无血清培养人胚胎干细胞的体系研究与进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.027

摘要/Abstract

摘要：

背景：人胚胎干细胞有永久自我更新和向外、中和内胚层分化的能力，具有重要的基础研究价值和临床应用前景，可应用于再生医学、药物毒性筛选、早期胚胎发育、细胞移植治疗和基因治疗等领域，但是在限定条件下的大规模细胞培养、控制和定向分化技术的发展仍然具有实质性的挑战。在治疗应用方面，许多研究者试图建立可在无异源限定性和规模化培养体系中维持细胞多能性的培养方法。
目的：综述近几年报道的人胚胎干细胞的无血清培养体系研究进展，重点是在发展适于治疗用途的无血清和无异源培养体系进程中，面临的挑战和进步。
方法：应用计算机检索CNKI和PubMed学术数据库中2008至2015年关于人胚胎干细胞无血清培养的文章，排除观点重复和陈旧的文章，最后对58篇文章进行归纳汇总。
结果与结论：研究者已经在使用人源性饲养层细胞、无饲养层基质及限定性成分培养基上做了许多尝试，旨在选择合适的基质和培养基，使异源性成分达到最小化或者不使用，以求获得临床级别的细胞株。但是目前的细胞制品距离临床应用还有很大的距离，仍有很多问题需要解决，比如细胞制品的规范化、标准化、个性化定制等。相信随着干细胞研究和行业的规范，胚胎干细胞产品将会在临床得到广泛应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 无血清培养, 人胚胎干细胞, 多能性, 饲养层, 基质, 限定性培养基, 科技型中小企业技术创新基金, 深圳市战略新兴产业发展专项资金

Abstract:

BACKGROUND: Human embryonic stem cells are able to self-renew indefinitely and have the capacity to differentiate into all three germ layers (ectoderm, endoderm and mesoderm). These properties imply great potential in the basic research and clinical application, including regenerative medicine, drug screening and toxins, early human embryo, cell transplantation, gene therapy, etc. However, it is a substantial challenge to develop efficient techniques for their large-scale culture under defined conditions, and for controlling and directing their differentiation. For therapeutic purposes, many scholars are trying to establish methods for maintaining pluripotency in defined xeno-free conditions and scalable culture systems.
OBJECTIVE: To discuss the progress of serum-free culture systems in human embryonic stem cell research
reported in recent years and to highlight the challenges and advances being made towards the development of serum-free and xeno-free culture systems suitable for therapeutic applications.
METHODS: A computer-based search of CNKI and PubMed academic database was performed for articles addressing serum-free culture systems of human embryonic stem cells published from 2008 to 2015. Repetitive and old articles were excluded. Finally, 58 articles were summarized.
RESULTS AND CONCLUSION: Several groups have attempted to exclude individual animal components by using feeder-free matrices, feeder cells of human origin, or defined xeno-free media, aiming to select a suitable matrix and medium that can minimize or not use heterologous components, in order to obtain cell lines at clinical level. However, the current cell products are far from clinical application. There are still many problems to be solved, such as standardization, normalization and individualization of cell products. With the normative development of stem cell research and industry, human embryonic stem cell products are expected to be widely used in clinic.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Embryonic Stem Cells, Culture Media, Serum-Free, Culture Media, Conditioned, Tissue Engineering

张哲，曾宪卓，鲁菲，郭明辉，董慧君. 无血清培养人胚胎干细胞的体系研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6711-6717.

