大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.025

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (41): 6699-6705.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.025

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

袁静¹，葛坚²，俞建雄³

¹武汉大学人民医院，¹眼科中心，³普外科，湖北省武汉市 430060；²中山大学中山眼科中心，眼科学国家重点实验室，广东省广州市 510060

出版日期:2015-10-01 发布日期:2015-10-01
作者简介:袁静，女，1976年生，湖北省恩施市人，回族，2004年华中科技大学同济医学院毕业，博士，副主任医师，副教授，主要从事干细胞与眼再生医学研究。
基金资助:
中山大学中山眼科中心眼科学国家重点室开放课题(303060202400306)“ASCL1信号在诱导神经干细胞向视神经细胞定向分化中的作用及机制”；国家自然科学基金青年基金(81100664)“17β-E2调控BMSCs向神经细胞分化及在青光眼视神经再生中的作用和机制”；武汉市青年科技晨光计划项目(2014070404010222) “miR-124调控诱导神经干细胞向视神经细胞定向分化和在青光眼视神经再生中的作用及机制”；武汉大学自主科研项目学科交叉类(2042014kf0259)“复合TFPI-2多肽凝胶药物控释系统在青光眼小梁切除手术中的应用及作用机制研究”

Construction and identification of a recombinant adenovirus vector expressing rat achaete-scute homology 1

Yuan Jing¹, Ge Jian², Yu Jian-xiong³

¹Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ²State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; ³Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Online:2015-10-01 Published:2015-10-01
About author:Yuan Jing, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
grants from the Open project of the State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, No. 303060202400306; the National Natural Science Foundation of China, No. 81100664; Wuhan Science and Technology Dawn Project, No. 2014070404010222; and Wuhan University Independent Research Project, No. 2042014kf0259

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子，因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰，有可能将成体细胞转分化为神经细胞，为视神经再生治疗提供新策略。
目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体，获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP，以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。
方法：用XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切；回收酶切质粒的目的片段进行连接，产物转化至 DH5α感受态；提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体，PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增，采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定，TCID50法测定病毒滴度，荧光显微镜观察病毒感染效率。
结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定，证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确，PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带，TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 神经母细胞特异性转移因子, 重组腺病毒载体, 增强型绿色荧光蛋白, 病毒滴度, 视神经再生, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have suggested that achaete-scute homology 1 (ASCL1) plays a key role in the neuronal commitment. Therefore, somatic cells may directly differentiate into neurons by gene transfection of ASCL1, which will provide new therapeutic strategies for optic nerve regeneration.
OBJECTIVE: To construct a recombinant adenovirus vector expressing rat ASCL1 gene for further research of ASCL1 gene function.
METHODS: The rat ASCL1 gene and advenovirus shuttle plasmid (pYr-adshuttle-4) which contained enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter gene were cleaved by restriction endonuclease Xho I and EcoR I. The target gene fragments were connected together to generate a recombinant plasmid pYr-ads-4-rat-ASCL1 and then transfected into E.coli DH5α. The plasmid was confirmed to be constructed as expectation by enzyme digestion and sequence reaction. The plasmid pYr-ads-4-rat-ASCL1 and pAd/PL-DEST were reconstructed by homologous recombination processes to obtain rat ASCL1 recombinant adenovirus vector. The plasmid pYrAd-rASCL1 was linearized by Pac I and subsequently transfected into HEK293 cells for packaging and amplification. Rat ASCL1 gene in the recombinant adenoviruses were identified by PCR. Virus titer was determined by tissue culture infectious dose 50. Infection efficiency was monitored by EGFP expression.
RESULTS AND CONCLUSION: Restriction endonuclease digestion and DNA sequencing showed that the recombinant adenovirus vector pAd-rat-ASCL1 was constructed correctly. The positive amplification bands of 862 bp could be seen in PCR analysis. The virus titer reached 2×1010 pfu/mL. Infection efficiency of recombinant adenovirus in HEK293 cells was more than 80%. The results indicate that the recombinant the adenovirus vector containing ASCL1 with high titer and infection efficiency has been successfully constructed, which can be helpful for further research of the function and clinical application of ASCL1 gene for optic nerve regeneration.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adenoviridae, Green Fluorescent Proteins, Optic Nerve, Tissue Engineering

袁静，葛坚，俞建雄. 大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6699-6705.

