2.1 干细胞治疗糖尿病足机制 生长因子是治疗糖尿病足极具前景治疗方式，因为他们能促进神经元生长和维护神经元功能的完整性，以及修复受损的神经。一些生长因子具有促血管生成作用，促进血管生长以提供给神经细胞营养和氧气。另一些生长因子(如神经营养因子3)具有神经性营养作用，促进神经再生和生长。还有一些生长因子，称为血管神经生长因子(如成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、胰岛索样生长因子1)，同时具有生血管和营养神经的属性。
生长因子治疗糖尿病足的强大能力已由Schratzberger所展示，他们第一个将带有血管内皮生长因子编码的质粒应用于糖尿病兔模型。这些经过血管内皮生长因子治疗的动物表现出神经传导速度恢复正常、血管神经的生成增加、神经纤维密度增加[9]。通过一项随机、双盲试验统计表明含有血管内皮生长因子编码基因的质粒应用于人类患者，症状显著改善。作者还报道血管内皮生长因子治疗相关不良反应并没有达到显著性意义。该研究样本量相对较小，需要进一步的研究来最终确定有血管内皮生长因子基因治疗对糖尿病足的影响。其他生长因子，如胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子2应用于糖尿病足动物模型，结果也表明能促进血管再生和神经生长[10]。
如前所述，有证据表明血管长生因子如VEGF-A，VEGF-C，SHH可以通过改善微循环来促进神经功能的修复[11]。另一方面，神经营养因子的缺乏被认为是糖尿病足一个重要的发病机制。在糖尿病足动物模型应用神经营养因子如神经生长因子、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2或神经胶质源神经营养因子显示症状改善[12]。
上述研究说明同时可以促进血管生成和神经修复的治疗方法对于糖尿病足的治疗进展有着很大的意义。从这个意义上说，使用干细胞或祖细胞的细胞疗法优于单基因或蛋白质疗法。细胞疗法能提供多种促血管生成和神经营养因子，补充所需的特定类型的细胞以促进血管、神经再生。目前，外周血干细胞或骨髓干细胞用于治疗糖尿病足被证明具有良好的效果。使用外周血干细胞或骨髓干细胞的一个优势是他们可以从患者自身获取，然后重新应用于患者本身。
2.2 治疗糖尿病性足病的干细胞(图1)
2.2.1 异体源性干细胞
脐血内皮祖细胞：内皮祖细胞可以从骨髓血、脐血、外周血中分离出来。很多实验研究表明，内皮祖细胞具有很强的生血管作用，内皮祖细胞移植能改善组织缺血状态，与其他来源的内皮祖细胞相比，从脐血分离的内皮祖细胞具有更强的增生潜力和扩增速度，表明脐血内皮祖细胞可以更有效地促进血管生成[13]。
Naruse等[14]研究发现，使用人类脐血内皮祖细胞促进新血管形成可逆转糖尿病足症状。内皮祖细胞从脐血单核细胞分离出并经过7代扩增，高度增殖的脐血内皮祖细胞甚至在糖尿病环境中都能稳定存在，说明脐血内皮祖细胞比其他来源的内皮祖细胞有更好的增殖潜力和速度。于裸鼠下肢骨骼肌注射脐血内皮祖细胞，相比于对照组(单纯肌注生理盐水)，该组裸鼠坐骨神经的神经传导速度和神经反射损伤明显改善，组织学研究显示接受内皮祖细胞肌肉注射的下肢微血管数量增加[14]。这些发现表明，脐血内皮祖细胞移植治疗糖尿病足有明显的效果。如果可以避免不良移植物免疫反应，应用高分裂活性的脐血内皮祖细胞可成为治疗糖尿病足的有效选择[14]。当前还需更多的研究实验以确定脐血干细胞治疗糖尿病足的安全性及效果。
胎盘、脐带、胚胎干细胞：胎盘、脐带、脐血中可以提取出大量的多能间叶基质细胞[15-20]。胎盘和羊水中分离的干细胞具有分化成多种细胞的潜能，而且外胚层和内胚层的干细胞也具有此分化作用[17]。由于具有强大的分化潜能、易于分离、量大等优点，使得其在临床组织再生及修复治疗中极具前景[17]。胎盘间充质干细胞可用于治疗缺血引起的慢性创面，相关文献报道，有下肢缺血症状的糖尿病足小鼠在应用胎盘间充质干细胞后，可使下肢血流明显增加[20]，但目前还缺少临床患者应用胎盘间充质干细胞的报道。
胎盘和脐带间充质干细胞的优势在于其获取方式，可通过简单无创的方式获取大量的间充质干细胞，而且其生物活性接近于胚胎干细胞，具有强大的分裂及分化潜能[21]。
