全部进入结果分析，无脱失。2.2 骨髓间充质干细胞的形态观察原代培养的球形细胞浓度较大，呈沙粒状堆积。培养3 d换液时，可见少量贴壁细胞，两端有较长凸起，细胞大小不一。培养第5-7 d时贴壁细胞逐渐增多，散在分布于培养瓶底的骨髓间充质干细胞，呈多角形或菱形，集落数目明显增多。培养 10-14 d时细胞长满培养瓶，不断扩增的集落细胞渐融合成单层，胞体细长，呈放射状向周围扩展，形似于成纤维细胞，有的细胞呈宽大扁平状。2周后达80%-90%融合，随着传代次数的增加，贴壁细胞均匀分布，形态趋于一致，多以梭形为主，细胞活力良好，胞体饱满，着色细胞极少，见图1。

2.3 Western blot法检测成纤维细胞生长因子及胶质纤维酸性蛋白的表达应用双酶切鉴定、测序和Western blot 结果显示，成纤维细胞生长因子基因成功转入腺病毒载体，并且能够在骨髓间充质干细胞中表达。且胶质纤维酸性蛋白在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组的表达明显高于对照组及骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)。成纤维细胞生长因子及胶质纤维酸性蛋白的表达量见表1及图2。

2.4 应用免疫组化检测BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脑内的分布及数量免疫组化检测结果显示，成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞组脑组织切片中均可见BrdU阳性细胞，主要分布于损伤半球侧及周边，次之为海马区、大脑皮质区、纹状体区。

成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组3 d、14 d BrdU阳性细胞数均明显多于骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2及图3；对照组未见BrdU标记的阳性细胞。

2.5 Longa神经功能学评分结果采用Longa评分法于移植后1 d、3 d、1周、2周对SD大鼠进行神经功能学评分，各组Longa评分结果比较，移植后3 d、1周、2周，成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组大鼠的神经功能缺损评分明显低于对照组及骨髓间充质干细胞组，各组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3及图4。

2.6 TUNEL法检测脑组织细胞的凋亡情况各组神经元细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。TUNEL检测到对照组凋亡细胞的比率较高，骨髓间充质干细胞组及成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组凋亡细胞量明显减少，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。TUNEL检测各组的凋亡细胞数比较见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2013年8月至2015年6月在广西医科大学动物实验中心完成。

1.3 材料选取健康1月龄SD大鼠，雌雄不限，体质量210-220 g，购自广西医科大学动物实验中心，动物合格证号为：SCXK桂2003-0003。于常温下饲养并保持环境湿度为50%左右。让其自由进食及饮水，采用普通大鼠饲料及清洁自来水喂养。

实验操作过程中对SD大鼠的处置方法均符合动物伦理学要求。

骨髓间充质干细胞移植实验用主要试剂及材料：
主要试剂及仪器	来源
胎牛血清	杭州四季青生物工程材料有限公司
胰蛋白酶	美国Sigma公司
DMEM培养基	美国Hyclone公司
Western blot试剂盒	美国Coulter公司
通用型SP免疫组化试剂盒	北京鼎国生物技术有限责任公司
10%水合氯醛	美国Abcam公司
抗成纤维细胞生长因子抗体及抗胶质纤维酸性蛋白抗体	武汉博士德生物技术有限公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体	美国BIORAD公司美国GIBCO公司
羊抗鼠生物素化二抗IgG	美国Promega公司
pcDNA3.1-成纤维细胞生长因子质粒	上海生博公司
羊抗鼠生物素化二抗IgG	美国Promega公司
细胞培养板	德国Sigma公司
荧光倒置显微镜	德国Merck公司
TGL-16G型台式离心机	上海医用分析仪器厂
DAB显色试剂盒	北京中山生物技术有限公司
TUNEL调亡试剂盒	美国 Roche 公司
CO₂培养箱	长沙市长锦科技有限公司
净化工作台	苏净集团苏州安泰空气技术有限公司

1.4 实验方法

体外分离、培养骨髓间充质干细胞：随机选取1月龄的健康SD大鼠麻醉后处死，用体积分数为75%的乙醇浸泡10 min以做全身消毒。消毒后将SD大鼠移入超净工作台中，严格按照无菌操作规范取出双侧胫骨和股骨，注意保留骨端部分不受损伤，剪除骨端，抽取1 mL含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基自一端冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，3×10⁷ L^-¹细胞数接种至100 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。以0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶2比例传代。逐日观察细胞的生长情况，待细胞融合达到80%-90%时，进行下一次传代，再次传代时按1∶3比例进行。经多次传代扩增培养，使骨髓间充质干细胞逐渐得到纯化和扩增。传至第3代，备用。