Yuan Jing, Ge Jian, Yu Jian-xiong. Construction and identification of a recombinant adenovirus vector expressing rat achaete-scute homology 1[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(41): 6699-6705.

图/表（结果） 5

2.1 酶切鉴定及DNA 测序将ASCL1基因克隆到pYr-adshuttle-4穿梭载体，加入kan培养，挑取阳性克隆，用EcoRⅠ及XhoⅠ对pYr-adshuttle-4-rat ASCL1行双酶切，可见泳道上分别切出6 428 bp 和714 bp大小的两个DNA片段，与预期结果相符(如图2所示)。

将酶切鉴定正确的pYr-adshuttle-4-rat ASCL1进行测序，并将测序报告与欲得到的目的序列用Dnassit 2.0对比软件进行对比，结果显示获得的rat ASCL1基因片段序列完全正确(如图3所示)。

重组穿梭质粒pYr-adshutte-4-rASCL1构建成功后，再通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/ PL-DEST腺病毒表达载体上，得到重组腺病毒载体pYrAd- rat-ASCL1-EGFP，用XbaⅠ单酶切重组质粒，酶切结果切出一条约550 bp和一条约4 kb的小条带，且大带大于8 kb (实际有3条大带，18 K，8 K，8 K，但是一般很难分开，所以看上去就是一条粗带) ，显示pAd-rat-ASCL1构建成功(如图4所示)。

2.2 重组腺病毒rAd-rat-ASCL1的鉴定用病毒基因组DNA提取试剂盒提取病毒DNA。由PCR鉴定结果可知，PCR反应得到862 bp的DNA片段，提示此腺病毒中有rat-ASCL1基因，而且hEF1a启动子和CMV启动子也在，说明相关表达框都在，证实rAd-rat-ASCL1包装成功(如图5所示)。

2.3 重组病毒rAd-rat-ASCL1的病毒滴度及转染效率测定重组腺病毒经放大培养扩增及纯化后，采用TCID50法测定rAd-rat-ASCL1病毒滴度均为2×10¹⁰ pfu/mL。重组腺病毒rAd-rat-ASCL1携带有荧光标记基因EGFP，转染HEK293细胞后于倒置相差显微镜下观察EGFP的表达，计算出病毒的感染效率为80%以上(如图6所示)。

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引言

材料方法

1.1 设计分子生物学观察实验。

1.2 时间及地点于2011年8月至2012年8月在武汉大学人民医院眼科中心实验室完成。

1.3 材料目的基因ASCL1由南京金斯瑞生物技术公司合成(目的基因长714 bp)；目的载体pYr-adshuttle-4(带EGFP 标记，质粒大小6 428 bp)为武汉巴菲尔公司提供；DH5α菌为本室保存。引物合成、测序由南京金斯瑞生物技术公司完成。

1.4 方法

重组穿梭质粒pYr-adshutte-4-rASCL1的构建及鉴定：由南京金斯瑞合成基因rat ASCL1，两端加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，将合成的rat ASCL1及目的载体pYr-adshuttle-4用EcoRⅠ/ XhoⅠ进行分别双酶切(图1)，酶切反应体系为：10×H Buffer 2 μL，XhoⅠ 1 μL，T-rat ASCL1/EcoRⅠ：17 μL及载体pYr-adshuttle-4/EcoRⅠ各17 μL，加入dH₂O溶解。酶切反应条件为37 ℃反应5 h。15 g/L琼脂糖凝胶回收纯化。将回收纯化的片段rat ASCL1 (EcoRⅠ/XhoⅠ)与回收纯化的载体pYr-adshuttle-4 (EcoⅠ/XhoⅠ) 进行连接，反应体系为T₄ DNA Ligase 1 μL、5× T₄ DNA Ligase Buffer 2 μL，载体pYr-adshuttle-4 (EcoRⅠ/XhoⅠ) 1 μL，外源片段rat ASCL1(EcoRⅠ/XhoⅠ) 6 μL。R

