脱细胞真皮基质修复猪胆管缺损：促进血管及胆管上皮再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：脱细胞真皮基质是无细胞的天然组织支架，与人体软组织十分相近，易于塑形，无毒副作用，已被用于修补尿道与输尿管。
目的：观察脱细胞基质修补胆管损伤的效果。
方法：将30头滇南小耳猪随机均分为3组，空白对照组切断胆管后行端端吻合，实验组人为制作胆管缺损后以脱细胞真皮基质修补，对照组人为制作胆管缺损后以膨体聚四氟乙烯修补。修补后6，24周取胆管补片及其周围组织，进行免疫组织化学与RT-PCR检测。
结果与结论：免疫组织化学显示，实验组细胞角蛋白表达高于空白对照组与对照组，转化生长因子β1表达低于空白对照组与对照组。术后24周内RT-PCR检测显示，实验组总体转化生长因子β1基因表达低于空白对照组与对照组(P < 0.05)，总体胰岛素样生长因子2基因表达高于空白对照组(P < 0.05)，总体血管内皮生长因子基因表达高于空白对照组与对照组(P < 0.05)。表明脱细胞基质修复胆道损伤可促进血管及胆管上皮的再生，并且不增加瘢痕的形成。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 脱细胞基质, 胆管损伤, 胰岛素样生长因子2, 血管内皮生长因子A, 转化生长因子β1

Abstract:

BACKGROUND: Acellular dermal matrix is a cell-free natural tissue scaffold similar to human soft tissue, which is easy to shape and has non-toxic side effects. It has been used to repair the urethra and ureter.
OBJECTIVE: To investigate the effect of acellular dermal matrix on the repair of bile duct injury.
METHODS: Thirty Diannan miniature pigs were randomly divided into three groups: in blank group, the bile duct was resected followed by end to end anastomosis; in experimental group, bile duct defect model was made followed by repair with acellular dermal matrix; in control group, bile duct defect model was made followed by repair with expanded polytetrafluoroethylene. At 6 and 24 weeks after repair, bile duct patches and surrounding tissues were taken for immunohistochemical observation and RT-PCR detection.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control and blank group, the expression of cytokeratin was higher, but the expression of transforming growth factor β1 was lower in the experimental group. Within 24 weeks after repair, the total mRNA level of transforming growth factor β1 was lower in the experimental group than the other two groups (P < 0.05), but the total mRNA levels of insulin-like growth factor 2 and vascular endothelial growth factor were higher in the experimental group (P < 0.05). These findings indicate that the acellular dermal matrix for repair of bile duct injury can promote angiogenesis and bile duct epithelial regeneration, but not increase the formation of scars.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bile Ducts, Insulin-Like Growth Factor II, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

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图/表（结果） 8

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。

1.2 时间及地点实验于2007年1月至2009年4月在昆明医学院完成。

1.3 材料

实验动物：8-11月龄滇南小耳猪30头，体质量15-20 kg，雌雄不拘，由昆明医学院动物科提供，动物许可证号SYXK(滇)2005-0004。将30头小耳猪随机均分为实验组、对照组与空白对照组3组。

胆管缺损修复实验的材料、试剂与仪器：
材料、试剂与仪器	来源
脱细胞真皮基质补片	北京清源伟业生物科技公司
膨体聚四氟乙烯补片(Gore-Tex人造血管)	美国W.L.Gore Associates公司
二抗MaxVision ^TM HRP-Polymer anti- Rabbit IHC Kit免疫试剂盒、第一抗体(CK19，转化生长因子ß1抗体)兔抗人	福州迈新生物技术开发有限公司
iQ5 Real Time PCR Detection System	Bio-Rad
All-in-One™ First-Strand cDNA Synthesis Kit	Cat.No. AORT-0050
All-in-One^TM qPCR Mix：GeneCopoeia	Cat.No. AOPR-0200
All-in-One^TM qPCR Primer	GeneCopoeia