成纤维细胞生长因子基因转染：利用腺病毒载体介导成纤维细胞生长因子基因转染入骨髓间充质干细胞：将在目的基因成纤维细胞生长因子的上游引入BamHⅠ酶切位点，下游引入XbaⅠ酶切位点，对质粒 pcDNA3.1/成纤维细胞生长因子进行双酶切鉴定、测序。腺病毒载体与成纤维细胞生长因子基因连接，转染入分离、培养好的骨髓间充质干细胞中，利用Western blot法检测成纤维细胞生长因子蛋白的表达。

采用液压冲击法建立大鼠颅脑创伤模型^[14]：采用液压颅脑损伤仪对55只SD大鼠建立颅脑损伤模型，用10%的水合氯醛以3 mL/kg的剂量经腹腔麻醉后，按国际通用标准，对各组给予253-304 kPa峰值的冲击压力，造成局部脑挫裂伤损伤，充分止血后，予以碘伏清洗伤口并缝合头皮。术后将SD大鼠放回鼠笼内复苏并注意预防术后伤口感染。实验过程中对出现自主呼吸暂停的大鼠，即刻采用小动物呼吸机给予面罩吸氧，对有攻击性行为的大鼠，发现后立即采取单笼饲养。本组动物在建模过程中死亡1只，将剩余54只纳入实验研究进行分组。

实验分组：54只大鼠颅脑创伤模型建立后，按随机数字表法分为对照组(颅脑损伤组)、骨髓间充质干细胞组及成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组(成纤维细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞组)，每组18只。对照组尾静脉注射1 mL的PBS，骨髓间充质干细胞组经尾静脉注射2.0×10⁹ L^-¹的骨髓间充质干细胞悬液1 mL，成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组经尾静脉注射2.0×10⁹ L^-¹的成纤维细胞生长因子修饰后的骨髓间充质干细胞悬液1 mL。

采用Western-Blot法检测成纤维细胞生长因子基因转染及胶质纤维酸性蛋白的表达情况：将对照组未分化的骨髓间充质干细胞悬液和经成纤维细胞生长因子基因转染后的骨髓间充质干细胞悬液分别经离心半径16 cm，离心速度800 r/min，离心5 min，收集细胞，弃去上清，加入1 μL的PMSF裂解液，摇匀置于冰上，裂解30 min，提取蛋白，稀释终浓度为0.5 g/L，Bradford法测定蛋白浓度。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，分别加入抗成纤维细胞生长因子抗体(鼠抗人，1∶1 000)及抗胶质纤维酸性蛋白(鼠抗人，1∶1 500)抗体内孵育，β-actin兔抗鼠多克隆抗体稀释溶于TBST中，37 ℃摇床孵育2 h，TBST的洗膜3次， 10 min/次，放入1∶500稀释的羊抗鼠生物素化二抗IgG抗体，37 ℃摇床孵育60 min。TBST洗膜5 min×4次。二甲基联苯胺(DAB)显色，重复3次。行Quantity one图像分析，以目的条带与β-actin条带吸光面积积分比值评定蛋白表达水平。

应用免疫组化检测BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脑内的分布及数量：移植后2周在每组随机各取大鼠5只，取脑组织，经心脏灌注40 g/L多聚甲醛，固定10 min，行常规冰冻切片，用二甲苯对石蜡切片进行脱蜡，用无水乙醇对石蜡切片进行梯度水化，蒸馏水清洗，PBS冲洗3 min，用体积分数3%过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次5 min/次，加热抗原修复 20 min，室温冷却后PBS冲洗3次5 min/次。免疫组化染色严格按BrdU说明书染色步骤操作，切片置于抗成纤维细胞生长因子抗体(鼠抗人，1∶1 000)及抗胶质纤维酸性蛋白(鼠抗人，1∶1 500)抗体内孵育，4 ℃湿盒过夜，PBS冲洗3次每次3 min，滴加与一抗相对应的羊抗鼠生物素化二抗IgG(1∶500)抗体，室温下孵育30 min。弃掉PBS，每张切片加入100 μL新鲜配制的DAB溶液，放置于显微镜下观察10 min至DAB显色呈鲜艳的棕黄色。利用蒸馏水彻底清洗3次2 min/次，切片风干，中性树脂封固终止反应。在高倍镜(×200)下每张切片上任取5个视野，应用荧光显微镜观察并计算每个视野的BrdU阳性细胞数，取其均值作为每组的BrdU阳性细胞数。

利用Longa评分法于移植后1 d、3 d、1周、2周对SD大鼠进行神经功能学评分：各组分别于移植后1 d、3 d、1周、2周对大鼠的神经学功能进行Longa评分。Longa评分标准：总分为5分，0分：无神经缺损症状；1分：左前肢不能完全伸直；2分：向左旋转；3分：向左侧倾倒；4分：不能行走或昏迷。所评的分值越高，表明神经功能缺损越严重。

