不同生长因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型转化的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：关节软骨损伤后，自身修复能力十分有限，以往医学手段无法对其进行再生修复，利用干细胞治疗软骨损伤彻底扭转了这一局面。
目的：探讨不同生长因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型的转化机制。
方法：取第5代大鼠骨髓间充质干细胞，利用不同的生长因子及生长因子组合对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导，分别为TGF-β1组、TGF-β1+IGF-1组、BMP-2+IGF-1组、TGF-β1+BMP-2组、TGF-β1+IGF-1+BMP-2组、空白对照组。诱导后21 d进行阿尔新蓝染色和茜素红染色，RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达。
结果与结论：阿新蓝染色观察可见细胞胞浆与间质存在异染情况，蛋白多糖呈绿色表达，经茜素红染色未见橘红色钙结节。初步推断，骨髓间充质干细胞已分化形成软骨细胞，不表达骨细胞表型。空白对照组Ⅱ型胶原mRNA表达呈阴性。与TGF-β1组比较，BMP-2+IGF-1组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏低，TGF-β1+BMP-2组和TGF-β1+IGF-1+BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏高(P < 0.05)；且TGF-β1+IGF-1+BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于其他各组(P < 0.05)。结果表明，转化生长因子β1具备单独诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力，采用胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1在诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化时具有协同作用，可以发挥出最大的诱导软骨分化效应。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 软骨细胞, 骨髓间充质干细胞, 转化生长因子β1, 骨形态发生蛋白2, 诱导

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage is a highly differentiated tissue, which is very limited in its ability to repair after injury. Stem cell therapy for cartilage repair has completely solved this problem.

OBJECTIVE: To investigate the mechanism that different growth factors induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes.

METHODS: Passage 5 rat bone marrow mesenchymal stem cells were induced by different growth factors and their combinations, including transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) group, TGF-β1+insulin growth factor-1 (IGF-1) group, and bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)+IGF-1 group, TGF-β1+BMP-2 group, TGF-β1+IGF-1+ BMP-2 group, and blank control group. At 21 days of induction, cells were stained with alcian blue and alizarin red; RT-PCR was employed to detect collagen II mRNA expression.

RESULTS AND CONCLUSION: Alcian blue staining showed metachromasia in the cytoplasm and mesenchyma, and proteoglycan was expressed green; alizarin red staining showed no orange calcium nodules. The bone marrow mesenchymal stem cells were preliminarily deduced to differentiate into chondrocytes, but could not express the cell phenotypes of bone cells. In the blank control group, the expression of collagen II mRNA was negative. Compared with the TGF-β1 group, the mRNA expression of collagen II was lower in the BMP-2+IGF-1 group, but higher in the TGF-β1+BMP-2 group and TGF-β1+IGF-1+BMP-2 group (P < 0.05). Moreover, the expression of collagen II mRNA was highest in the TGF-β1+IGF-1+BMP-2 group (P < 0.05). These findings indicate that TGF-β1 alone is able to induce the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the combination of TGF-β1, IGF-1 and BMP-2 can play the biggest role to induce the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Chondrocytes, Transforming Growth Factor beta1, Insulin-Like Growth Factor I, Bone Morphogenetic Proteins, Tissue Engineering

王淑英，卢小兵，欧阳林. 不同生长因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型转化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7237-7241.

Wang Shu-ying, Lu Xiao-bing, Ouyang Lin. Chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by different growth factors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7237-7241.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Wu J, Wang F, Yang L, et al. Chondrocytic biomimetic matrix materials-induced differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocyte-like cells in vitro.Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2015;31(11): 1502-1505.

[2] Liu P, Sun L, Chen H, et al. Lentiviral-mediated multiple gene transfer to chondrocytes promotes chondrocyte differentiation and bone formation in rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Oncol Rep. 2015;34(5):2618-2626.

[3] Zhang X, Hirai M, Cantero S, et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 2011;112(4):1206-1218.

[4] Murphy MK, Huey DJ, Hu JC, et al. TGF-β1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 201533(3):762-773.

[5] Wang H, Li Y, Chen J, et al. Chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells induced by transforming growth factor beta3 gene in Diannan small-ear pigs.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2014;28(2):149-154.

[6] Wang F, Zhang YC, Zhou H, et al. Evaluation of in vitro and in vivo osteogenic differentiation of nano-hydroxyapatite/ chitosan/poly(lactide-co-glycolide) scaffolds with human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 2014;102(3):760-768.

