缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.003

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (45): 7230-7236.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.003

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缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化

郑跃，陈浩，沙卫红，王启仪，刘婉薇

广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080

收稿日期:2015-09-23 出版日期:2015-11-05 发布日期:2015-11-05
通讯作者: 刘婉薇，副主任医师，广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080
作者简介:郑跃，男，1981年生，汉族，广东省潮州市人，2009年南方医科大学毕业，主治医师，主要从事胃肠病的诊治及干细胞的基础及临床研究。并列第一作者：陈浩，博士，广东省人民医院消化内科，广东省医学科学院，广东省广州市 510080
基金资助:
国家自然科学基金项目(81300279)；中国博士后科学基金项目(2012M521579)；广东省自然科学基金项目(S2013040013549)；广东省医学科研基金项目(A2014020)；广东省科技计划项目(2015A020212029)

Bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with hypoxic activation enhances its effects on radiation-induced intestinal epithelial cell injury in vitro

Zheng Yuei, Chen Hao, Sha Wei-hong, Wang Qi-yi, Liu Wan-wei

Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Received:2015-09-23 Online:2015-11-05 Published:2015-11-05
Contact: Liu Wan-wei, Associate chief physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Zheng Yue, Attending physician, Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China Chen Hao, M.D., Department of Gastroenterology, Guangdong General Hospital and Guangdong Academy of Medical Science, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China Zheng Yue and Chen Hao contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81300279; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2012M521579; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2013040013549; the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2014020; the Scientific Plan Project of Guangdong Province, No. 2015A020212029

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞条件培养基含有丰富的间充质干细胞旁分泌物质，被认为是干细胞移植理想的替代方案。然而，正常状态的间充质干细胞条件培养基可能由于旁分泌活性不足，常无法有效修复损伤组织。
目的：观察缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CMHyp)对大鼠小肠隐窝上皮IEC-6细胞辐射损伤后增殖和凋亡的影响，并进一步探讨其修复小肠上皮细胞的旁分泌机制。
方法：IEC-6细胞接受10 Gy X射线照射后分别加入MSC-CMHyp、正常培养的骨髓间充质干细胞条件培养基(MSC-CMNor组)及DMEM-F12培养基(DMEM-F12组)培养。
结果与结论：锥虫蓝染色、流式细胞仪、Western blot检测结果显示，与DMEM-F12组相比，MSC-CMHyp组IEC-6细胞存活数和增殖率明显增加(P < 0.05)，凋亡率和凋亡相关因子Caspases-3/8表达明显下降(P < 0.05)，而MSC-CMNor组的各项指标与DMEM-F12组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。EILSA检测结果显示，与MSC-CMNor相比，MSC-CMHyp中血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、和白细胞介素10的含量明显升高(P < 0.05)。结果表明，缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基中细胞因子含量明显升高，显著促进辐射损伤IEC-6细胞的增殖，同时下调细胞凋亡信号，从而进一步促进损伤细胞的修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 条件培养基, 骨髓间充质干细胞, 旁分泌, 小肠损伤, 细胞治疗, 干细胞, 移植, 缺氧诱导, 小肠上皮细胞, 细胞因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Conditioned medium from mesenchymal stem cells (MSC-CM) that contains abundant MSCs paracrine substances may represent a promising alternative to MSCs transplantation. However, normal MSC-CM with insufficient paracrine ability is not effective for tissue damage repair.
OBJECTIVE: To investigate the effects of MSC-CM with (MSC-CMHyp) and without hypoxic activation (MSC-CMNor) on the proliferation and apoptosis of radiation-induced injured intestinal epithelial cells (IEC-6) and to further discuss the paracrine mechanisms.
METHODS: IEC-6 cells were exposed to 10 Gy irradiation and cultured in MSC-CMHyp, MSC-CMNor, and DMEM-F12 medium, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Findings from trypan blue staining, flow cytometry and western blot assay showed that, compared with the DMEM-F12 medium group, treatment with MSC-CMHyp significantly enhanced IEC-6 viability proliferation after radiation-induced injury, as well as significantly decreased cell apoptosis and expression of Caspases-3/8 (P < 0.05). However, there was no significant difference between the MSC-CMNor group and DMEM-F12 medium group (P > 0.05). On the other hand, the increased levels of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor-1, and interleukin-10 were detected in the MSC-CMHyp group compared to the MSC-CMNor group (P < 0.05). These results suggest that the MSC-CMHyp improves the viability and proliferative capacity of IEC-6 cells after radiation-induced injury via up-regulating secretion of cytokines and down-regulating apoptotic signaling.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Culture Media, Conditioned, Intestine, Small, Tissue Engineering

郑跃，陈浩，沙卫红，王启仪，刘婉薇. 缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(45): 7230-7236.