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图/表（结果） 2

2.1 人胚胎干细胞人胚胎干细胞是取自人囊胚内细胞群(inner cell mass，ICM)，经体外分离、培养获得的一种多能干细胞。目前已有数千种人胚胎干细胞株被建立，主要来源于临床进行体外受精－胚胎移植和胞浆内单精子注射治疗患者捐赠的废弃的新鲜或冷冻解冻后的胚胎^[3-5]，见图1。

人胚胎干细胞的性能包括以下4个方面：①起源于多能细胞群。②保持未分化状态的自我更新能力。③在增殖期间能维持正常的染色体组型。④在体外或畸胎瘤体内均能分化为外、中和内胚层来源的细胞^[7-8]。在不同的诱导条件下可分化为多种细胞类型，包括神经祖细胞、内分泌细胞、心肌样细胞、少突胶质细胞和肝细胞样细胞^[9-14]，可作为一种再生性细胞来源用于治疗视网膜黄斑、1型糖尿病、帕金森综合征、心血管疾病和肝病等多种疾病^[15-19]。

2.2 人胚胎干细胞的无血清培养体系传统的人胚胎干细胞的培养方法，是使用小鼠胚胎成纤维细胞经过丝裂霉素或者γ射线照射处理后作为饲养层，小鼠胚胎成纤维细胞分泌生长因子和趋化因子维持干细胞的多能性，所用培养基为DMEM，添加体积分数为20%胎牛血清、1 mmol/L谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1% β-巯基乙醇^[20]。由于小鼠胚胎成纤维细胞可能有动物病原体，所培养的人胚胎干细胞并不适于临床移植应用^[21]。同样，动物血清的使用也可能会给细胞带来牛病毒污染^[22]。若使用无异源和无血清成分的培养体系，则不会存在上述问题。根据是否含有饲养层细胞，将培养体系分为含饲养层及无饲养层两大无血清培养体系。

2.2.1 含饲养层的无血清培养体系采用人源性饲养层培养人胚胎干细胞是向无异源培养体系迈进的第一步。研究者分别对胚胎、胎盘、子宫、羊水等不同组织来源的人源性细胞支持胚胎干细胞的自我更新进行了研究^[23-27]。胚胎干细胞来源的间充质干细胞作为饲养层，人胚胎干细胞株在不添加外源多能性因子培养条件下可传代30代以上，同时保持胚胎干细胞株的正常形态和多能性相关蛋白表达水平^[23]。脐血基质细胞培养模型既可避免使用胎包皮、肌肉或骨髓作为饲养层的伦理问题，又可提供大量的细胞来源。脐带间充质干细胞作为饲养层，可维持人胚胎干细胞株培养20代后，继续保持人胚胎干细胞的典型形态^[28]。

利用已建立的细胞系而非原代培养更省人力，而且能保证饲养层制备的一致性，例如商业化的人包皮成纤维细胞株作为饲养层培育得到新的人胚胎干细胞株^[29]，未分化的人胚胎干细胞株可传代80代以上。此外，利用人胚胎干细胞株自身分化而成的成纤维样细胞作为饲养层也引起研究者的兴趣，这种饲养层可支持自身人胚胎干细胞的生长^[30-31]，同时排除了饲养层的异源和异体污染，但需要先将人胚胎干细胞分化为成纤维细胞再用其培养相应的人胚胎干细胞系，用于大规模培养时操作比较复杂。

条件培养基含有饲养层细胞的分泌因子，Bigdeli等^[32]成功地建立了一个无饲养层和无基质胶培养系统，人胚胎干细胞在这个培养系统中可直接生长，联合人饲养层来源的条件培养基传代43次，仍能保持多能性和未分化状态。而在不使用条件培养基的无饲养层培养系统中，人胚胎干细胞很难维持未分化状态，说明饲养层和条件培养基产生了维持人胚胎干细胞生长所需的绝大多数信号。人源性饲养层的培养体系克服了目前体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险，初步解决了人胚胎干细胞临床应用的生物安全性问题。以微孔膜将人胚胎干细胞株与饲养层细胞分离形成的间接共培养体系可降低交叉污染^[25^，^33]。尽管有诸多成功的应用，但是饲养层可能存在批次间质量差异，这种限制仍然无法满足临床应用的要求。

2.2.2 无饲养层的无血清培养体系饲养层细胞的制备、鉴定的繁琐及其分泌因子的成分和作用的不确定性等，显著限制了人胚胎干细胞的大规模培养以满足临床需要。因而，目前干细胞研究关键在于设计无饲养层、无血清、无异源和限定性培养基的培养体系。