1.4 实验方法

猪胆道缺损模型的建立：30只滇南小耳猪于术前12 h禁食，3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)耳缘静脉缓慢注射麻醉， 5 min后麻醉显效，呼吸平稳，根据术中情况给予肌肉注射安定5-10 mg。备皮(一次性备皮刀剔除胸部及整个腹部的毛)后抬入手术室，将其平放于手术台上，仰卧位后绷带固定四肢。头偏向一侧，在口腔中塞一牙垫，将舌牵出后用胶布固定，防止舌后坠及发生窒息。使用医用碘伏消毒手术区域皮肤，上起胸部，下至脐下5 cm，两侧至腋中线。取上腹部小人字形切口，长度约10 cm，并逐层切开皮肤、皮下组织、肌层及腹膜，进腹，电凝止血。小心向上拉开猪右半肝即可见到胆囊为肝内型，胆囊管细长，长约5 cm，将十二指肠向下牵拉，显露第一肝门，见胆总管为浅蓝色，位于第一肝门右前侧，外径为0.4-0.6 cm。以4号穿刺针于胆总管前壁进行试穿，顺利抽出金黄色胆汁确定为胆管，实验组与对照组于胆总管下段横断胆总管，使其缺损长度约为1.5 cm，实验组采用脱细胞真皮基质补片修复，对照组采用膨体聚四氟乙烯补片修复，空白对照组于胆囊管下约2 cm横断胆管行端端连续吻合。吻合完成后仔细检察腹腔，用干净湿纱布蘸干术区，确认无胆漏及活动出血后逐层关腹。逐层缝合腹部切口并再次消毒，送入动物科猪饲养室，24 h后正常饲养。

术后动物存活超过2周，无发热，皮肤、巩膜无黄染，进食良好，精神状态良好，尿便正常，切口无感染，则视为手术成功，符合实验要求。

标本的采集：术后6，24周每组处死4头猪，切取吻合口周围约1.0 cm胆管组织及相应的补片，用体积分数10%中性甲醛固定封存，一部分行免疫组织化学检测，另一部分快速放入EP管中置入液氮中保存，待行RT-PCR检测。

1.5 主要观察指标

免疫组织化学检测细胞角蛋白及转化生长因子β1表达：按试剂盒步骤进行操作，标记抗P-gp单克隆抗体和辣根过氧化酶标记二抗，DAB显色反应后，苏木精复染，封固，显微镜下观察。阳性结果判断标准为细胞膜或细胞质有棕黄色染色颗粒。

RT-PCR检测胰岛素样生长因子2、血管内皮生长因子及转化生长因子β1 mRNA的表达量：

RNA抽提：取出样本加入1 mL TRIzol裂解液后，剪碎、充分振荡混匀，冰上放置约10 min后，每1 mL TRIzol 中加入氯仿200 μL，盖上盖子，剧烈振荡约1 min，冰上静置2-5 min，然后12 000×g冷冻离心15 min(4 ℃)，小心取出样品，通过观察可以发现样品分3层，其中最上层含有RNA样品。小心吸取上清液约450 μL(每1 mL TRIzol 的吸取量)至含有等体积预冷冻异丙醇的新离心管中，混匀，-20 ℃放置约10 min，12 000×g 冷冻离心10 min(4 ℃)。去上清，加入500 μL冷冻的体积分数75%乙醇，弹起沉淀后 12 000×g冷冻离心5 min(4 ℃)，去上清，再稍离，吸去上清液。风干5-10 min(注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可)，加入去酶水约35 μL。贴上标签后-80 ℃保存。吸取 1 μL抽提的RNA 用去酶水稀释10倍后，在Nanodrop上测定RNA浓度，以去酶水做空白对照，同时记录RNA浓度。
反转录：室温放置融解冰冻保存的First Strand cDNA Synthesis Kit，上下轻微颠倒混匀，进行短暂离心后放置冰上待用。在预冷的RNase free 的反应管内加入约1 μg的Total RNA，1 μL的250 μmol/L Random primer，补去酶水至总体积13 μL。混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65 ℃变性2-10 min后立即放于冰袋上。在RNA-Primer Mix反应管内加入5 μL的5×RT Reaction Buffer，1 μL的 25 mmol/L dNTP，1 μL的25 U/μL RNase Inhibitor，1 μL的200 U/μL M-MLV Rtase，补去酶水至总体积25 μL。混匀反应Mix，短暂离心后37 ℃孵育1 h。反应结束后，85 ℃灭活处理5 min，用灭菌水稀释5倍后-20 ℃保存反转录产物待用。

引物设计：
引物	5'端引物基序列	3'端引物基序列	退火温度(℃)
转化生长因子β1	TTA CTG AGC ATC TTG GAC CTT ATC	TTA CCA CTG AGC CAC AAT GGA	60
胰岛素样生长因子2	CCC TGC TGG AGA CCT ACT G	CAG GTG TCA TAG CGG AAG AA	60
血管内皮生长因子	AGC TAC TGC CGT CCA ATC GA	ACA CTC CAG ACC TTC GTC GTT	60
GAPDH	GCT ACA CTG AGG ACC AGG TTG	TAC CAG GAA ATG AGC TTG ACG	60

