移植肝细胞与胶原水凝胶单元皮下创建工程化肝组织

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原水凝胶可为肝细胞生长和组织重建提供良好的基质支持，并且以胶原为基质构建的工程化组织易于合并生长，形成融合组织。

目的：尝试将肝细胞/胶原水凝胶复合物打散成小块肝单元，堆积在皮下腔中，提高工程化肝组织厚度。

方法：将新鲜分离的大鼠肝细胞与胶原水凝胶复合，构建肝细胞/胶原水凝胶复合物，待固化后将其打散成小块肝单元，以未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物作为对照。取6只SD大鼠，其中3只切除2/3肝脏，诱导肝再生，于双侧腹股沟皮下腔中分别植入打散与未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物；另3只于双侧腹股沟皮下腔中分别植入打散与未打散的肝细胞/胶原水凝胶复合物。植入后7 d取材，采用苏木精-伊红染色、免疫组化染色、印度墨水灌注等方法对工程化肝组织形成情况进行评价。

结果与结论：两组移植物均在皮下腔中形成了血管工程化肝组织，但小块肝单元相互融合，形成了大块血管工程化肝组织，肝组织厚度可达4 mm；整块植入的肝移植物只形成小块肝组织，其厚度只有几层细胞。免疫组织化学染色证实，血管工程化肝组织中的肝细胞具有天然肝细胞的特征及功能。肝部分切除实验表明，工程化肝组织具有对肝部分切除再生刺激产生反应的能力。结果表明将肝细胞/胶原水凝胶移植物打散成小块单元，堆积在皮下腔中，可提高工程化肝组织的厚度。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 肝组织工程, 肝单元, 肝细胞/胶原水凝胶复合物, 皮下腔

Abstract:

BACKGROUND: Collagen hydrogel provides good matrix support for hepatocyte growth and tissue reconstruction, and the collagen-based engineered tissue is easy to merge the growth and form integrated tissue.

OBJECTIVE: To improve the thickness of engineered hepatic tissue by dissociating hepatocytes/collagen hydrogel composite into small hepatic units that accumulate in the subcutaneous cavity.

METHODS: Freshly isolated hepatocytes from rats were mixed with collagen hydrogel to establish hepatocytes/collagen hydrogel composite. The hepatocytes/collagen hydrogel composite was dissociated into small hepatic units after being cured. The undissociated hepatocytes/collagen hydrogel composite was taken as a control. Six Spraque-Dawley rats were enrolled. Three of them were subjected to a two-thirds partial hepatectomy to induce liver regeneration. Dissociated and undissociated hepatocytes/collagen hydrogel composites were implanted into the bilateral inguinal subcutaneous cavity. Dissociated and undissociated hepatocytes/collagen hydrogel composites were implanted into the bilateral inguinal subcutaneous cavity of the other three rats. At the 7^th day after transplantation, engineered hepatic tissue formation was evaluated using hematoxylin-eosin staining, immunohistochemical staining and India ink perfusion methods.

RESULTS AND CONCLUSION: The grafts in these two groups all formed vascular engineered hepatic tissue in the subcutaneous cavity, but after the small hepatic units merged, a large piece of vascular engineered hepatic tissue formed. The hepatic tissue thickness was up to 4 mm. The whole piece of implanted liver grafts only formed small pieces of hepatic tissues, with only several layers of cells. Immunohistochemistry staining confirmed that the hepatocytes in vascular engineered hepatic tissue had the characteristics and functions of natural hepatocytes. Partial hepatectomy experiment showed that engineered hepatic tissue had the ability to respond to regenerative stimulus of partial hepatectomy. These results show that dissociating the hepatocytes/collagen hydrogel grafts into small units that accumlate in the subcutaneous cavity can increase the thickness of the engineered hepatic tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Hepatocytes, Collagen, Hydrogel

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞学水平，体内植入实验。

1.2 时间及地点于2014年3至12月在解放军总医院普通外科研究所完成。

1.3 材料

实验动物：雌性SD大鼠，体质量200-400 g，购自解放军军事医学科学院动物。

1.4 实验方法

肝细胞的分离：肝细胞分离参照文献[13]。取SD大鼠2只，体质量约200 g，经水合氯醛麻醉、开腹自门静脉插管固定后，立即向门静脉灌注39 ℃无钙、镁的Hank’s液，同时切断下腔静脉。待肝脏变灰白时，改向其中注入39 ℃的Ⅳ型胶原酶溶液20 mL。剪下肝脏，置于培养皿中，加入相同体积的Ⅳ型胶原酶溶液，于37 ℃培养箱中继续孵育

