胰岛素样生长因子Ⅰ转染对脂肪干细胞TWEAK/Fn14信号通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.45.001

摘要/Abstract

摘要：

背景：胰岛素样生长因子Ⅰ具有诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的能力，通过基因转染的方式将胰岛素生长因子Ⅰ转染入脂肪干细胞或许能够更好的促进脂肪干细胞向软骨细胞分化。
目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因对脂肪间充质干细胞体外定向成软骨分化能力以及对TWEAK/Fn14信号通路的影响。
方法：构建慢病毒载体pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl基因并转染第3代人脂肪间充质干细胞，诱导细胞向软骨分化。同时将pLVX-IRES-ZsGreenl转染的脂肪间充质干细胞设为绿色荧光蛋白/脂肪间充质干细胞组，单纯脂肪间充质干细胞设为对照组。
结果与结论：与绿色荧光蛋白/脂肪间充质干细胞组和对照组相比，胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组细胞中TWEAK mRNA表达水平降低，而胰岛素样生长因子Ⅰ，Col2al和Sox9 mRNA的表达水平增加，Col2a1表达水平增加，基质金属蛋白酶3以及TWEAK的表达降低。提示pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl慢病毒转染脂肪间充质干细胞后可获得胰岛素样生长因子Ⅰ的高效表达，且能下调细胞TWEAK基因及蛋白表达，可促进体外培养的脂肪间充质干细胞转化为软骨细胞。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 胰岛素样生长因子Ⅰ, 脂肪间充质干细胞, 基因转染, TWEAK, Fn14, 细胞培养

Abstract:

BACKGROUND: Because insulin-like growth factor I has the ability to induce mesenchymal stem cells into chondrocytes, we hypothesized that the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells can be improved via insulin-like growth factor I transfection.

OBJECTIVE: To investigate the influence of insulin-like growth factor I transfection on chondrogenic potential of adipose-derived stem cells in vitro and tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)/fibroblast growth factor-inducible 14 (Fn14) signaling pathway.

METHODS: Recombinant lentivirus plasmid pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl was constructed and transferred into passage 3 adipose-derived stem cells, and then these stem cells were induced to differentiate into chondrocytes (experimental group 1). Meanwhile, the cells transfected with pLVX-IRES-ZsGreenl were taken as green fluorescent protein/adipose mesenchymal stem cell group (experimental group 2), and those with no transfection acted as control group.

RESULTS AND CONCLUSION: The mRNA expression of TWEAK was reduced in the experimental group 1 as compared with the other two groups, but the mRNA expressions of insulin-like growth factor I, Col2a1 and Sox9 were up-regulated in the experimental group 1. At the same time, the protein expression of matrix metalloproteinase-3 and TWEAK were down-regulated, while the protein expression of Col2a1 was increased in the insulin-like growth factor I-transfected cells in contrast to the cells modified with pLVX-IRES-ZsGreenl or with no transfection. These findings indicate that pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl transfection of adipose-derived stem cells results in a higher expression of insulin-like growth factor I, and down-regulates the expression of TWEAK mRNA and protein, which improves the differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Chondrocytes, Insulin-Like Growth Factor I, Transfection, Tissue Engineering

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图/表（结果） 7

2.1 pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl的鉴定结果重组pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl经限制性内切酶SpeⅠ和BamHⅠ双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳获得一长约 477 bp的基因片段和一长约11 085 bp基因片段，与理论值符合。质粒测序结果显示胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列未改变，可包装慢病毒。

2.2 pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl的转染效率荧光显微镜下可见pLvX-IGF-I-IRES-ZsGreen1转染293细胞后出现大量绿色荧光，提示转染成功。病毒梯度经计算为2×10¹¹ TU/L。慢病毒感染12 h，脂肪间充质干细胞即有荧光表达。