连接产物pYr-adshuttle-4-rat ASCL1转化DH5a感受态细胞，涂布LB Kan+平板，37 ℃温箱培养过夜，挑取单个菌落，接种于LB Kan+液体培养基中，37 ℃ 250 r/min培养过夜。用小提试剂盒小提质粒，酶切鉴定，测序比对。

重组腺病毒质粒pAd-rat-ASCL1的构建及鉴定：通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST 腺病毒表达载体上。LR体外同源重组反应体系：pYr-ads-4-rat-ASCL1 3 μL，pAd/PL-DEST(0.25 g/L) 0.5 μL， LR Clonase Ⅱ (Invitrogen) 2 μL，TE Buffer (pH 8.0) 4.5 μL共10 μL在25 ℃条件下反应1 h。加入1 μL蛋白酶K，37 ℃反应15 min消化重组酶。将10 μL上步反应产物转化感受态细胞DH5а，涂布于含Amp^r抗性(终浓度为 100 mg/L)的LB平板上，37 ℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上随机挑取若干个单克隆菌落接种于5 mL含Amp^r抗性(终浓度为100 mg/L)的LB培养液中，37 ℃恒温摇床(250 r/min)培养过夜。提取质粒，对提取的质粒进行XbaⅠ单酶切鉴定。

ASCL1基因重组腺病毒载体构建实验主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Taq DNA Polymerase	TIANGEN
dNTP	NEB
PCR 酶、EcoRⅠ和XhoⅠ酶、GC Buffer Ⅰ	TAKARA
DL2000、DL15000	TIANGEN
腺病毒包装系统、Marker	长沙赢润生物技术有限公司
T₄ DNA Ligase	TRANS
质粒小提质粒盒、胶回收试剂盒、RNA 提取试剂盒、cDNA 第一链合成试剂盒和RNase 抑制剂	北京天根生物技术有限公司
HEK 293	ATCC
培养基、胎牛血清、胰酶(Trypsin-EDTA)	Invitrogen
METAFECTENE™	美国Biontex 公司
细胞培养皿、细胞培养瓶	Corning
PCR扩增仪	北京东胜创新生物科技有限公司
水平电泳仪、紫外分析仪	北京君意东方电泳设备有限公司
CO₂恒温培养箱	SANYO
荧光倒置显微镜	OLYMPUS
低温高速离心机	湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
电热恒温培养箱	黄石市恒丰医疗器械有限公司

重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP的包装及扩增：用PacⅠ线性化重组腺病毒质粒，反应体系为10×Neb Buffer1 3 μL，10×BSA 3 μL，PacⅠ(10 unit/μL)1 μL，pAd-rASCL1 5 μg，加入dH₂O溶解至30 μL于37 ℃水浴反应3 h。在连接产物中加入70 μLTE缓冲液(pH 8.0)及100 μL酚：氯仿：异戊醇并混匀，15 000 r/min离心5 min，转移上清至一干净的1.5 mL EP管中，加入10 μL 3 mol/L NaOAc混匀，再加入350 μL无水乙醇混匀，于-70 ℃冰箱放置15 min， 15 000 r/min离心15 min，体积分数70%乙醇洗涤2遍，敞口放置15 min至乙醇完全挥发，然后用10 μL双蒸H₂O充分溶解。将PacⅠ线性化的腺病毒DNA转染HEK 293细胞进行包装和扩增。

提前12-24 h在一个60 mm培养瓶里种1.5×10⁶个HEK293细胞。使用METAFECTENE™(Biontex公司)，依照说明书，按DNA∶lipid=1∶3的比例对达到50%-70%融会度的HEK293细胞进行转染。转染后24 h换培养基为体积分数10%胎牛血清的完全培养基。转染3 d后每天观察细胞病态反应，当细胞有明显的细胞病态反应现象，且有> 50%脱壁时即收细胞，再对细胞进行裂解收病毒。将上步的裂解上清继续感染HEK293，大量扩增培养重组腺病毒。