[7] 甘凤英.生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向软骨分化的实验研究[D].福州:福建医科大学,2006.

[8] Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in different hydrogels: influence of collagen type II extracellular matrix on MSC chondrogenesis. Biotechnol Bioeng. 2006;93(6):1152-1163.

[9] 周瑜.慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的实验研究[D]. 青岛:青岛大学,2014.

[10] 周瑜,夏长所,王昌耀,等.慢病毒介导TGF-β3/BMP-2联合基因转染诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨细胞分化[J].中华临床医师杂志:电子版,2014,8(4):688-694.

[11] Dahlin RL, Meretoja VV, Ni M, et al. Chondrogenic phenotype of articular chondrocytes in monoculture and co-culture with mesenchymal stem cells in flow perfusion. Tissue Eng Part A. 2014;20(21-22):2883-2891.

[12] Liu S, Zhang E, Yang M, et al. Overexpression of Wnt11 promotes chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in synergism with TGF-β. Mol Cell Biochem. 2014;390(1-2):123-131.

[13] Moghadam FH, Tayebi T, Dehghan M, et al. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes after short term culture in alkaline medium. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res. 2014;8(4):12-19.

[14] 刘吉斌,侯连东,于强,等.骨膜复合骨髓间充质干细胞和软骨细胞体内移植修复软骨缺损[J].中国组织工程研究,2015,19(3): 364-369.

[15] Zhang Z, Wang Y, Li M, et al. Fibroblast growth factor 18 increases the trophic effects of bone marrow mesenchymal stem cells on chondrocytes isolated from late stage osteoarthritic patients. Stem Cells Int. 2014;2014:125683.

[16] Leyh M, Seitz A, Dürselen L, et al. Subchondral bone influences chondrogenic differentiation and collagen production of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and articular chondrocytes.Arthritis Res Ther. 2014;16(5):453.

[17] Wang J, Li J, Deng N, et al. Transfection of hBMP-2 into mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood and bone marrow induces cell differentiation into chondrocytes. Minerva Med. 2014;105(4):283-288.

[18] 陈伟,王丽娜,郝云甲,等.不同来源软骨细胞共培养对骨髓间充质干细胞早期分化的影响[J].中华老年医学杂志,2015,34(5): 557-560.

[19] 李斌,华永新,曲华正,等.软骨细胞和骨髓间充质干细胞相关基因转染的研究进展[J].医学与哲学,2014,35(24):58-61.

[20] 李斌,张伟,王健,等.体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞[J].中国矫形外科杂志,2009,17(23):1819-1822.

[21] Nixon AJ, Fortier LA, Williams J, et al. Enhanced repair of extensive articular defects by insulin-like growth factor-I-laden fibrin composites. J Orthop Res. 1999;17(4):475-487.

[22] Sekiya I, Larson BL, Vuoristo JT, et al. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 2005;320(2):269-276.

[23] Olmez U, Ryan LM, Kurup IV, et al. Insulin-like growth factor-1 suppresses pyrophosphate elaboration by transforming growth factor beta1-stimulated chondrocytes and cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 1994;2(3):149-154.

[24] Reyes R, Pec MK, Sánchez E, et al. Comparative, osteochondral defect repair: stem cells versus chondrocytes versus bone morphogenetic protein-2, solely or in combination Eur Cell Mater. 2013;25:351-365.

[25] Wu L, Leijten J, van Blitterswijk CA, et al. Fibroblast growth factor-1 is a mesenchymal stromal cell-secreted factor stimulating proliferation of osteoarthritic chondrocytes in co-culture. Stem Cells Dev. 2013;22(17):2356-2367.

[26] Sabatino MA, Santoro R, Gueven S, et al. Cartilage graft engineering by co-culturing primary human articular chondrocytes with human bone marrow stromal cells. J Tissue Eng Regen Med. 2012 Dec 6. [Epub ahead of print]

[27] Tang X, Sheng L, Xie F, et al. Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes using chondrocyte extract. Mol Med Rep. 2012;6(4):745-749.

[28] Liao X, Wu L, Fu M, et al. Chondrogenic phenotype differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by bone morphogenetic protein 2 under hypoxic microenvironment in vitro.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2012;26(6):743-748.