创建工程化肝组织实验的主要试剂：
试剂	来源
Ⅳ型胶原酶、DMEM培养基	美国Sigma公司
5-溴尿嘧啶(BrDu)、小鼠抗CK18抗体、兔抗大鼠CD31抗体	博士德公司
印度墨水	索来宝生物技术公司
兔抗人白蛋白抗体	Dako公司
鼠抗BrdU抗体、DAB显色试剂盒	中杉公司
免疫组化试剂盒	迈新公司

10 min。弃去胶原酶溶液，加入DMEM培养基，用镊子撕去肝包膜并轻轻涮洗，使肝细胞分散到溶液中。100目滤网过滤肝细胞，100×g离心5 min，收集肝实质细胞。用DMEM培养基洗涤肝细胞3次，锥虫蓝染色检测肝细胞活性在90%以上备用。

Ⅰ型胶原的制备：制备方法参照文献[10，14]。取新鲜SD大鼠鼠尾，以体积分数75%乙醇浸泡30 min。无菌条件下去皮，撕下尾腱，剪成1 mm左右长度。取1.5 g剪碎尾腱浸入150 mL 0.1%醋酸中，置4 ℃冰箱中并不时摇晃。48 h后离心收集上清溶液即得胶原水凝胶。制备的胶原溶液用电子天平称重法测其每毫升含胶原干质量，调其终质量浓度为1.5 g/L备用。

工程化肝单元的创建：将液态Ⅰ型胶原与2×DMEM溶液等比例混合，用0.1 mol/L NaOH调整pH值为7.2-7.4。将新鲜分离的1.6×10⁸个肝细胞与上述8 mL混合物复合，构建肝细胞/胶原凝胶复合物。将复合物置于1 mL注射器中，待其固化为不流动的凝胶后，轻推注射器活塞，挤出复合物；每隔500-1 000 μm将其打断，创建工程化肝单元。将肝单元以实际大小拍照后，用Image-Pro Plus 6.0软件测量。

肝单元体内植入：取SD大鼠6只，体质量400 g左右，经水合氯醛麻醉后，剪开后肢双侧腹股沟处皮肤，为检测工程化肝组织对肝再生刺激反应，其中3只行2/3肝切除诱导肝再生，其中一侧植入打散的肝细胞/胶原复合物单元，对侧植入未打散的工程化肝移植物；另3只未进行肝切除，其中一侧植入打散的肝细胞/胶原复合物单元，对侧植入未打散的工程化肝移植物。所有大鼠每天腹腔注射5-溴尿嘧啶，取材前从腹主动脉注入印度墨水溶液(5%明胶+4%甘露醇)，检测工程化肝组织中血管功能。移植后7 d，剪开移植位点皮肤，切取皮下可见的工程化肝移植物组织，进行以下检测。

1.5 主要观察指标

苏木精-伊红染色：经体积分数10%中性甲醛固定后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切成4 μm切片。经脱蜡、复水后，苏木精染色，伊红复染，光镜观察采集图片。随机选取5个不同视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件对肝细胞面积进行定量分析，数据表示为x(_)±s。

免疫组织化学染色：经脱蜡、复水样品，微波抗原修复。清洗后，室温下样品与体积分数3%过氧化氢溶液孵育10 min，蒸馏水冲洗。体积分数10%封闭血清作用10 min后，弃去血清，加一抗：兔抗人白蛋白或兔抗人CD31或兔抗人CK18抗体，4 ℃孵育过夜。蒸馏水冲洗，加二抗室温孵育30 min。蒸馏水冲洗，DAB显色系统显色。

讨论

皮下腔空间大，可以容纳大量肝细胞，易于操作，且在不需要时很容易被移除，是体内创建工程化肝组织极具诱惑力的位点^[5-6]。Yokoyamaa等^[6]在皮下预先建立的血管腔中移植肝细胞/基质胶复合物，再生具有代谢活性的工程化肝组织。Ohashi等^[3]将肝单细胞片层叠加植入预血管化腔中，创建具有3层细胞的三维工程化肝组织。本实验证实将肝细胞/胶原水凝胶复合物打散成小块肝单元，堆积在皮下腔中，可融合生长形成大块工程化肝组织，为运用生物工程方法体内构建厚的工程化组织提供了一种新的策略。