基质：目前，用于无饲养层的基质主要有细胞外基质、重组蛋白、聚合物或其与蛋白、多肽的复合物等。最初尝试无饲养层培养体系的方法是使用细胞外基质蛋白联合增补生长因子，创造一个促进干细胞自我更新的微环境。Matrigel是一种小鼠肉瘤基膜分离的再生基膜，为Ⅳ型胶原、层黏蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白和其他未知生长因子组成的凝胶状混合物，通常联合生长因子或条件培养基用于人胚胎干细胞的培养^[34-36]，由于Matrigel组分批次间的质量差异和无法排除动物来源的成分，这种培养体系对于临床治疗应用仍存在潜在威胁。目前，人源性细胞外基质，如包皮成纤维细胞、胎盘、脐血等来源的细胞外基质均有成功应用报道^[30^，^37-40]。Meng等^[37]使用包皮成纤维细胞来源的细胞外基质、增补100 μg/L重组碱性成纤维细胞生长因子的HEScGRO基本培养基，可在无异物无滋养层条件下培养人胚胎干细胞20代以上。Khoo等^[41]使用上皮间质转换法获得人胚胎干细胞来源的间充质细胞(hESc-MPC细胞)，从中提取的细胞外基质蛋白组分可支持人胚胎干细胞的未分化扩增。此外，常用的人源性基质蛋白有laminin、fibronectin等，这种从人源性细胞外基质提取的黏附性蛋白具备与细胞表面受体相互作用的配体，可与细胞发生特异性结合，不存在异源性病原体污染及异种基因污染等问题。虽然单一种类基质或几种基质混合物均可成功维持人胚胎干细胞的未分化状态，但这些基质成分仍然是不确定的，且不同批次的产品可能会有差异。

重组蛋白化学成分稳定、氨基酸序列确定，可以介导细胞与细胞外基质的黏附，能激活细胞增殖、凋亡、细胞运动、基因表达和细胞分化的信号转导通路^[42]。目前常用的重组蛋白基质有laminin、E-cadherin、vitronectin、fibronectin等。Laminin、E-cadherin通过与人胚胎干细胞的结合素受体α6β1结合，激发其持续自我更新的信号通路。E-cadherin 是一种Ca²⁺依赖性的细胞黏附分子，未分化的人胚胎干细胞可表达大量的E-cadherin。Rodin等^[43]制备了一种含重组人LN-521和E-cadherin的细胞培养基质，这种基质不仅可以维持细胞株的增殖，而且还可以在不损坏胚胎的情况下培养囊胚内细胞团和单分裂球细胞来源的人胚胎干细胞。

另外，一些合成的复合物基质也可用于人胚胎干细胞培养。由结合源于细胞外基质蛋白生物活性区的肽段所构成的合成肽段丙烯酸酯培养表面作为基质，在X-Vivo 10培养基条件下可维持人胚胎干细胞的自我更新能力和多能性10代以上^[44]。Corning公司的Synthemax^TM表面培养产品，是结合含玻连蛋白序列的RGD肽段的丙烯酸酯基底，可用于支持胚胎干细胞和诱导多能性干细胞在限定性培养基条件下的扩增和定向分化^[45-46]。一种以蜘蛛丝蛋白作为基底的新型合成材料由重组小蜘蛛丝蛋白4RepCT(-3000碱基对)组成，在4RepCT-玻连蛋白和无异源限定性培养基条件下，人胚胎干细胞株可传代30代以上且保持多能性，这种生物基质也可用于3D细胞培养^[47]。

虽然采用这些基质避免了人胚胎干细胞与饲养层细胞的直接接触，成功地维持了人胚胎干细胞的未分化状态，但这些基质的成分仍不明确，不同批次的产品可能会有差异，目前还不清楚生长在不同培养基质上的人胚胎干细胞是否具有相同的生物学特性。