重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP的鉴定：从以上步骤的细胞裂解液中取20 μL，用病毒基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)提取病毒DNA。以提取的腺病毒DNA为模板进行PCR反应。引物对：rat-ASCL1-862-f：5’-CTC ACG AAG CTA GCG TTG A-3’(此引物横跨hEF1a启动子和CMV启动子)，rat-ASCL1-862-r：5’-TTG GCC GCT GAC TTG TGA-3’(此引物在rat-ASCL1上)，扩增产物为862 bp，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，rTaq (Takara) 0.25 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，rat-ASCL1-862-f (10 μmol/L) 0.5 μL，rat-ASCL1-862-r (10 μmol/L) 0.5 μL，病毒DNA 2 μL，加入dH₂O溶解至25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 55 s，循环30周，72 ℃延伸3 min。

设置pYr-ads-4-rat-ASCL1为阳性对照。HEK293细胞中反转录出的cDNA为阴性对照，电泳后紫外灯下拍照并进行分析。

重组病毒rAd-rat-ASCL1的病毒滴度及转染效率测定：采用半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)方法测定病毒滴度，根据Karbers公式计算病毒滴度，即出现细胞病态反应的孔数和出现细胞病态反应的孔率。病毒滴度测定后于-80 ℃下分装保存备用。利用腺病毒中的EGFP示踪测定重组腺病毒的转染效率。分别于转染后24，48，72，96 h，于倒置相差显微镜下观察EGFP的表达。

采用传统人工计数方法计算转染效率，以表达EGFP的细胞为转染阳性细胞，根据以下公式计算转染效率：转染效率=EGFP阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 主要观察指标 ①重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1- EGFP的构建和酶切鉴定。②重组腺病毒pAd-rat-ASCL1在HEK293细胞内的包装、鉴定、纯化及滴度、转染效率的测定。