定量PCR实验：本次实验采用染料法(SYBR Green Ⅰ) 进行相对定量分析，实验设计是按照△△Ct解析法来进行设计。实验步骤如下：将2×All-in-One^TM Q-PCR Mix在室温下融解，轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心，同时在使用过程中始终保持避光。在96孔板中加入6 μL的去酶水，10 μL的2×All-in-One^TM Q-PCR Mix，2 μL的cDNA (1∶5 dilute)，2 μL的All-in-One^TM Q-PCR Primer (2 μmol/L)；迅速混匀，将96孔板进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。PCR反应体系：预变性95 ℃， 10 min；变形95 ℃ 10 s、退火60 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 20 s，共计40个循环；熔解曲线分析72-95 ℃，0.5 ℃ 10 s/each、30 ℃ 30 s。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0进行统计分析，所有数据用x(_)±s表示。各组间比较采用方差分析，各组间两两比较采用SNK法，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

自19世纪80年代世界上第1例胆囊切除实施以来，医源性胆管损伤也渐有报道，并且随着腹腔镜胆囊切除的发展和普及，医源性胆管损伤的报道屡见不鲜^[1]。胆道一旦发生损伤，无论对于患者还是医生都是一种“意外”和附加伤害，甚至远比原发病还要严重，如果发现不及时、处理不合理，均会给患者及术者造成不可想象的后果，甚至给患者造成所谓的“胆道残废”^[2]。胆管损伤较公认的解决办法是尽可能行胆管端端吻合或胆管壁修补加T管引流，或胆管空肠Roux-en-Y吻合，胆管空肠吻合或胆管端端吻合重建胆管的方法均有可能发生吻合口狭窄或瘘。胆管端端吻合的优点在于：首先Oddi括约肌功能得以保留，可以阻止肠道内容物的反流，也可使术后行ERCP检查更加方便；其次，减少了空肠吻合引起的腹腔内出血和感染的可能；最后胆管端端吻合后并发症的处理比胆肠吻合组要方便^[3]；缺点在于各种原因引起的胆道缺损，只要缺损长度大于1.5 cm时就无法行胆管端端吻合。胆肠吻合虽然可以解决胆道缺损过长的问题，但其在损伤之近端胆管有明显扩张时应用效果满意，若无扩张则难以吻合并易于发生吻合口狭窄。在临床上，相当部分的胆管缺损病例缺损时之近端胆管往往较细并不扩张，难以做到大口径吻合，其应用受到一定的限制。

不难看出传统的胆肠吻合和胆管端端吻合在应用上都有各自的局限性，迄今没有一个应对胆管损伤较满意的方法。若在保留奥狄括约肌功能的前提下，选择适当的材料修复替代缺损较大或损伤较长的胆管，不仅可以维持胆流的正常生理机制，而且能够避免因绕过奥狄括约肌的胆管重建所引起的逆行感染。这种想法一直是国内外研究者关注的热点。自体生物组织、生物或人工合成材料及胆管异体/异种移植为3大方向。自体生物组织优点是取材方便，无排异反应，许多研究采用自体组织如空肠、动脉、静脉、皮肤、腹膜、阑尾等^[4]，但因缺乏血供而被纤维组织取代，最终导致胆管狭窄；带血管蒂的空肠黏膜或浆膜瓣、脐静脉瓣、胃浆肌瓣或残余的胆囊片修补胆管缺损效果较好^[5-6]，但操作费时、费力。生物或人工合成材料优点是来源丰富，操作简便。有报道采用聚四氟乙烯修补胆管缺损获得了满意效果^[7]，但也有人指出其缺乏柔顺性及异物反应明显^[8]，窦春清等^[9]认为不可吸收材料无法引起机体纤维细胞增殖反应，因此无法形成具有良好生物相容性的生物组织被膜，这势必对胆管上皮细胞的黏附及细胞外基质的沉积造成影响，不可降解材料胆管只能起到暂时替代功能。可降解组织化胆管修补材料最具应用前景。1995年由Livesey等^[10]发明的脱细胞真皮基质恰恰是这种新型的材料，其具有以下特点：①有效去除了引起免疫排斥反应的细胞表面抗原，植入体内后生物相容性良好。②是无细胞的天然组织支架，植入后很快即有新生血管和成纤维细胞长入，可很快血管化。③质地柔软，与人体软组织十分相近，易于塑形，无毒副作用，吸收性好，已被广泛应用于临床^[11-13]。查阅目前文献，未发现有将其应用于胆管损伤者。