移植工程化肝移植物体内创建工程化肝组织的厚度，与移植细胞存活密切相关。由于移植物血管的长入需要两三天，因此移植细胞在植入初期得不到充足的氧气和营养会大量死亡^[7]。因此克服移建物在植入初期由于血供未建立而导致的移植细胞大量死亡，是提高工程化肝组织厚度的重要方面。Shimizu等^[7]基于体内移植物血管化需要两三天的特点，采用间隔多次植入单细胞片层单元方法，体内创建较厚的工程化心肌组织。在本实验中，小块肝单元堆积在一起，相互之间形成空隙，有助于组织液在其中流动，从而为移植物中更多细胞提供营养和氧气供应，带走代谢废物，提高移植肝细胞存活。这可能是该策略形成大块工程化肝组织的主要原因。此外，胶原水凝胶为肝细胞的生长和成活提供了一个非常合适的微环境，在该策略形成大块工程化肝组织中也起着非常重要的作用^[11-13]。

移植物成功血管化对于体内构建工程化肝组织，特别是大块工程化肝组织至关重要^[15-18]。血管化保证移植的肝细胞能够从宿主那里源源不断的获取营养和氧气，带走代谢废物，从而保证所形成工程化肝组织的长期存活。更为重要的是血管化工程肝组织与宿主循环系统间物质交换的建立，对于发挥工程化肝组织功能至关重要。现有皮下创建工程化肝组织的策略均可见血管结构形成^[3^，^6]。本实验中在工程化肝组织边缘和内部均可见大量血管结构形成，表明移植肝单元策略不仅能够形成大块工程化肝组织，而且可有效保证其血管化。此外，通过免疫组织化学染色证实，工程化肝组织中形成的血管结构是成熟的；通过印度墨水灌注实验证实，其与宿主的循环系统相连，是有功能的。

去分化是包括皮下腔等肝外位点创建工程化肝组织需要克服的问题之一。以前研究曾报道皮下植入的肝细胞逐渐趋分化而丧失肝的表型和功能^[5]。Yokoyamaa等^[5-6]证实通过将肝细胞植入预先血管化腔可以克服肝细胞去分化，创建可长期存活的、有功能的工程化肝组织。本实验通过抗CD19抗体和白蛋白免疫组织化学染色证实，移植肝单元不仅可以提高工程化肝组织厚度，而且可有效维持肝细胞表型，保持白蛋白合成功能。此外，还证实所形成的厚工程化肝组织还具有天然肝组织所具有的对肝切除再生刺激产生反应的特性，这与以前的研究报道相一致^[6]。值得一提的是肝脏功能复杂，有关工程化肝组织是否具有天然肝组织其他的功能特征，有待进一步研究。

肝脏具有独特的结构特征，肝窦和胆管系统是其独特的关键结构特征，也是其实现功能的重要保证。现有创建的工程化肝组织均只形成肝细胞团样组织，未有肝脏结构形成的报道^[5-6]。本实验显示，移植肝单元形成具有天然肝组织的腺体样结构和肝窦结构。胆管结构也未在本实验中发现，因此有关胆管结构皮下创建工程化肝组织的胆汁排泄问题亦有待解决。当然，同天然肝组织复杂结构相比，本实验所形成的工程化肝组织结构还非常简单，还需发展新的策略提高其结构形成，特别是胆管结构的形成尚需新的方法。

急慢性肝损伤引起肝脏功能异常，持续肝损伤会导致肝衰竭^[19-22]，肝组织工程发展为其治疗提供新的手段。基于肝组织工程的生物人工肝系统提供肝功能支持，为肝再生能力恢复和等待供肝来源赢得时间，但由于生物人工肝培养系统体外生存时间有限，所能支持时间非常短^[23-26]。皮下创建工程化肝组织同宿主整合，实现工程化组织与宿主循环系统的物质交换，因而不仅可以保证所形成工程化组织的长期存活，而且有望提供更加有效的功能支持。特别是随着从iPS等干细胞分化获取肝细胞方法的建立和成熟，采用干细胞来源的心肌细胞创建工程化肝组织具有极其诱人的治疗前景^[27-30]。

综上所述，通过将工程化肝移植物打散成小块肝单元，堆积在皮下腔中，可以提高再生工程化肝组织的厚度。值得一提的是该方法需要将小块肝单元堆积在一起，因而对于那些无法构建囊状结构的位点该方法不适用。此外，有关工程化组织在皮下腔的长期存活和功能维持有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程