以病毒滴度=200时感染脂肪间充质干细胞48 h后，绿色荧光蛋白的表达率为83.2%(图2)，说明重组慢病毒载体能够有效感染第3代脂肪间充质干细胞，转导目的基因进入人脂肪间充质干细胞内。

2.3 胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞生长速度减慢并且较多细胞出现皱缩，细胞间隙明显加大并有细胞凋亡，较多圆形细胞呈半悬浮状态。48 h后贴壁细胞开始生长且细胞形态呈圆形，细胞膜向周围呈放射状改变，另外中间还有其他三角形及多边形出现。伴随培养时间延长，细胞增殖速度明显加快，软骨细胞数也逐渐增多。而对照组在低糖培养基中培养的细胞则在24 h内就已贴壁、生长迅速，细胞形态一直呈梭形。

培养21 d后，甲苯胺蓝染色可见胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组细胞的胞膜及胞浆均呈蓝色，而未诱导分化的细胞基质染色为阴性(图3)。

2.4 Ⅱ型胶原的表达培养21 d后，免疫组织化学染色可见胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞胞浆中出现Ⅱ型胶原(图4)，而未诱导分化的细胞未见。

2.5 胰岛素样生长因子Ⅰ，Ⅱ型胶原(Col2a1)，Sox9和TWEAK mRNA的表达反转录PCR检测结果显示，培养3周后，胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组细胞中Col2al，Sox9和胰岛素样生长因子Ⅰ的mRNA水平较对照组上调(P < 0.05)，而TWEAK mRNA的表达下降(P < 0.05；图5)。

2.6 Col2a1，基质金属蛋白酶3及TWEAK的表达转染21 d后，胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组细胞中Col2a1表达水平上调(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3以及TWEAK的表达降低(P < 0.05；图6)。

2.7 生长曲线 MTT结果显示，胰岛素样生长因子Ⅰ转染细胞培养约5 d后，进入对数生长期，7或8 d就能达到细胞基本融合(图7)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学观察。

1.2 时间及地点实验于2008年12月至2010年12月在同济大学医学院干细胞实验室完成。

1.3 材料

胰岛素样生长因子Ⅰ转染脂肪干细胞实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
PBS	Gibco公司
DMEM低糖培养基	Hyclone公司
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒	武汉博士德生物工程公司
小鼠抗人Ⅱ型胶原单克隆抗体，兔抗人基质金属蛋白酶3单克隆抗体，兔抗人TWEAK单克隆抗体	BI00公司
鼠抗人β-actin单克隆抗体	Santacruz公司
慢病毒载体系统(含pLVX-IRES-ZsGreenl，psPAX2和pMD2G)	Invitrogen公司
恒温二氧化碳培养箱	Thermo公司
酶联免疫测定仪	Bio-rad公司
流式细胞仪	Becton Dickenson公司
倒置相差显微镜，荧光显微镜	AMG公司
凝胶成像系统	UVP公司

脂肪组织来自于上海同济大学附属同济医院行膝关节镜手术的8例男性患者的髌下脂肪垫，年龄19-53岁，均告知实验方案并签署知情同意书，已获得同济大学附属同济医院医学伦理委员会批准。脂肪干细胞的提取及传代培养参照文献[7]进行。实验使用第3代人脂肪干细胞。

1.4 方法

1.4.1 pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl的构建与鉴定胰岛素样生长因子基因由北京义翘神州生物技术有限公司合成，长度约为477 bp，根据GenBank人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的编码区其设计引物：上游引物：5’-GCC TCG AGG AAG ATG CAC ACC ATG TCC T-3’，下游引物：5’-GCG AAT TCC TAC ATC CTG TAG TTC TTG TTT C-3’。

