间充质干细胞源性微囊泡和诱导性多潜能干细胞促进关节软骨修复的进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞源性微囊泡和诱导性多潜能干细胞在多个领域的组织修复作用已被证实，两者有望成为修复关节软骨损伤更有效、更安全的治疗方法。
目的：综述间充质干细胞源性微囊泡和诱导性多潜能干细胞促进软骨修复的研究进展。
方法：由第一作者应用计算机检索PubMed、中国期刊全文数据库(CNKI)2003年至2015年8月相关文献，英文检索词为“Articular cartilage injury，Bone marrow mesenchymal stem cells”，中文检索词为“软骨损伤，骨髓间充质干细胞”。选择文章内容与干细胞治疗骨关节炎有关者，同一领域文献则选择近期发表在权威杂志文章。
结果与结论：关节软骨损伤仍是骨科领域的一大难题，虽然修复方法很多，但均有局限性，而间充质干细胞源性微囊泡与诱导性多潜能干细胞的发现为软骨修复创造了可能性，同时给广大关节软骨损伤患者带来新的希望。但是，间充质干细胞源性微囊泡与诱导性多潜能干细胞大量提取及纯化方法、增殖分化潜能、在软骨修复中的作用机制等很多问题仍需要进一步解决。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 分化, 软骨损伤, 骨髓间充质干细胞, 微囊泡, 诱导性多潜能干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells-derived microvesicles have been confirmed in various tissue repairs, which are expected to become more effective and safe therapy for articular cartilage repair.
OBJECTIVE: To overall understand the research progress in the use of induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells-derived microvesicles in articular cartilage repair.
METHODS: A computer-based search of PubMed and CNKI was performed by the first author for articles related to stem cell treatment of osteoarthritis published from 2003 to 2015. The keywords were “articular cartilage injury, bone marrow mesenchymal stem cells” in English and Chinese, respectively. In the same field, articles published recently or in authorized journals were preferred.
RESULTS AND CONCLUSION: Articular cartilage injury is still a difficulty in the orthopedics. Many repair methods have been reported, but they all have limitations. Induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells-derived microvesicles bring a new hope for patients with articular cartilage injury. However, there are still many problems to be solved, such as extracting and purifying a large amount of cells, proliferation and differentiation potentials, and mechanism underlying cartilage repair.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Cartilage Diseases, Cartilage, Articular, Induced Pluripotent Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

侯威宇，程艳伟，向川. 间充质干细胞源性微囊泡和诱导性多潜能干细胞促进关节软骨修复的进展[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6706-6710.

Hou Wei-yu, Cheng Yan-wei, Xiang Chuan . Articular cartilage repair using mesenchymal stem cells-derived microvesicles and induced pluripotent stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(41): 6706-6710.

图/表（结果） 1

2.1 关节软骨的结构及功能特性正常人体关节软骨为透明软骨，位于长骨端关节面，是有弹性的负重组织。关节软骨自关节面向骨端依次分为滑动带、过渡带、放射带、钙化带和软骨下骨性终板。成熟关节软骨中有大量的细胞外基质，软骨细胞稀疏散在陷窝之中。细胞外基质的主要成分是蛋白多糖、胶原和水分，水分占65%-80%，蛋白多糖和胶原纤维各占10%-15%，还包括磷脂、脂肪、蛋白质、糖蛋白等重要成分^[3]。关节软骨的主要功能：①承受力学负荷，吸收机械性震荡，减少骨与骨之间的冲击，将负重传至关节下骨。②润滑关节，可减轻反复滑动中关节面的摩擦，进而保护关节软骨免受损伤。由于缺乏血供，成熟关节软骨的营养来源主要依靠滑液，关节软骨一旦损伤，很难完整修复，最终导致骨性关节炎的发生，影响患者的生活质量^[4]。

2.2 关节软骨的损伤和修复正常软骨组织在急性或重复性创伤(包括过度的冲击负荷)作用下即可导致关节软骨基质发生变化，即蛋白多糖含量减少和胶原纤维网络(其中Ⅱ型胶原占80%-90%)发生破坏，软骨细胞表型去分化。因此，软骨损伤修复的关键在于促进受损区域软骨细胞表型恢复、增加软骨细胞增殖及基质合成。

关节活动对关节软骨的形成具有重要作用，适当的关节活动对于关节软骨生理机能的维持必不可少^[5]。研究证实，关节软骨损伤后的修复速度根据是否穿透软骨下骨性终板而不同，相较于未穿过软骨钙化层的表浅软骨缺损，穿过钙化层并累及软骨下骨的全层缺损修复更快^[6]。进一步的研究表明，软骨损伤后虽可部分自行修复，但其生成的软骨组织并非正常透明软骨，而是纤维软骨，缺乏正常软骨组织的特有功能，造成永久性结构和功能的丧失^[7]。

