人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞增殖特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞具有向炎症损伤部位和肿瘤组织特异性趋化的特性，深入研究间充质干细胞对肿瘤细胞生长增殖的影响成为亟需解决的问题。
目的：探讨人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞增殖特性的影响。
方法：将不同细胞数的人脐带间充质干细胞或不同质量浓度的人脐带间充质干细胞条件培养基与宫颈癌Hela细胞共培养3 d，CCK-8检测Hela细胞的增殖抑制情况。
结果与结论：Hela细胞与人脐带间充质干细胞比例分别为1︰3、1︰2、1︰1、2︰1、4︰1、8︰1的情况下，相对应的细胞增殖抑制率分别为67.12%、47.18%、31.15%、27.61%、15.55%、15.95%；利用5，10，20，40，60，100 mg/L人脐带间充质干细胞条件培养基对Hela细胞进行培养，相对应的细胞增殖抑制率分别为0.61%、40.1%、63.47%、80.61%、93.56%、90.65%，说明人脐带间充质干细胞和条件培养基呈一定的浓度依赖性抑制Hela细胞的增殖。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 宫颈癌, 人脐带间充质干细胞, Hela细胞, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have the specific chemotaxis to the inflammation and tumor tissue, but the effect of mesenchymal stem cells on the growth of cervical cancer cells becomes an urgent problem.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the proliferation of cervical cancer Hela cells.
METHODS: Hela cells were co-cultured with human umbilical cord mesenchymal stem cells at different number or its conditioned medium at different concentrations for 3 days. Then, cell counting kit-8 was used to detect the proliferation of Hela cells.
RESULTS AND CONCLUSION: When Hela cells were co-cultured with human umbilical cord mesenchymal stem cells at ratios of 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, the relative proliferation inhibition rates were 67.12%, 47.18%, 31.15%, 27.61%, 15.55% and 15.95%, respectively. When the Hela cells were co-cultured with human umbilical cord mesenchymal stem cell conditioned medium at 5, 10, 20, 40, 60, 100 mg/L, the relative proliferation inhibition rates were 0.61%, 40.1%, 63.47%, 80.61%, 93.56%, 90.65%, respectively. These findings indicate that the proliferation of Hela cells can be inhibited by co-culture with human umbilical cord mesenchymal stem cells at a certain concentration-dependent manner.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Uterine Cervical Neoplasms, Hela Cells, Tissue Engineering

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图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计体外观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年4至6月在沧州市中心医院完成。

1.3 材料人宫颈癌Hela细胞株由沧州市中心医院实验室提供。经产妇及家属知情同意，采集足月剖宫产健康婴儿脐带组织。

人脐带间充质干细胞影响宫颈癌Hela细胞生物学特性实验所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
细胞培养板	上海弘顺生物科技有限公司
细胞培养瓶	上海翊圣生物科技有限公司
DMEM培养基	上海复申生物科技有限公司
胎牛血清	上海远慕生物科技有限公司
L-谷氨酰胺	上海弘顺生物科技有限公司
胰蛋白酶	上海斯丹赛(干细胞)生物技术有限公司
鼠抗人直标单克隆抗体	北京冬歌博业生物科技有限公司
CCK-8	北京柏莱斯特科技发展有限公司
丝裂霉素 C	江苏希望生物科技有限公司
顺铂	北京满仓科技有限公司
流式细胞仪	北京四正柏生物科技有限公司
青霉素	北京瑞科中仪科技有限公司
链霉素	天津泰科嘉华金属贸易有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养在超净工作台中利用止血钳将脐带标本夹出，置于添加青霉素、链霉素、DPBS的培养皿中，剪成15 cm左右长的片段，用DPBS冲洗，胰蛋白酶消化30 min。消化结束之后利用移液枪将细胞转移至离心管中，添加15倍体积DPBS之后进行离心， 1 000 r/min离心3 min，弃上清，用DPBS进行清洗，收集细胞，加入含体积分数为15%血清的DMEM/F12培养液进行培养。细胞长到80%融合时，胰蛋白酶消化，置于镜下进行观察，如果胞质发生回缩，添加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，加入到离心管中，1 000 r/min离心3 min后去掉上清，添加DMEM/F12培养基进行细胞重悬，按照1︰1进行传代培养。