慢病毒载体质粒包装由深圳百多威生物公司完成。将载体质粒pLVX-IRES-ZsGreenl(图1)和胰岛素样生长因子Ⅰ基因经限制性内切酶SpeⅠ和BamHⅠ 37 ℃酶切1 h。取1.5 μL酶切好的质粒DNA，与3.55 μL酶切好的片段，加入55 μL连接剂KOD聚合酶，16 ℃连接30 min。产物转化感受态细胞DH5a，用含20 mmol/L MgSO₄和Amp抗性的SOB琼脂培养基与转化的感受态细胞DH5a共培养至液体吸收，平皿倒置，37 ℃过夜。提取细胞，快速抽提少量质粒DNA，用SpeⅠ和BamHⅠ双酶切后行电泳检测，并进行测序分析。测序正确后，命名为PLVX-IRES-IGF-I- ZsGREENⅠ。

1.4.2 含胰岛素样生长因子Ⅰ基因表达的慢病毒载体的包装与病毒滴度的测定接种293 T细胞，每个培养瓶内9×10⁶-10×10⁷个细胞，细胞贴壁达80%-90%后，用重组慢病毒载体包装系统共转染293T细胞。该慢病毒载体的3种质粒成分pMD2G，pLVX-IRES-IGF-I-ZsGREENⅠ和psPAX2的浓度比例为2∶1∶1。收集病毒上清液，0.45 μm滤器过滤，于40 mL超速离心管中，在4 ℃以及72 000 r/min的条件离心120 min。然后重悬病毒沉淀，置于4 ℃冰箱保存。同时将空质粒共转染293T细胞后收集上清，然后浓缩，两种细胞备用于后续实验对照。

病毒滴度测定：12孔板每孔3×10⁵用于计数293T细胞。12孔板中置入5 μL病毒上清液，摇匀。48 h后用荧光显微镜下观察其滴度。

病毒滴度(TU/mL)=绿色荧光蛋白阳性细胞率×细胞总数/(慢病毒液体积×慢病毒液稀释倍数)。

1.4.3 pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl转染人脂肪间充质干细胞先用慢病毒载体pLVX-IGF-I-IRES-ZsGreenl转染体外培养第3代脂肪间充质干细胞，胰酶消化，1 000 r/min离心10 min，PBS重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁹ L^-¹，分装，利用绿色荧光蛋白在荧光照射下发出绿色荧光的原理将胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞从脂肪间充质干细胞中分离出来，计算转染效率。

将胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞作为胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组，将空质粒转染的脂肪间充质干细胞作为绿色荧光蛋白/脂肪间充质干细胞组，将未转染的脂肪间充质干细胞作为对照组。

1.4.4 脂肪间充质干细胞的诱导分化将筛选出的胰岛素样生长因子Ⅰ转染的脂肪间充质干细胞进行扩大培养，待细胞铺满培养皿约80%时，更换含高糖DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、6.25 mg/L胰岛素、6.25 mg/L转铁蛋白、1×10^-⁷ mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C)，每两三天更换培养基。观察细胞的形态变化与生长情况。

1.4.5 甲苯胺蓝和阿尔新蓝染色经胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染的脂肪干细胞在高糖DMEM中培养21 d后，取出细胞，PBS漂洗后用40 g/L多聚甲醛固定30 min，蒸馏水冲洗10 min，PBS漂洗，蒸馏水冲洗，置于0.14%甲苯胺蓝溶液中反应5 min，蒸馏水冲洗，体积分数0.02%的冰醋酸反应1 min，干燥，封固，光学显微镜下观察。

将细胞置于0.5%阿尔新蓝溶液(pH 1.0)染色10 min，蒸馏水冲洗，干燥，封固，光学显微镜下观察。

1.4.6 免疫细胞化学染色经胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染的脂肪干细胞在高糖DMEM中培养21 d后，从6孔培养板内取出细胞爬片，行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色。