胚胎干细胞分离自受精卵的内部细胞，具有强大的多能性[22]，其可以在体外以未分化细胞的形式储存，可在需要时分化成任何细胞[23]。由于胚胎分化成的内皮细胞和内皮祖细胞被证实可以分泌多种生长因子，从而促进血管神经的再生[24]。在一项关于大鼠应用胚胎干细胞治疗糖尿病足创口的研究中，Lee等[25]证实应用胚胎干细胞的大鼠创口愈合较对照组增快，生长因子分泌增多，尤其是表皮生长因子、血管内皮生长因子。但是，关于人类应用胚胎干细胞还存在争议，曾有报道应用胚胎干细胞治疗糖尿病足的患者死亡。但相关研究仍证实胚胎干细胞治疗糖尿病足具有广阔的空间。当前实验数据样本较小，安全性未排除，仍需进一步的实验研究以确定胎盘、脐带、胚胎干细胞的安全性与可行性。
2.2.2 自体源性干细胞
外周血单核细胞：外周血单核细胞主要包括淋巴细胞、单核细胞、吞噬细胞、树突状细胞等，其中淋巴细胞占很大一部分，抽取外周血，通过密度梯度离心法分离提取，过程简单而且创伤很小。有研究显示于缺血性心肌及骨骼肌注入造血性单核细胞，缺血症状明显改善，通过植入造血单核细胞促使组织中血管生成也能间接改善糖尿病周围神经病变
[26]。相对于骨髓血单核细胞(BM-MNCs)，外周血单核细胞(PB-MNCs)含有较少的内皮祖细胞，移植后对于缺血性组织的改善也不如骨髓血单核细胞(BM-MNCs)
[27]。然而，植入外周血单核细胞仍显著改善侧支循环灌注和局部功能，可能是因为向该区域提供了血管新生因子
[28]。尽管骨髓血单核细胞中包含10倍于外周血单核细胞的内皮祖细胞，在链脲霉素诱导所致糖尿病大鼠分别植入外周血单核细胞和骨髓血单核细胞，运动神经传导速度和神经反射的恢复几乎是相当的，此外，免疫组化染色显示血管的数量也没有明显的差异
[26]。这些结果说明外周血单核细胞是通过促进骨骼肌的生血管作用来增强运动神经传导速度和神经反射，而不是促进坐骨神经的血管生成
[26]。
虽然外周血单核细胞和骨髓血单核细胞中包含相近量的血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2，但外周血单核细胞中的白细胞介素1B和肿瘤坏死因子含量却高于骨髓血单核细胞[28]。这些研究表明血管内皮生长因子可能在缺血组织血管再生过程中扮演一个关键的角色。血管内皮生长因子抗体的使用可使外周血单核细胞和骨髓血单核细胞植入后的效果显著减低，这表明血管内皮生长因子在恢复过程中发挥重要作用[26]。据报道，外周血单核细胞在炎性反应过程中可以合成和释放血管内皮生长因子，因此，炎性外周血单核细胞产生血管内皮生长因子的途径可能比内皮祖细胞生产途径更为重要，其所产生的效果和植入外周血单核细胞或骨髓血单核细胞所起作用相似[29]。正如当前异体外周血单核细胞和骨髓血单核细胞可以植入患有造血系统疾病患者体内，自体移植外周血单核细胞和骨髓血单核细胞也可以成为治疗糖尿病周围血管神经病变的新选择。Kawamura等[30]应用自体外周血单核细胞治疗30例伴有溃疡或缺血症状的糖尿病足患者，并证明治疗组患者血管再生增多，血流增强，Kawamura使得22例糖尿病足患者下肢缺血症状得以改善，避免了感染、坏疽，降低了截肢率[30]。
骨髓单核细胞：通过密度梯度离心法从骨髓中分离出骨髓单核细胞。骨髓单核细胞含有多种细胞，包括淋巴细胞、造血干/祖细胞、内皮祖细胞和间充质干细胞。骨髓单核细胞能分泌多种血管生长因子来促进新血管形成，包括成纤维细胞生长因子2、血管内皮生长因子和血管生成素1[31-32]。在动物模型中，于缺血肢体和心肌中植入骨髓单核细胞能促进新血管形成和侧支血管重塑[31-32]，骨髓单核细胞相对来说容易分离而且大多时候不需要扩增，这使得骨髓单核细胞成为促进血管再生的有吸引性的来源。
最近的实验研究表明骨髓单核细胞应用于糖尿病性足病有良好的治疗效果。长谷川等于糖尿病神经血管病变大鼠体内植入外周血单核细胞或骨髓单核细胞，坐骨神经运动神经传导速度和其附近血流状态明显改善，这可能是单核细胞分泌的血管内皮生长因子所起的作用[26]。这项研究表明，基于骨髓单核细胞含有的内皮祖细胞比外周血单核细胞明显多，因此骨髓单核细胞比外周血单核细胞更有效[26]。研究报道，糖尿病大鼠肌内移植的骨髓单核细胞优先定位于神经[33]，尤其是神经滋养血管，并促进神经表达各种血管生成和神经营养因子。这些神经的血供明显改善，运动神经传导速度也恢复到了近乎正常。这些研究表明，神经滋养血管可能在糖尿病足神经病变的发生和发展过程中发挥重要作用。血管生成是骨髓单核细胞促进糖尿病神经血管恢复的主要机制，因为通过他们的实验观察，在可检测范围内并没有发现骨髓单核细胞转化成内皮细胞。