Zheng Yuei, Chen Hao, Sha Wei-hong, Wang Qi-yi, Liu Wan-wei. Bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with hypoxic activation enhances its effects on radiation-induced intestinal epithelial cell injury in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(45): 7230-7236.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2011年3月至2012年9月在中山大学北校区动物实验中心、中山大学孙逸仙纪念医院中心实验室及广东省人民医院(广东省医学科学院)中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：三四周龄雌性SD大鼠，体质量约100 g，用于获取骨髓间充质干细胞，均由中山大学北校区实验中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

细胞株：大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6，购于American Type Culture Collection (ATCC)。用于辐射损伤IEC-6模型的制备。

干细胞培养实验相关主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM-F12培养基、胎牛血清	美国Hycolne公司
TrypLEExpress胰酶替代物	美国Invitrogen公司
小鼠抗大鼠CD29，CD34，CD44，CD45，CD90-FITC单克隆抗体	美国Biolegend公司
5 ku离心超滤管	Millipore公司
锥虫蓝溶液	碧云天生物科技公司
Annexin V-FITC	美国Abcam公司
PI溶液	碧云天生物科技公司
ELISA检测试剂盒	美国Abcam公司

1.4 实验方法

骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定：参照本课题组既往文献报道^[12]，使用频繁换液法分离培养原代骨髓间充质干细胞。①原代分离：取SD大鼠颈椎脱臼处死，完整提取双侧胫骨和股骨，无菌条件下暴露骨髓腔。用5 mL注射器反复冲洗骨髓腔内细胞，再用含体积分数10%胎牛血清的完全培养基重新悬浮细胞收集于25 cm²的培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、湿度90%的细胞培养箱内培养，此细胞记为原代。②原代培养：4 h后首次全量更换培养液，随后3 d内每8 h全量更换1次，至原代的克隆集落长至约70%融合时(约3 d)，用性质温和的胰酶替代物常温消化，并收集原代分离后剩余的大鼠股骨和胫腓骨，钳碎后加入含体积分数为10%胎牛血清的完全培养基细胞培养箱孵育3 d，使用0.22 μm滤器过滤，此为原代和第1代细胞培养基。原代细胞1︰1传代，37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱继续培养，此为第1代。第2代以后细胞 1︰3传代，随后使用常规含体积分数为10%胎牛血清的培养基继续培养。③免疫表型鉴定：待骨髓间充质干细胞生长至第2代时，取部分细胞悬液与CD29，CD34，CD45，CD90单抗充分混匀，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪做细胞表型鉴定。

MSC-CM的制备：①缺氧诱导的间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^Hyp)的制备：取骨髓间充质干细胞移入低氧条件培养箱内培养，控制氧体积分数为0.5%，6 h后将培养基替换为无血清DMEM-F12培养基孵育，48 h后收集上清培养液，-20 ℃冷冻保存备用。此为MSC-CM^Hyp。②正常培养MSC-CM(MSC-CM^Nor)的制备：步骤同上，但未参与缺氧诱导。无血清DMEM-F12培养基孵育48 h后收集培养液，-20 ℃冷冻保存。

IEC-6的培养及辐射损伤IEC-6模型的制备：将小肠隐窝上皮细胞IEC-6种植于6孔板(8×10⁴/孔，Corning Incorporated)，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM- F12培养基后置于37 ℃、体积分数5%CO₂、湿度90%的细胞培养箱内。当融合度约70%时，根据既往文献^[13-14]以及预实验结果，采用PRIMUS直线加速器(X射线)以300 cGy/min的速率、10 Gy的剂量一次性照射，照射后将根据分组不同每孔加入2.5 mL不同类型条件培养基，每日换液1次。