1.4.7 反转录PCR 3组细胞培养21 d后，提取总RNA。根据Premier5.0软件设计引物，使用BLAST软件进行检测验证，由上海生工合成。

引物序列：
引物名称	引物序列	产物长度(bp)
胰岛素样生长因子Ⅰ	上游：5’-GCC TCG AGG AAG ATG CAC ACC ATG TCC T-3’ 下游：5’-GCG AAT TCC TAC ATC CTG TAG TTC TTG TTT C-3’	477
Sox9	上游：5’-CGG AAC AGA CTC ACA TCT CTC CTA ATG C-3’ 下游：5’-CGA AGG TCT CAA TGT TGG AGA TGA CGT C-3’	292
TWEAK	上游：5’-CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA-3’ 下游：5’-AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA-3’	345
Co12a1	上游：5’-CAA GTC GCT GAA CAA CCA GA-3’ 下游：5’-GCC CTC ATC TCC ACA TCA TT 3’	320
β-actin	上游：5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA C-3' 下游：5’-TGG AAG GTG GAC AGT GAG-3’	201

进行PCR操作，电泳结果通过凝胶成像系统观察，Bandscan5.0凝胶图像分析软件测定扩增产物的吸光度值。以与β-actin的吸光度比值作为目的基因表达水平。

1.4.8 Western-blot检测检测3组细胞在高糖DMEM培养基中培养21 d时前Ⅱ型胶原Col2a1，TWEAK以及基质金属蛋白酶3的表达水平。

1.4.9 生长曲线取各组转染后第3代脂肪间充质干细胞，以含体积分数10%新生牛血清的低糖DMEM重悬，细胞计数板计数，以6×10⁶ L^-¹的细胞浓度接种于96孔板内，每孔200 μL，置于37 ℃，体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中培养。于每天相同时间随机抽取6孔，加入5%MTT 20 μL，培养4 h，吸出培养板中液体，再于每孔加150 μL DMSO，震荡10 min，酶联免疫测定仪测定 490 nm处的吸光度，结果取平均值，绘制生长曲线。

1.5 结局观察指标慢病毒的转染效率，间充质干细胞向软骨细胞分化时形态的变化，培养21 d相关基因与蛋白的表达变化。

1.6 统计学分析使用SPSS 17.0统计软件建立数据库，数据以x(_)±s表示，两组间样本用双侧t 检验，多组间样本用多个样本均数的多重比较(SNK-q 方法)，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

胰岛素样生长因子Ⅰ在发育中软骨、成熟软骨甚至关节腔滑液中均有表达，作为一种强效合成代谢生长因子，主要通过细胞表面的受体的激活去调节细胞功能^[8]，其能促进软骨细胞的增殖及细胞外基质合成，又可通过抑制蛋白酶如基质金属蛋白酶等生成与释放而减少蛋白多糖降解，减少因胶原酶引起的透明软骨细胞的凋亡^[9-10]。

Fortier等^[11]发现胰岛素样生长因子Ⅰ能降低关节软骨细胞的小G蛋白Cdc42的活性以及基因表达，并且能够增加Ⅱ型胶原蛋白的mRNA的表达，同时能够减少基质金属蛋白酶3的基因表达，认为胰岛素样生长因子Ⅰ是维护关节软骨细胞表型表达以及关节软骨细胞合成代谢的最重要的细胞因子。

胰岛素样生长因子Ⅰ在软骨组织工程中发挥重要作用，其促进细胞DNA合成，增加诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的能力，并可以加快软骨细胞增殖和成熟以及细胞外基质蛋白多糖合成，从而有利于软骨发生^[12]。Gomez等^[13]在不同的软骨组织工程支架培养体系中发现，胰岛素样生长因子Ⅰ能在软骨生长的任何阶段都可以检测到，认为胰岛素样生长因子Ⅰ是一种重要的软骨增殖细胞因子。Goodrich等^[14]认为胰岛素样生长因子Ⅰ的转基因治疗可以增加软组基质如Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖的产量，提高软骨细挂增殖和体外存活，他们将腺病毒转染的马的胰岛素样生长因子Ⅰ转入马的软骨细胞来修补股骨滑车髌股关节面上的15 mm的软骨缺损，发现转基因的乳骨细胞的胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白的mRNA的表达增加很高，并且治疗组修复效果明显提升。