转化生长因子β1是调节细胞增殖、分化、细胞间基质表达的一类多功能细胞生长因子，是目前已知与瘢痕形成关系最密切的生长因子^[14]。转化生长因子β有3种异构体，在纤维化疾病中的转化生长因子β1最具代表性。转化生长因子β1主要由炎性细胞合成和分泌，对炎性细胞有趋化作用。炎性细胞在炎症部位活化而产生更多的转化生长因子β1，从而放大和延续其生物学效应，并产生多种炎症因子，形成强烈的炎症反应^[15]。转化生长因子β1一方面刺激功能活跃的成纤维细胞增殖，并向肌成纤维细胞转化，亦使处于静止期的成纤维细胞转化为功能活跃的成纤维细胞，使胶原等基质合成增加；另一方面可防止新生基质降解，使其得以稳定和积聚，若转化生长因子β1不断反复产生，将使基质过度合成而导致组织纤维化^[16]。

胰岛素样生长因子是一类既具有促细胞分化和增殖活性作用又具有胰岛素样活性作用的多肽，主要包括胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2两种，对糖、脂肪代谢作用与胰岛素有类似之处。胰岛素样生长因子2在体外各种培养细胞中被认为是一种致细胞分裂因子。胰岛素样生长因子1有促细胞增生与分化作用。肝素结合性表皮生长因子是1991年Higshiyame等首先发现的一种肽类生长因子，属于表皮生长因子家族，在体内广泛分布，与胞膜上表皮生长因子受体紧密结合，通过PKC和Ca²⁺信号途径发挥作用，参与多种病理生理过程，其与伤口愈合、缺血再灌注损伤、先兆子痫、哮喘、冠状动脉病变等多种疾病密切相关，故成为近年来国内外研究热点，近年来在胆管再生方面的研究越来越受到关注。

血管内皮生长因子是目前研究最多、促血管新生最重要的生长因子。目前认为其诱导血管新生的作用机制有：血管内皮生长因子是非常强大且特异性高的血管内皮细胞有丝分裂原，可促进内皮细胞迁移和增殖，同时又是新生血管内皮细胞的抗凋亡因子；血管内皮生长因子可增加血管通透性，促进血浆蛋白外渗形成纤维素支架，从而为内皮细胞的迁移和血管的生长提供支持；血管内皮生长因子还可激活蛋白水解酶系统，包括尿激酶及基质金属蛋白酶，促进细胞外基质降解，从而促进血管新生。

从本实验数据可以看出，实验组转化生长因子β1 mRNA表达量明显低于另外两组，特别是24周时，说明随着时间的延长，实验组胆管形成的瘢痕增生小于其他两组，表明成纤维细胞功能活跃，胶原等基质合成增加，有利于组织创伤的修复，后期转化生长因子β1低表达，可能与胆管上皮完全修复后，胆汁对胆管壁的直接致炎作用减弱有关。实验组胰岛素样生长因子2 mRNA表达水平明显高于空白对照组，但是与对照组相比无统计学差异，说明实验组与对照组在刺激胆管上皮细胞生长方面较单纯的修补明显。实验组血管内皮生长因子 mRNA表达水平明显高于空白对照组及对照组，说明在胆管再生的过程中脱细胞真皮基质更容易刺激血管的生长，增加修复中胆管的血供。综合以上3点可以看出，脱细胞真皮基质修补后的胆管在瘢痕增生方面明显小于空白对照组及对照组，而在胆管上皮及血管增生方面明显优于空白对照组及对照组，初步说明脱细胞真皮基质在胆管修补方面的优越性，是一种合适的修复材料。CK19大多存在于胆管上皮细胞、肝细胞等上皮原样来源的细胞当中，是迄今为止较为公认的胆管上皮细胞相对特异性标记物，当胆管受损后开始增生修复时明显升高。从免疫组化方面可以看出，实验组转化生长因子β1表达明显低于空白对照组及对照组，与基因检测结果一致，而细胞角蛋白的表达明显高于其他组，说明脱细胞真皮基质可诱发胆道上皮的再生。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程