无血清培养基：商业蛋白增补成分，如Knockout血清替代品，虽可用于替代血清，但事实上依旧包含动物血清蛋白。仅少数培养基完全无异源，以人血清白蛋白替代牛血清白蛋白，但因人血清白蛋白源于供体捐献，仍存在批次间质量差异。限定性培养基是一种化学成分及浓度确定的，含有能够提供细胞生长所需各种营养物质的培养基，目前的限定性培养基通常是在无血清培养基中添加生长因子而得。限定性培养基含有的生长因子对人胚胎干细胞自我更新起重要作用。碱性成纤维细胞生长因子调控人胚胎干细胞多能性表面标志物OCT3/4 的表达，成纤维细胞生长因子2通过介导 PI3-K 信号直接参与调节Wnt通路下游信号而维持人胚胎干细胞的未分化状态；转化生长因子β、胰岛素样生长因子Ⅱ协同成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞在无饲养层培养状态下的细胞内平衡^[42]。采用限定性培养基培养人胚胎干细胞可以提高人胚胎干细胞培养的重复性、规模性以及可操作性。表1为一些商业通用的培养基信息。目前市场上以重组人血清白蛋白可替代人血清白蛋白的限定性培养基有TeSR2和PSGro，不含血清蛋白组分的培养基有Essential 8和TESR-E8，X-Vivo含重组生长因子和高度纯化、药品级别的人血清白蛋白。

3D培养：目前天然胚胎干细胞微环境的确切生物分子组分并未完全鉴定，2D培养体系不能完全模拟体内微环境，最终会限制其应用发展。相比而言，生物工程3D支架体外培养方法更接近体内微环境，已有许多基质材料应用于3D细胞培养。例如，利用PEG水凝胶结构交联基质金属蛋白酶敏感多肽，再与整合素特异黏附配体耦合，可以保持人干细胞的多能性^[48-49]。3D PEG支架可以支持人胚胎细胞株H1、H9和Novo在无饲养层、含增补血清替代物条件下的扩增、自我更新和分化能力^[50]。

细胞在微载体内的悬浮培养可以创造虚拟的微环境^[51-55]，利于生物反应器的大规模制备细胞。修饰微载体的表面可以增加细胞黏附，在Matrigel包被的纤维素磁珠和无血清mTeSR/Stem Pro培养基条件下，人胚胎干细胞株可传代20多代而不丧失多能性^[54]。Marinho 等^[55]使用聚苯乙烯微载体球和增补碱性成纤维细胞生长因子的限定性培养基BRASTEM，培养初期6 d内细胞快速生长并保存多能性，但该培养体系的一个问题是在生物反应器长期培养过程中易出现因低速搅拌形成的细胞集群，而高度搅拌引起的剪切力对人胚胎干细胞增殖有害。不使用包被或微载体进行人胚胎干细胞的悬浮培养也是可行的。Steiner等^[56]设计的培养体系可以直接对内细胞团进行悬浮培养，在增补层粘连蛋白、纤连蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、Activin A和神经营养因子BDNF、NT和NT4的无异源限定性培养基条件下，生成了3个新细胞株。
2.2.3 其他目前，还有其他人胚胎干细胞的培养体系正在研究中。Freitas等^[57]以磁场纳米粒子体系培养人胚胎细胞株BG01V/hOG，细胞成功增殖且保持多能性。Chen等^[58]以温度敏感聚合物修饰重组玻连蛋白区域以桥接人胚胎干细胞，助其形成拟胚体，当拟胚体长大而细胞因子和营养物供应不足时，通过37-25 ℃的温度转化，温敏聚合物可促进拟胚体分解，促使细胞进行周期性解离和增殖；18 d重复3次温度转化可获得大于30倍的细胞数目，且不损坏细胞的多能性。