另外胰岛素样生长因子Ⅰ已被证实在体外细胞培养中对软骨细胞凋亡有明显的保护作用，并且在体内实验中也具有抑制软骨细胞凋亡的功能^[15]。Higgins等^[16]利用关节内给药胰岛素样生长因子Ⅰ来研究创伤后关节软骨凋亡的对照试验中发现，胰岛素样生长因子Ⅰ具有较强的抑制软骨细胞凋亡的作用。

TWEAK及其受体Fnl4存在于人体中的任何组织中，能够调节多重细胞反应。包括血管发生、诱导炎性因子、调节细胞的发生与凋亡以及在类风湿关节炎中增加骨与软骨约退变等^[17-21]。而且TWEAK-Fn14信号通路的活化能够促进核因子κB以及OPG-RNAKL-RANK信号通路的激活或活化^[22-23]。

Wako等^[24]证实鼠类椎间盘组织中存在TWEAK以及Fnl4，认为TWEAK能够上调椎间盘组织的基质金属蛋白酶3基因表达，并诱导椎间盘细胞产生基质金属蛋白酶3，组织椎间盘的培养中如果引入TWEAK将导致间盘的降解，并认为其机制是TWEAK通过磷酸化JNK或者活化核因子κB信号通路，使基质金属蛋白酶3或单核趋化蛋白1的生成增加并最终导致椎间盘基质的分解，认为基质金属蛋白酶3是造成椎间盘组织中的蛋白多糖降解和椎间盘退变的重要因素^[25]。TWEAK还能与肿瘤坏死因子α以及白细胞介素1β协同诱导成纤维样滑膜细胞合成分泌基质金属蛋白酶3骨与软骨的破坏^[26]。

本实验中，转染组细胞的细胞基质、细胞胞浆和胞膜中经阿尔新蓝以及甲苯胺蓝染色后，都能发现蓝色异染颗粒存在，表明了细胞分泌蛋白多糖存在于细胞内外，这也可以作为脂肪间充质干细胞向软骨细胞的转化的间接证明；同时，胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组行Ⅱ型胶原蛋白的免疫细胞组织化学染色呈阳性，证实胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰后的脂肪间充质干细胞己开始分化成软骨细胞。此外，胰岛素样生长因子Ⅰ能诱导间充质干细胞的分化与增殖，促进软骨细胞转录因子Sox9的表达及Col2a1的形成，在本试验中，脂肪间充质干细胞经胰岛素样生长因子Ⅰ基因修饰后胰岛素样生长因子Ⅰ、Col2a1，Sox9的mRNA均有高稳定性表达，Westen-blot显示Co12a1的蛋白表达结果也明显高于对照组，TWEAK以及基质金属蛋白酶3的表达明显低于对照组，因而我们推测胰岛素样生长因子Ⅰ/脂肪间充质干细胞组的这些变化是由于mRNA水平上胰岛素样生长因子Ⅰ转染后的脂肪间充质干细胞的 Coc2al和Sx9的表达上调有关。

另外认为胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染后能够下调基质金属蛋白酶3的表达^[27]， TWEAK-Fn 14信号通路中的TWEAK基因下调或许是其中的一个原因，认为有可能是胰岛素样生长因子Ⅰ的高表达反馈抑制了TWEAK的表达，因为TWEAK基因的过度表达能够激活核因子κB细胞通路以及OPG-RANK-RANKL细胞通路，从而引起一系列的炎症反应^[28-29]。

综上所述，利用基因转染载体将胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染脂肪间充质干细胞的体外诱导成软骨能力的实验表明，将编码胰岛素样生长因子Ⅰ目的基因导入脂肪间充质干细胞后，可以获得转染细胞胰岛素样生长因子Ⅰ的高表达，并能促进脂肪间充质干细胞向软骨细胞的转化，并且可以下调基质金属酶以及炎症信号通路重要因子TWEAK的表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程