[29] Kocamaz E, Gok D, Cetinkaya A, et al. Implication of C-type natriuretic peptide-3 signaling in glycosaminoglycan synthesis and chondrocyte hypertrophy during TGF-β1 induced chondrogenic differentiation of chicken bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Mol Histol. 2012;43(5):497-508.

[30] 冯万文,夏亚一,孙正义,等.骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养复合同种异体脱钙骨基质修复关节软骨全层缺损[J].第四军医大学学报,2006,27(18):1683-1686.

[31] 张文元,杨亚冬,房国坚,等.大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化[J].中国现代医学杂志,2006, 16(9):1306-1309.

[32] Gronthos S, McCarty R, Mrozik K, et al. Heat shock protein-90 beta is expressed at the surface of multipotential mesenchymal precursor cells: generation of a novel monoclonal antibody, STRO-4, with specificity for mesenchymal precursor cells from human and ovine tissues. Stem Cells Dev. 2009;18(9):1253-1262.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年4月至2015年6月在乌兰察布医学高等专科学校实验室完成。

1.3 实验动物和材料 SD大鼠10只，3-8周龄，雌雄不限，体质量110-120 g，由山东群英医学研究有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养对大鼠予以氯胺酮腹腔注射麻醉后，无菌条件下取出股骨和胫骨，用无菌PBS冲出骨髓，充分混匀后，按1︰2比例缓慢加于相对密度为1.077的淋巴细胞分离液之上，2 000 r/min离心30 min，吸取液面交界处的单个核细胞。将上述细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清、青霉素、谷氨酰胺、链霉素的DMEM培养基中，置于体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱中进行

细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化实验所用主要试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
氯胺酮	通派(上海)生物科技有限公司
油红O	上海弘顺生物科技有限公司
DMEM培养基	广州市益满生物科技有限公司
茜素红	上海纪宁生物科研有限公司
转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)	上海瑞齐实业科技有限公司
骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins 2，BMP-2)	北京雅安达生物技术有限公司
胰岛素	上海慧颖生物科技有限公司
地塞米松	上海丰寿生物科技有限公司
胎牛血清	上海纪宁生物科技有限公司
EDTA	上海研域生物科技有限公司
电泳槽	南京森贝伽生物科技有限公司
PCR扩增仪	上海伟进生物科技有限公司
二甲基亚砜	上海复蒙基因生物科技有限公司
谷氨酰胺	上海比朗仪器制造有限公司
超净工作台	上海齐欣科学仪器有限公司
CO₂培养箱	上海善志仪器设备有限公司
青、链霉素	上海微蒙生物技术有限公司
台式离心机	北京博劢行仪器有限公司
倒置显微镜	北京北方利辉试验仪器设备有限公司
阿新蓝	上海万锐实验室设备有限公司
紫外投射反射仪	江苏同君仪器科技有限公司
稳压恒流电泳仪	上海万锐实验室设备有限公司

原代培养，培养3 d首次换液，以后每3 d换液1次，清除非贴壁细胞。倒置相差显微镜观察并记录细胞生长情况，待细胞80%融合后，用0.25%胰蛋白酶/0.02% EDTA消化传代。

1.4.2 实验分组和干预实验分为6组，利用不同的生长因子及生长因子组合对大鼠骨髓间充质干细胞进行诱导，各组干预情况见表1。取第5代细胞，调整细胞密度为1×10⁶个，接种于6孔培养板，培养24 h后，换成条件培养液进行诱导培养，条件培养液的成分为DMEM-HG培养基、地塞米松 10^-7 mmol/L、丙酮酸钠1 mmol/L、维生素C 37.5 mg/L、胰岛素6.25 μg/L、转铁蛋白6.25 μg/L、生长因子，置于体积分数为5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养，每3 d换液1次，每日观察细胞的生长情况。
1.4.3 细胞组织化学鉴定诱导21 d后，取出铺有细胞的玻片，行阿新蓝染色观察细胞合成蛋白多糖情况，判断骨髓间充质干细胞是否分化为软骨细胞，行茜素红染色观察是否有细胞外钙基质沉积。将细胞用PBS冲洗2遍，丙酮固定3 min，茜素红染液滴染5 min，蒸馏水冲洗3遍，显微镜下观察，拍照。1.4.4 RT-PCR检测细胞中Ⅱ型胶原mRNA表达诱导 21 d，收集各组细胞，提取总RNA，然后测定总RNA产量、纯度、完整性。使用Kit反转录合成第一链cDNA，对合成产物进行RT-PCR扩增，PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像软件分析系统分析，结果以Ⅱ型胶原基因积分吸光度与内参基因β-actin积分吸光度的比值表示。RT-PCR特异性引物序列见表2。
1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞形态。②细胞组织化学鉴定结果。③细胞Ⅱ型胶原mRNA表达。