传统用于修复关节软骨损伤的方法很多：①关节表面重建术，如钻孔术、磨削术、关节镜下刨削术及微骨折术。②生物移植，包括骨软骨复合物移植、软骨细胞移植、干细胞移植。③药物治疗^[8]。以上治疗手段经多年临床应用，疗效欠佳，仅能减轻疼痛、缓解症状，难以恢复病损软骨组织的正常形态，最终遗留疼痛及功能障碍^[9]。

近年来随着组织工程技术的迅猛发展，关节软骨损伤修复迎来了新曙光。自Noble等^[10]在1995年首次成功将间充干细胞诱导分化为软骨细胞以来，大量研究已证实骨髓间充质干细胞在软骨修复方面具有积极作用^[10-13]，并且取得了喜人的成果。虽然利用骨髓间充质干细胞修复软骨缺损可以避免伦理、法律、宗教等问题，但其来源有限，增殖能力有限，且有研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫调节双重性^[14-15]，一方面具有免疫抑制功能，另一方面又可充当抗原提呈细胞，诱发免疫反应。此外，骨髓间充质干细胞广泛存在于一些肿瘤组织中，有学者高度怀疑骨髓间充质干细胞与这些肿瘤的相关性^[16-17]。基于此，探求一种新的安全有效的软骨修复方法具有重要的现实意义。

2.3 利用间充质干细胞源性微囊泡(MSCs-MVs)修复关节软骨损伤

2.3.1 微囊泡的生物学特性微囊泡是机体内的各类细胞在正常和病理状态下(激活或凋亡)，从细胞质膜上脱落释放的一种微小的膜性囊泡。目前研究最多的微囊泡是来源于内吞体的大小为 30-100 nm的由细胞释放的腔内囊泡，该囊泡存在于多种体液中，包括尿液、血浆、腹水、唾液、乳汁、支气管肺泡灌洗液和羊水等^[18]。1967年，Wolf首次在血液系统中发现并报道了微囊泡，当时被命名为——血小板尘埃，仅被看作是细胞活化或损伤的标志物。随着研究的深入，已证实多种刺激和不同的细胞环境均可诱导形成微囊泡，包括分化、活化、老化、应激、细胞因子刺激、癌基因表达和病毒感染等，微囊泡是细胞间信号传递分子，从母体细胞脱落时带走了大量的生物活性分子(蛋白质、脂质、mRNA、siRNA 及 microRNA等)，运输到相应靶细胞继而调节其生理功能。微囊泡参与了生物学和疾病发生的多个过程，包括细胞转化、细胞生长、血管发生、细胞迁移和分化等，发挥着重要的作用^[19]。

2.3.2 间充质干细胞源性微囊泡在组织修复中的研究现状间充质干细胞源性微囊泡是间充质干细胞在静息或应激状态下分泌产生的具有异质性的亚细胞结构群^[20]。已有研究证实间充质干细胞源性微囊泡的产生是间充质干细胞策略性外排的结果，受钙离子浓度、P53蛋白等多种因素调节^[19]。

目前，已有研究者通过高速离心法从间充质干细胞中分离出微囊泡，且证实了间充质干细胞源性微囊泡在不同受损组织中均具有一定的修复能力。姚嘉等^[21]利用间充质干细胞源性微囊泡修复缺血再灌注损伤大鼠肝脏，证实了间充质干细胞源性微囊泡对大鼠肝脏缺血再灌注损伤具有明显的保护及修复作用，此举为临床肝脏外科中减轻肝缺血再灌注损伤提供了一种新方法。Bruno等^[22-23]于2009年通过SCID鼠急性肾损伤模型证实间充质干细胞源性微囊泡具有保护及修复肾功能的作用；2011年，该研究小组进一步证实其保护机制是由RNA介导的。王喜梅等^[24]通过对间充质干细胞源性微囊泡相关研究的系统分析总结，认为可能是其主导的 mRNA或蛋白质转移诱导了成熟细胞的再分化，激活了增殖程序，从而加快了损伤组织的修复进程。间充质干细胞源性微囊泡在循环、呼吸、生殖等系统所发挥的组织修复作用也已被证实。Zhang等^[25]发现人脐带间充质干细胞源性微囊泡可促进人类内皮细胞增殖，刺激血管生成，且效应呈剂量依赖性。Zhu等^[26]研究证实人间充质干细胞源性微囊泡对大肠杆菌内毒素诱导的急性肺损伤小鼠也具有一定治疗作用，可以减轻肺水肿及肺泡蛋白的渗出。Mokarizadeh等^[27]利用Wistar大鼠研究了间充质干细胞源性微囊泡在生殖领域的功能，发现间充质干细胞源性微囊泡可提高冻存精子的质量参数和粘合性能，并且可部分修复冻存对精子活力带来的损伤。