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引言

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs or hES)具有在体外无限增殖，并保持未分化状态的自我更新能力和多向分化潜能，能分化为外、中和内胚层来源的细胞，是再生治疗和免疫调节治疗的理想方案，在基础研究和移植治疗中具有广阔的应用前景[1]。人胚胎干细胞在体内几乎可分化成任一细胞类型，可用于临床治疗多种疾病，如失明、糖尿病、心肌梗死、神经退行性疾病等。而且，人胚胎干细胞及其分化产物比成体细胞更不易遭受免疫排斥，进一步鼓舞了各国对胚胎干细胞临床应用的加速研究[2]。
然而，迄今为止，人胚胎干细胞的体外扩增过程都间接或直接的含有动物来源成分，异源污染的细胞移植后会加剧移植排斥反应，产生非人类病原体疾病，因此说现在的人胚胎干细胞株并不完全适合于临床应用。早期的人胚胎干细胞的培养方法来源于Thomson实验室最初建系所使用的方法，这种方法中使用了小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，且培养体系需要胎牛血清支持，导致不可避免的异源污染和免疫排斥风险。目前已有许多文献报道了胚胎干细胞的无血清或无异源培养条件。无血清培养体系的最大特点是能够减少或者消除动物成分所带来的干扰，从而能够更好地研究人胚胎干细胞的生长条件，保证临床细胞治疗应用的安全性和有效性，是该领域走向产业化的必然趋势。回顾已经建立的无血清或无异源培养条件，也并非真正的无异源。例如，商业化生产的Knock-Out血清替代物就含有动物蛋白。
为了获得真正的无血清培养体系，除了寻求胎牛血清的替代物，还有3个含异源的主要因素必须考虑。首先，长期维持人胚胎干细胞自我更新和多能性的饲养层细胞是否为动物来源，如传统培养体系应用的鼠胚胎干细胞。第二，培养基增补物，如血清替代物是否含动物蛋白。第三，在去除滋养外胚层得到囊胚内细胞团的过程是否使用异源抗体。目前国内外的研究者已经在使用人源性饲养层细胞、无饲养层基质、限定性成分培养基及3D无培养模型上做了许多尝试，旨在选择可规模化临床应用的基质和培养体系，使异源性成分达到最小化或者不使用，以求获得临床级别的细胞株。本文综述了最近几年人们为建立人胚胎干细胞株无血清培养体系所做的努力，为今后细胞培养基质和增补物的选择提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

讨论

在干细胞治疗和干细胞组织工程领域，应用无血清培养体系进行干细胞体外培养可以保证人源干细胞、组织和器官的安全性和有效性，是该领域走向产业化的必然趋势。本文虽然是针对人胚胎干细胞无血清培养方法的综述，但大部分培养系统也适用于人多能干细胞。目前国内外人胚胎干细胞的含饲养层培养、细胞外基质、限定性培养基和生物支架等无血清培养体系已经取得很大的进展，也进行了大力的投入，旨在选择合适的培养体系，使异源性成分达到最小化或者不使用，以求获得临床级别的细胞株。但是体外模拟人胚胎干细胞的体内微环境是非常困难的，目前的细胞制品距离临床应用还有很大的距离。
人胚胎干细胞的体外培养条件非常严格，可受许多因素的影响。文中总结了人胚胎干细胞不同培养体系的优缺点，但目前临床应用的人胚胎干细胞仍无统一标准。在人胚胎干细胞的培养体系设计中，对于基质要考虑时间稳定性、灭菌技术兼容性，而当基质含生长因子、多肽等生物成分时，往往容易忽略后者；对于培养基要考虑专用无异源合成培养基、重组生长因子及其他添加物的成本；对于大规模扩增的培养体系设计需满足患者治疗周期的细胞用量；在临床应用时还需考虑细胞制品的规范化、标准化、个性化定制等。另外，在长期培养过程中需要关注细胞的多能性和基因稳定性，涉及细胞自我更新和终端分化的机制值得进一步深度分析。相信随着干细胞研究和行业的规范，胚胎干细胞产品将会在临床得到广泛应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程