1.4.2 人脐带间充质干细胞鉴定应用流式细胞仪对第3，4代细胞进行表型检测。取对数生长期细胞，细胞分离液消化，PBS清洗细胞3次。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记CD29、CD34、CD44、CD45R抗体，混匀室温放置 20 min，加入2 mL PBS，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入300 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

1.4.3 Hela细胞株培养将HeLa细胞在含体积分数为10%胎牛血清、100 mg/L链霉素以及100 U/mL青霉素的DMEM高糖培养基中进行培养。观察细胞生长情况，待融合度为80%-90%进行传代。吸去培养液，采用0.25% Trypsin-0.53 mmol/L EDTA洗1次，去除血清，以免抑制胰酶活性，添加2.0-3.0 mL Trypsin-EDTA，置于37 ℃培养箱内约5 min，至细胞全部脱落，添加6-8 mL完全培养液，利用移液器将细胞吹散，转移到新的培养瓶中，以1︰2- 1︰6比例传代为宜，每周传代两三次，选取第5代细胞进行研究。

1.4.4 脐带间充质干细胞对Hela细胞增殖的影响选取第5代脐带间充质干细胞，加入丝裂霉素C处理3 h，用DMEM培养基洗涤3次，然后将其与Hela细胞共同接种于96孔板，每孔接种Hela细胞5×10³个，按Hela细胞与人脐带间充质干细胞比例不同进行分组，分别为1︰3、1︰2、1︰1、2︰1、4︰1、8︰1组，同时设置单纯培养Hela细胞为对照组，连续培养3 d之后，利用CCK-8法检测细胞增殖抑制情况。细胞增殖抑制率(%)=[1-(共培养组-对照组)÷对照组]×100%。

1.4.5 脐带间充质干细胞条件培养基对Hela细胞增殖的影响将5×10³个Hela细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后用不同浓度的人脐带间充质干细胞条件培养基进行培养，培养基质量浓度分别为5，10，20，40，60，100 mg/L。同时，设置不加条件培养基的Hela细胞为对照组，添加顺铂为阳性对照组，培养72 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖抑制情况。细胞增殖抑制率(%)=(1-条件培养基组/对照组)×100%。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞形态及细胞表型表达。②人脐带间充质干细胞对Hela细胞增殖抑制作用。③人脐带间充质干细胞条件培养基对Hela细胞增殖抑制作用。

1.6 统计学分析数据均录入SPSS 19.0统计学软件，组间比较采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞是一群具有自我更新和多向分化潜能的细胞^[7-9]，在适当的情况下可以分化为人体各脏器细胞，修复受损脏器^[10]。

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，是由病毒感染而引发的癌症，对人体的危害极大^[11]。关于宫颈癌的具体发病机制，目前尚缺乏十分清楚的定论^[12-16]。以往大多采用常规化疗等方式对宫颈癌患者进行治疗，但大多无法获得理想的治疗效果^[17-18]。随着干细胞理论和相关技术的不断发展，为宫颈癌的治疗提供了新思路^[19]。

宋菁华等^[20]研究对人宫颈癌细胞中的侧群细胞进行富集和分选，通过研究发现，在人宫颈癌细胞中存在侧群细胞，且细胞存在外排Hoechst 33342荧光染料能力。对于不同分化程度的宫颈癌细胞而言，分化越差，相应的侧群细胞比例越低。通过对宫颈癌侧群细胞与非侧群细胞体外增生能力和裸鼠成瘤能力的比较也发现，前者显著强于后者，表明宫颈癌侧群细胞具备一定的肿瘤干细胞特性，可作为宫颈癌干细胞临床研究的重要切入点。对人脐带间充质干细胞而言，可以通过旁分泌机制调控细胞的生物学活性。而且，人脐带间充质干细胞还具有较强的黏附性，低密度培养时能够迅速贴壁，具有快速增殖能力，体外具有多向分化潜能^[21-23]。