1.6 统计学分析数据录入SPSS 19.0软件，计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着时代的发展，各种关节软骨损伤的发生率不断增加，严重危害到人体健康以及正常功能。软骨的作用是吸收加诸骨头的冲击力，若有损伤会产生痛感。软骨的修复能力较弱，一旦发生损伤很难恢复到原本的状态。关节软骨分化程度较高，临床修复治疗效果不理想。

随着干细胞理论及相关技术的不断发展，为关节软骨修复提供了新的可能^[7]。干细胞通过营养因子调节免疫功能和分化功能，可以实现软骨损伤的有效再生修复作用。骨髓来源间充质干细胞具有取材和操作简单等明显的优势，在临床治疗和各种实验研究中应用较为广泛^[8-9]。骨髓间充质干细胞在不同条件下可向不同方向分化^[10]，在定向分化过程中，诱导因子的作用十分重要^[11-14]。

TGF-β1是一种多肽，是重要的生长因子^[15]。TGF-β1参与各种生物学活动过程，能促进细胞增殖，调节细胞分化，包括向软骨细胞分化^[16-18]。骨髓间充质干细胞表面大量表达TGF-β1受体，从而介导TGF-β1诱导骨髓间充质干分化为软骨细胞^[19]。另外，TGF-β1还可以合成并分泌Ⅱ型胶原以及蛋白多糖，以维持稳定的软骨细胞表型^[20]。Nixon等^[21]通过研究发现，TGF-β1可以促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。

BMPs也是一种十分重要的生长因子，并包括多种类型，例如BMP-2、BMP-6等。Sekiya等^[22]通过研究发现，BMP-2促骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞的能力最强。另外，Olmez等^[23]还报道，在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中，TGF-β1与IGF-1可以发挥出一定的协同效应，促进软骨细胞外基质合成，并抑制TGF-β1引起的细胞内焦磷酸盐的积聚，从而避免出现焦磷酸钙结晶以及进一步成骨。本实验用到的诱导培养液中含有维生素C和胰岛素、转铁蛋白以及地塞米松。其中，维生素C是一种强效的抗氧化剂，可以有效减少细胞凋亡^[24]。在体外进行细胞培养过程中，需要为细胞提供所需的营养物质，以维持正常的细胞存活和有丝分裂等。地塞米松可以与细胞膜上的糖皮质激素受体结合，从而激活表面受体，促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化^[25-28]。另外，地塞米松还可以抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化^[29-31]。

Ⅱ型胶原是软骨组织细胞外基质中十分重要的物质，可以维持良好的软骨伸展性。Ⅱ型胶原含量的增加可以有效提高软骨的耐磨程度^[32]。Ⅱ型胶原也是十分重要的标志蛋白，可以通过其表达情况来了解软骨活性以及组织分化能力。本实验结果显示，诱导21 d后，阿新蓝染色观察可见细胞胞浆与间质存在异染情况，蛋白多糖呈绿色。茜素红染色之后未观察到有橘红色钙结节存在。结合上述实验结果进行初步推断，骨髓间充质干细胞已经分化形成软骨细胞，不表达骨细胞表型，具备分泌Ⅱ型胶原以及细胞外基质蛋白多糖等软骨细胞特异性物质的功能。利用不同生长因子组合诱导21 d之后，经RT-PCR检测可观察到Ⅱ型胶原mRNA表达。与TGF-β1组比较，BMP-2+IGF-1组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏低，TGF-β1+BMP-2组和TGF-β1+IGF-1+BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著偏高(P < 0.05)；且TGF-β1+IGF-1 + BMP-2组Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于其他各组(P < 0.05)。通过对结果的分析可以发现，在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中，TGF-β1是一种必需的生长因子，BMP-2具备诱导骨髓间充质干细胞合成软骨基质蛋白多糖的能力，但相对较弱，IGF-1促进骨髓间充质干细胞合成软骨基质蛋白多糖，但可能无促进合成Ⅱ型胶原的能力。

综上所述，TGF-β1具备单独诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力，IGF-1、BMP-2、TGF-β1在诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化时具有协同作用，可以发挥出最大的诱导软骨分化效应。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程