实验分组：实验分4组，正常IEC-6培养组(Control group，Control组)：正常IEC-6细胞加入无血清DMEM-F12培养基；辐射损伤IEC-6培养组(Irradiated group，DMEM-F12组)：辐射损伤的IEC-6加入无血清DMEM-F12培养基；MSC-CM^Nor治疗组：辐射损伤的IEC-6加入MSC-CM^Nor条件培养基；MSC-CM^Hyp组：辐射损伤的IEC-6加入MSC-CM^Hyp条件培养基。

细胞存活数检测：以辐射损伤后第1，3，5，7天为计数点，取 9 滴细胞悬液移入EP管，加一滴体积分数0.4%锥虫蓝溶液，5 min内用血球计数板在光镜400倍视野下观察，死亡细胞被染成蓝色，存活细胞不着色，计数板计数四角4个大方格中的蓝染死亡细胞。

细胞增殖凋亡检测：辐射损伤后第1，3，5，7天，各组IEC-6细胞消化离心，用于检测IEC-6增殖改变时加入体积分数75%冻乙醇，过夜后采用流式细胞术(FCM)上机检测细胞周期变化；用于检测IEC-6凋亡改变时细胞悬液分别加入Annexin V-FITC和PI溶液，随即采用流式细胞术上机检测细胞Annexin V/PI 凋亡变化。细胞增殖率用细胞周期中S周期所占比率表示。细胞凋亡率用早期凋亡及晚期凋亡细胞所占细胞总数的比率来表示。

Western Blot检测半胱氨酸蛋白酶3/8(Caspases-3/8)的表达：获得的各组细胞分别提取总蛋白，取适量蛋白，98 ℃变性5 min，12%SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜。含体积分数5%脱脂奶粉的Tris缓冲液封闭1 h，分别加入Caspases-3/8一抗(1∶1 000，Santa Cruz)4 ℃过夜，二抗(1∶2 000，Sigma)孵育1 h，加入HRP化学发光底物，压胶片曝光。每组重复3次。

旁分泌因子水平检测：取MSC-CM^Hyp组和MSC-CM^Nor组上清液，应用ELISA检测试剂盒检测上清液中细胞因子肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB和白细胞介素10的含量。

1.5 主要观察指标各组细胞存活数，细胞增殖率，细胞凋亡率，Caspases-3/8的表达，旁分泌因子肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子BB和白细胞介素10的含量。

1.6 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，各组数据的比较正态分布者组间比较用单因素方差分析与t 检验，非正态分布者用非参数秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 间充质干细胞条件培养基是替代间充质干细胞移植的可行手段间充质干细胞移植对组织器官损伤的修复作用已在心肌梗死、急性肺损伤及肝衰竭等多种模型中得到了证实^[15-17]，是目前治疗组织损伤最具前景的治疗手段。然而，随着研究的进一步深入，间充质干细胞移植中存在的问题也逐步被认识。已有多个研究发现，正常培养的间充质干细胞有能力转化为兼具干细胞和癌症干细胞特性的细胞^[18-19]，提示移植入体的干细胞具有成瘤癌变的风险。其次，移植入体的初始干细胞定植率低^[20-21]，进一步分化成有特定功能的细胞比例则更低，且需要足够长的时间，明显地制约了其临床应用。

近年来大量的实验研究发现，MSC-CM可通过旁分泌机制产生多种旁分泌因子，这些旁分泌物质具有促进血管生成、抑制凋亡、增强细胞再生及抗炎等作用，从而促进多种组织器官的损伤修复^{[8, 22-23]}。间充质干细胞条件培养基可以从已经建立的细胞株中获取，并可提前大量制备，有效成分更高，且不存在干细胞移植中可能发生的定植率低、成瘤癌变及血管栓塞等问题。与间充质干细胞移植相比，富含旁分泌因子的干细胞条件培养基无疑是替代干细胞移植的一种可行手段。