2.3.3 间充质干细胞源性微囊泡修复关节软骨损伤的可行性长期以来，间充质干细胞被认为是通过其多向分化潜能来修复组织损伤，但近来更倾向于认为是通过旁分泌途径的间接方式来修复组织损伤，而间充质干细胞源性微囊泡很可能就是其中关键的作用组件。Strassburg等^[28]研究了间充质干细胞和退化髓核细胞间的相互作用，发现两者之间存在膜成分的双向交换，微囊泡在其中扮演重要角色(图1)。Diao等^[29]将人源间充质干细胞与骨关节炎软骨细胞共培养，发现骨关节炎软骨细胞可恢复部分表型，这提示间充质干细胞是通过旁分泌途径发挥损伤修复功能。虽然这种发挥修复作用的旁分泌物质是否为微囊泡尚未被证实，但大量研究证实了间充质干细胞源性微囊泡在各个领域的组织修复中发挥重要作用。有理由推测，间充质干细胞源性微囊泡将成为软骨损伤修复领域新的切入点。

相较于间充质干细胞的免疫双重性，间充质干细胞源性微囊泡则被证实可以诱导抗炎因子产生、抑制同体或异体淋巴细胞增殖、诱导活化T细胞凋亡及增加调节性T细胞的比例，从而有可能避免和抑制自身免疫反应^[30]，且更具有以下优点：①性质更稳定，便于贮存^[31]。②诱导信号更强烈，信息传递能力更强^[32]。③生物学功能不随时间延长而衰减^[33]。④无异源性风险，同种异源应用之后不会引起免疫反应^[22]。因此，应用间充质干细胞源性微囊泡进行关节软骨损伤修复具有更广阔的前景。

2.4 利用诱导性多潜能干细胞修复关节软骨损伤

2.4.1 诱导性多潜能干细胞概述 2006年，Takahashi等^[34]利用基因转染技术将Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4 4个基因导入小鼠成纤维细胞，成功将其重编程为诱导性多潜能干细胞。诱导性多潜能干细胞是通过各种载体介导方式将多个多能性相关基因或者化学物质导入成熟体细胞后，将成熟体细胞诱导成干细胞，其与胚胎干细胞在克隆形态、表面标志物、表观遗传学特征、基因表达模式、生长特性、畸胎瘤形成等多方面非常相似^[35]。此后，众多研究者利用不同导入、转染技术将各种体细胞重编程为诱导性多潜能干细胞，并证实了其具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特性。随着诱导性多潜能干细胞研究的深入，制备方法也在不断改善。近来，北京大学干细胞生物学家Hou等^[36]采用7个化合物组合成功构建出诱导性多潜能干细胞，命名为化合物诱导性多能干细胞。这种新方法避免了基因转染技术带来可能增加危险突变或癌变的风险，为制备诱导性多潜能干细胞提供了一种更安全有效的方法。

2.4.2 诱导性多能干细胞修复关节软骨损伤的研究现状迄今，已有大量研究证实诱导性多能干细胞具有关节软骨损伤修复作用。Zou等^[37]将特定的因子导入皮肤成纤维细胞，将其重编程为诱导性多能干细胞，并成功诱导分化形成透明软骨组织。2012年Diekman等^[38]报道利用成年小鼠成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞，诱导分化为软骨细胞，证实诱导性多能干细胞具有修复软骨缺损的潜力以及可用来建造匹配特定遗传背景的软骨模型。而且有研究证实来自骨关节炎患者的关节源性细胞也可以被重新编程诱导性多能干细胞^[39-40]，分化为软骨细胞并可以合成软骨基质，说明即使供体部位细胞不健全，依然可以作为诱导性多能干细胞来源。2014年9月，日本报道了世界首例利用诱导性多能干细胞分化的视网膜细胞移植手术，将患者的皮肤细胞重编程为诱导性多能干细胞，诱导分化为视网膜细胞移植入视网膜受损处^[41]。如果该患者术后可以维持眼睛功能且未发生癌变，预示诱导性多能干细胞实现临床应用已不远。此外，大量临床实验证实：将骨髓间充质干细胞直接注射至关节腔内可明显修复病损软骨组织，推测诱导性多能干细胞也可能应用于临床修复关节软骨损伤。

2.4.3 诱导性多能干细胞修复关节软骨损伤的应用前景诱导性多能干细胞相比于骨髓间充质干细胞，具有以下优势：①取材来源广泛，各种成熟体细胞均可重编程为诱导性多能干细胞。②增殖能力强。③取自患者自体成熟细胞，避免了免疫排斥等反应。④制备过程更易受控。随着诱导性多能干细胞的研究深入，在关节软骨损伤的模型构建、机制研究和细胞治疗方面都较骨髓间充质干细胞有优势。日本京都大学Yamashita等^[42]将软骨发育不全患者的皮肤细胞重编程为诱导性多能干细胞后，成功再现了软骨发育不全的特征，此后，研究小组发现降脂药斯达汀能有效促使诱导性多能干细胞分化为正常的软骨细胞。研究小组向软骨发育不全的小鼠腹部直接注射斯达汀，结果显示小鼠软骨可以正常成长。虽然目前临床试验尚未开展，药量、用药方法及不良反应仍然尚未明确，但诱导性多能干细胞无疑为治疗软骨发育不全提供了一种新的思路。建立关节软骨损伤特异性的诱导性多能干细胞模型将有助于加快研究其发病机制及寻找更有效治疗方法的步伐。

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