本实验经流式细胞仪检测，细胞不表达造血细胞表面特异性标志CD34和CD45，但可以表达CD29、CD44，经传代培养，细胞形成典型的单层成纤维样细胞，获得了实验所需的人脐带间充质干细胞。进一步分析人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞的影响，实验利用丝裂霉素C对人脐带间充质干细胞进行处理，并与Hela细胞进行共培养 3 d，结果显示，Hela细胞与人脐带间充质干细胞比例分别为1︰3、1︰2、1︰1、2︰1、4︰1、8︰1的情况下，相对应的细胞增殖抑制率分别为67.12%、47.18%、31.15%、27.61%、15.55%(P < 0.05)、15.95%，说明随着人脐带间充质干细胞比例的增加，Hela细胞增殖明显下降，并呈一定的浓度依赖性。利用5，10，20，40，60，100 mg/L人脐带间充质干细胞条件培养基对Hela细胞进行培养，相对应的细胞增殖抑制率分别为0.61%、40.1%、63.47%、80.61%、93.56%、90.65%，说明随着人脐带间充质干细胞条件培养基质量浓度的增加，Hela细胞增殖明显下降，并呈一定的浓度依赖性。分析出现这一结果的原因，可能是因为人脐带间充质干细胞可以分泌一定的生物活性因子，对肿瘤的细胞信号通路产生一定的影响，从而抑制肿瘤细胞增殖。另一方面，可能与细胞凋亡之间存在一定的联系^[24]。

对各种生物的生命活动而言，细胞凋亡与细胞和组织的基本特征等息息相关^[25-26]。人脐带间充质干细胞抑制肿瘤细胞增殖也可能是其对细胞周期产生抑制作用。另外，还可能是分泌的多种细胞因子间接杀伤肿瘤细胞，通过激活凋亡基因诱导肿瘤细胞凋亡，进而影响肿瘤细胞周期进程，抑制细胞增殖。赵雯红等^[27]利用转染白细胞介素12基因的人脐带间充质干细胞与卵巢癌细胞进行体外培养，分析细胞的体外增殖情况，并通过裸鼠体内移植以及移植瘤观察方式，了解人脐带间充质干细胞负载白细胞介素12重组腺病毒载体抗卵巢癌的作用。结果发现，转染白细胞介素12基因的人脐带间充质干细胞可以在蛋白以及mRNA水平上表达白细胞介素12，并抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而达到抑制裸鼠体内卵巢癌SKOV3移植瘤生长的效果。马懿等^[28]在体外条件下利用流式细胞技术分选ESA⁺CD44⁺CD24^-^/low细胞为乳腺癌干细胞，并通过软琼脂克隆实验对乳腺癌干细胞进行体外克隆培养，结果发现人脐带组织源间充质干细胞可以抑制乳腺癌干细胞增殖，且抑制作用呈现出剂量依赖性，分析原因可能是在体外和体内单独作用的条件下，人脐带组织源间充质干细胞均能够发挥出阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制PI3K和Akt蛋白激酶的活性，从而明显抑制乳腺癌干细胞的增殖。另外，还有学者通过研究发现，间充质干细胞对肿瘤细胞具有一定的趋化性^[29]，可以向肿瘤组织发生迁移，细胞迁移数量与肿瘤细胞数之间成正比关系。

综上所述，在体外环境下，人脐带间充质干细胞及其条件培养液可抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，其机制可能与细胞通路以及细胞凋亡等有关，为宫颈癌的治疗提供一定的参考依据，相关细节问题值得予以进一步分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程