最新的其他研究报告也显示，链脲霉素诱导糖尿病大鼠患病早期应用新鲜分离的骨髓单核细胞能明显缓解神经性疼痛[34]。冯•弗雷分别应用发丝刺激和丙酮实验测试糖尿病足大鼠的触觉及冷觉，其中骨髓单核细胞移植侧的肢体触痛觉和冷觉显著改善，此外已减退的运动神经传导速度和神经反射也得到改善。骨髓单核细胞移植后亦能显著改善编码NT3的mRNA表达水平和下肢肌肉微血管数量。然而骨髓单核细胞移植对神经纤维密度的改善并不明显[34]。免疫学研究表明骨髓单核细胞移植后能增加同侧比目鱼肌肌肉微血管的数量。链脲霉素诱导糖尿病大鼠坐骨神经神经传导速度明显减退，而在骨髓单核细胞移植后能够明显改善。金和同事表示，移植的骨髓单核细胞将优先作用于坐骨神经并能改善神经传导速度[33]，因此，这些结果表明改进组织包括神经血管的血流量是骨髓单核细胞移植的重要影响之一。2个关于糖尿病神经病变导致的疼痛和血流量改变的研究支持上述观点，并证明应用血管扩张剂、硝酸异山梨酯喷雾剂、三硝酸甘油酯可显著缓解疼痛[35]，这些结果与上述的研究共同支持显示自体移植骨髓单核细胞可以用于治疗糖尿病足的神经性疼痛。
脂肪源性干细胞：脂肪中分离的干细胞，被称为脂肪源性干细胞，已经被用于慢性皮肤溃疡。脂肪源性干细胞治疗溃疡的机制是通过其可分化活性及可分裂多种生长因子促进血管及神经的再生修复[36]。许多文献报道，脂肪源性干细胞可快速的分化为心肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、骨软骨细胞、肌细胞等。Fraser等[37]通过酶解法分离出脂肪干细胞，其中的主要成分为间充质干细胞[38]。在相关的大鼠实验研究中，应用脂肪源性干细胞的大鼠溃疡愈合明显增快，血管形成增加[39]。Marino等[40]的相关研究证实了脂肪干细胞的效果，将脂肪干细胞注入溃疡边缘，治疗组的10例糖尿病足慢性不愈合溃疡患者，治疗后溃疡的直径和深度明显减小，疼痛减轻，6例患者完全愈合，而且所有患者均未出现不良反应[40]，但因其提取相对复杂，来源少，还需要更多的实验去证明其有效性。
骨髓间充质干细胞：通过密度梯度离心法可从骨髓中分离出骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子，可以起到促进血管和神经生成的作用。骨髓间充质干细胞移植已经在治疗缺血性心肌梗死、动脉硬化闭塞性脉管炎等疾病中取得不错的效果。与胎盘/ 脐带能分离出大量间充质干细胞相比，骨髓中分离的间充质干细胞数量较少，而且程序复杂，耗费高。从骨髓中分离必须通过有创途径，而且在分离过程中可能会影响间充质干细胞的分化、分裂活性，影响细胞因子的释放，甚至导致细胞凋亡。当前应用聚糖体获取系统，可以获得大量与胚胎源性活性相近的间充质干细胞[41]。
柴田和同事已表明，间充质干细胞移植能改善糖尿病足症状[42]。骨髓间充质干细胞从成年大鼠的骨髓中分离出来，并植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠的单侧肢体骨骼肌中，移植后4周，移植处有血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2的表达，神经感觉阈值、运动神经传导速度、神经反射以及比目鱼肌中毛细血管数量、肌肉纤维和神经形态测量等均显著改善。此外，移植侧骨髓间充质干细胞与血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子2的共定位现象也已被证实。链脲霉素诱导糖尿病大鼠存在痛觉减退，运动神经传导速度减退、神经反射减弱，比目鱼肌中毛细血管的数量减少，而这些症状在骨髓间充质干细胞移植后均得到改善，而且腓神经的形态和功能也近乎正常。这些结果表明骨髓间充质干细胞移植后可通过分泌多种生长因子来治疗糖尿病足神经血管病变[42]。
许多临床研究证明骨髓间充质干细胞可用于治疗下肢缺血性症状，肌肉内注射骨髓间充质干细胞可使缺血症状得以改善，使得肢体血流增加，疼痛减轻，创面减少。Prochazka等
[43]通过给糖尿病足患者下肢肌肉注射骨髓间充质干细胞作为治疗糖尿病足的最终性治疗，他报道81%的患者症状得以改善，显著降低了截肢率。而且研究还发现，创口的愈合速度与干细胞的浓度有关，越大的创面需要越多的干细胞。最近还有研究将骨髓单核细胞与骨髓间充质干细胞效果进行对比，两组患者的疼痛均减轻，踝肱指数值和经皮氧分压值均提高，骨髓间充质干细胞治疗组患者溃疡愈合速度及肢体的血流量均优于骨髓单核细胞组
[44]。