TUNEL法检测脑组织细胞的凋亡情况：将石蜡切片脱腊后，用梯度乙醇水化，PBS清洗5 min，用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，用PBS清洗2次每次5min，用20 mg/L Proteinase K通透细胞15 min，PBS浸洗5 min，浸入40 g/L多聚甲醛固定5 min。加入100 μL的平衡液平衡10 min，于37 ℃下TUNEL混和液中反应60 min，PBS清洗3次5 min/次，加入DAB混合液避光显色，用苏木精复染后自来水冲洗，梯度乙醇脱水。二甲苯透明1 min×2次，中性树胶封固，拍照，显微镜观察凋亡细胞。

1.5 主要观察指标观察采用Western-Blot法检测成纤维细胞生长因子基因转染及胶质纤维酸性蛋白的表达情况；应用免疫组化检测BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脑内的分布及数量；利用Longa评分法于移植后1 d、3 d、1周、2周对大鼠进行神经功能学评分；TUNEL法检测脑组织细胞的凋亡情况。

1.6 统计学分析统计学处理采用SPSS 15.0统计软件进行完全随机设计的方差分析，数据以x(_)±s表示，两组之间的样本比较用Dunnett t 检验，以P < 0.05时为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤，虽然能促进受损脑组织自身内源性神经干细胞的增殖，但是细胞经体外长期培养后面临细胞衰老问题，大部分增殖的内源性细胞会在数天内凋亡，使其无法达到组织工程临床应用需要的细胞数量，对脑损伤后的神经功能恢复产生局限作用^[14-16]。因此获得稳定、大量纯化的具有骨髓基质干细胞生物学表型和功能的种子细胞一直都是研究者们关注的焦点^[17-22]。本研究采用成纤维细胞生长因子修饰骨髓间充质干细胞，期望通过此方式能够实现体外构建组织器官的目的，以促进颅脑损伤后的功能恢复^[23-29]。

实验中采用国内外广泛认可的液压冲击法建立大鼠颅脑创伤模型，建模后通过腺病毒载体介导成纤维细胞生长因子基因成功转染入骨髓间充质干细胞中后，利用Western-Blot法检测成纤维细胞生长因子基因转染及胶质纤维酸性蛋白的表达情况，结果显示成纤维细胞生长因子基因能够在骨髓间充质干细胞中表达，胶质纤维酸性蛋白在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组的表达明显高于对照组及骨髓间充质干细胞组，表明成纤维细胞生长因子基因能有效转染入骨髓间充质干细胞，转染后并能促进胶质纤维酸性蛋白的表达。通过对BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脑内的分布及数量进行检测，结果显示，BrdU标记的骨髓间充质干细胞在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组脑组织中的表达明显高于对照组及骨髓间充质干细胞组，表明骨髓间充质干细胞经成纤维细胞生长因子基因修饰后能更好的表达与受损脑组织中，发挥促进功能恢复的作用。

通过Longa行为学评分结果观察到，成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组大鼠的神经功能缺损评分明显低于对照组及骨髓间充质干细胞组，TUNEL法检测脑组织细胞的凋亡结果显示凋亡细胞数在成纤维细胞生长因子-骨髓间充质干细胞组明显减少，表明成纤维细胞生长因子基因修饰后的骨髓间充质干细胞移植到脑损伤大鼠中，对促进损伤后的神经功能恢复具有确切的疗效。王孝安等^[30]通过脑室内注射碱性成纤维细胞生长因子治疗大鼠创伤性脑损伤研究结果显示，碱性成纤维细胞生长因子有助于创伤性脑损伤大鼠内源性神经干细胞的增殖，并能促进其神经功能的恢复。王宁等^[31]利用骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑损伤，其结果显示，骨髓间充质干细胞能够很好的存活于受损的大鼠脑中，且移植了骨髓间充质干细胞组的神经功能改善要明显优于未移植组。

本文将成纤维细胞生长因子基因成功转入骨髓间充质干细胞，更好的促进骨髓间充质干细胞获得稳定的具有骨髓基质生物学表型和功能的干细胞，促使其更好的增强自身内源性神经干细胞的增殖功能，使神经功能的恢复取得理想效果。

综上所述，骨髓间充质干细胞虽然能促进神经再生，本实验也证明了此观点，但因治疗方式局限，并未取得较好的疗效，应用单纯的骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤还远不能达到治疗和改善病情的目的^[32-40]，本实验通过成纤维细胞生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞只是促进骨髓间充质干细胞达到组织工程临床需要应用量的方法之一，可能还会有更多较为有效的的方式促进骨髓间充质干细胞达到预期效果，使其获得细胞的永生化。其他有效方法有待进一步深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程