3.2 不同状态的间充质干细胞条件培养基对辐射损伤IEC-6修复作用差异的原因正常状态的间充质干细胞条件培养基可能由于旁分泌活性不足，常无法有效修复损伤组织。然而，间充质干细胞是一种可塑性很强的多潜能干细胞，在诸如炎症因子、缺氧或者受损细胞的诱导激活下^[24-26]，能增强其多种生物学潜能。已有多项报道表明，缺氧状态可显著增强间充质干细胞的旁分泌活性^[9-11]。Wairiuko等体外缺氧应激状态能激活间充质干细胞的分泌活性, 显著促进血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的分泌^[9]；Weil等^[4]同样对间充质干细胞进行缺氧预处理后发现培养基中白细胞介素6，肝细胞生长因子及血管内皮生长因子释放明显增加。实验将缺氧诱导的间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^Hyp)和正常培养的间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^Nor)分别加入辐射损伤IEC-6培养基中，实验结果发现，与Control组及DMEM-F12组相比，MSC-CM^Hyp组能够显著增加辐射损伤IEC-6细胞的存活数和细胞增殖率，同时显著降低辐射损伤IEC-6的细胞凋亡率；而MSC-CM^Nor组中辐射损伤IEC-6细胞的存活数、细胞增殖率及细胞凋亡率与Control组及DMEM-F12组相比，差异无显著性意义。

实验进一步的检测发现，与MSC-CM^Nor组相比，MSC-CM^Hyp组中的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及白细胞介素10的含量明显升高。实验结果提示，不同状态的间充质干细胞条件培养基对辐射损伤IEC-6修复作用的这种差异，很可能是由于不同状态的骨髓间充质干细胞条件培养基所形成的旁分泌物质的活性不同所致。

3.3 缺氧诱导间充质干细胞条件培养基修复损伤IEC-6的作用机制实验结果发现，与MSC-CM^Nor组相比，MSC-CM^Hyp组中的血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及白细胞介素10的含量明显升高。既往研究表明，各种细胞因子包括肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及白细胞介素10在消化道黏膜屏障功能及肠道黏膜修复中起着重要修复作用，因此上述细胞因子浓度的升高可能进一步促进肠道黏膜损伤的修复^{[4, 27]}。有研究发现，血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子可促进大鼠肠道放射性损伤新生血管的形成，同时白细胞介素10可明显抑制肠道放射性损伤的炎症反应，进而促进恢复肠上皮细胞的完整性^[27]。Ozen等^[28]发现胰岛素样生长因子1可以减轻缺血再灌注所致的肠上皮细胞凋亡和黏膜损害；在氧化应激所致的肠黏膜上皮细胞的过度凋亡中，胰岛素样生长因子1也表现出较明显的抗凋亡作用而对肠上皮细胞具有保护作用^[29]。

肝细胞生长因子具有抑制细胞凋亡及促进新生血管形成的作用^[11]；而血小板源性生长因子BB是一种重要的促细胞生长和诱导细胞分化的因子，具有明显的促增殖作用^[30]。实验结果显示，MSC-CM^Hyp组中的生长因子肝细胞生长因子及血小板源性生长因子BB的含量与MSC-CM^Nor组相比差异无显著性意义，其含量并无明显增加，考虑其原因可能与缺氧诱导的浓度未能达到其有效刺激浓度有关，或者与培养时间较短，培养液中游离的肝细胞生长因子及血小板源性生长因子BB较少有关。尽管如此，MSC-CM分泌的肝细胞生长因子及血小板源性生长因子BB在辐射损伤IEC-6的修复过程中仍可能发挥一定的保护作用。

综上，与正常状态的骨髓间充质干细胞条件培养基相比，缺氧诱导的骨髓间充质干细胞条件培养基可显著促进辐射损伤IEC-6细胞的增殖，并抑制其凋亡，从而增强对辐射损伤IEC-6细胞的修复作用。实验为间充质干细胞条件培养基在小肠黏膜损伤的临床治疗提供了实验依据和理论基础，具有广阔的应用前景，但目前诸如有关间充质干细胞旁分泌因子对小肠上皮细胞增殖及抗凋亡作用的分子机制、间充质干细胞旁分泌修复小肠上皮细胞的关键因子鉴定等问题仍有待进一步地研究和阐明。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

缺氧诱导骨髓间充质干细胞条件培养基体外修复辐射损伤小肠上皮细胞变化

Bone marrow mesenchymal stem cell conditioned medium with hypoxic activation enhances its effects on radiation-induced intestinal epithelial cell injury in vitro

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