讨论

视神经视网膜变性病变，诸如青光眼、老年性黄斑病变等，是一类由于视网膜神经细胞损伤引起的严重不可逆性视功能障碍疾病，其最终共同结果是视神经细胞进行性死亡[19-26]，目前临床上主要是在祛除病因的前提下，根据各种原因及不同环节，采用手术(如降眼压等)或药物(如神经生长因子、中药等)来防止细胞凋亡或死亡，以达到视功能保护的目的。这种传统方法虽能遏制部分早期视神经疾病的发展，但对于大部分视神经细胞已严重损害的中晚期患者，由于视神经细胞的不可再生性，使这类疾病的治疗用目前的技术难以取得突破。
近年来，干细胞研究已取得了重大进展，尤其是诱导多能干细胞的诞生具有划时代意义[27-36]，它提示在合适的条件下体细胞中已经关闭的诱导分化调控基因仍可重新开放，否定细胞决定，改变细胞分化的特定方向，进行转决定。这提示将临床上相比于成体干细胞更易获取的成体皮肤细胞作为靶细胞，通过关键转录因子，可能跨越诱导多能干细胞直接转化为视网膜神经干细胞进行视神经再生治疗，可能解决长期困扰人们的种子细胞来源困难、免疫排斥及伦理学等问题，为临床应用提供更为便捷、高效的途径。因此，如何将成体细胞直接转化为神经细胞，提高成体细胞的转化效率，是目前神经眼科学有前景的研究方向。
研究证实，神经的正常发育受细胞基因表达的时空调控和它所处周围环境因素影响和决定，在这些因子中，ASCL1是神经发育过程中的关键调控因子[8]。ASCL1是一种由ASCL1基因编码的蛋白质，又名MASH1(ASH1，HASH1，bHLHa46)。ASCL1是碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)转录调控因子家族中的重要成员，含有能与启动子E-BOX(CACCTG序列)特异性结合的结构域，与E蛋白结合启动子下游基因的转录，并通过Hedgehog、Notch/Delta、BMP和Wnt/β-catenin等一系列信号途径调控神经的发生[37-39]。ASCL1首先是从大鼠交感性肾上腺前体细胞株中克隆得到[40]。人类ASCL1基因编码区全长约711 bp，位于第12号染色体长臂12q23.2，编码有236个氨基酸组成的相对分子量为 34 000的肽链。体外研究表明，ASCL1促使胚胎皮质前体细胞和胚胎干细胞向神经元分化[9]，并有效促进成体皮肤细胞发育分化为神经干细胞[10]。在视网膜发育过程中，ASCL1对视网膜干细胞向神经元分化和特定神经元亚型选择性分化起关键调控作用，诱导神经元特异性基因表达，并抑制胶质特异性基因的表达[41]。由此设想，ASCL1作为视觉神经发育过程中的关键转录信号，若对成体细胞进行基因修饰，有可能作为一种高效诱导剂调控成体细胞向神经细胞的转决定，为视神经修复治疗提供更为便捷、高效的种子细胞。
如何将目的基因有效地转入细胞，首先需要选择基因转染的载体。常用的基因转移载体包括非病毒载体和病毒载体。非病毒载体较病毒载体安全，且容易制备，但转染效率低。病毒载体包括慢病毒、腺相关病毒和腺病毒载体等。慢病毒载体介导的基因虽然转染效率高、载体容量大，但安全性值得考虑。腺相关病毒载体介导的基因虽然表达时间长，但缺乏对特定细胞的亲和力。而腺病毒载体因为具有宿主范围广、病毒滴度高、基因转染效率高、载体容量大、安全性高、且限于特定时空的基因表达等优势，是目前基因修饰的首选载体之一[18]。但腺病毒载体要构建成功，其难点在于如何将外源基因表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大，且载体中酶切位点较多，若使用常规的酶切-连接方式很难将外源基因表达框成功构建至腺病毒骨架载体上。
因此，本研究采用同源重组的方法将外源基因的表达框构建至腺病毒骨架载体上。实验中，采用目前最先进的第2代腺病毒包装系统的BLOCK-iT 系统，该系统包括pYr-adshuttle-4穿梭载体(携带EGFP标记基因)和pAd/PL- DEST骨架载体。
采用pYr-adshuttle-4穿梭载体质粒作为真核表达载体具有明显的优势：①pYr-adshuttle-4载体质粒为“松弛控制型”质粒，相对于在每个宿主细胞中仅有1-3份拷贝的“严谨控制型”质粒，它在每个宿主细胞中可具有高达10-60份的拷贝数，能实现ASCL1基因的高拷贝表达。② pYr-adshuttle-4质粒大小为6 428 bp，分子量小，不足理想质粒大小上限15 kb的一半，有利于外源基因的插入与操作。③pYr-adshuttle-4质粒含有卡那霉素(Kanr)和新霉素(Neor)抗性基因选择标记，有利于质粒转化后克隆的筛选。④pYr-adshuttle-4质粒含有EcoRⅠ和XhoⅠ等多个单一酶切位点，可有选择性地供ASCL1基因插入。⑤pYr-adshuttle-4质粒为双基因表达框结构，可以同时表达两个基因，且两个基因不会互相干扰，启动子均为强启动子，一为CMV启动子，一为hEF1a启动子，hEF1a后已插入报告基因EGFP，CMVp后可供目的基因ASCL1插入，EGFP蛋白为增强型绿色荧光蛋白，为后续判断重组质粒转染效率提供依据。
重组穿梭质粒pYr-adshutte-4-rASCL1构建成功后，再通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL- DEST腺病毒表达载体上，得到重组腺病毒载体pYrAd-rat- ASCL1-EGFP，与其他腺病毒表达系统相比，这种LR重组酶体外重组更加方便、快速，重组效率更高。重组后的腺病毒载体经PCR证实包含rat-ASCL1基因，提示rAd-rat-ASCL1构建正确。经HEK293细胞包装、放大培养、扩增纯化，重组腺病毒表达载体法测定的最终病毒滴度为2×1010 pfu/mL，HEK293细胞的感染效率为80%以上，提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功，获得的病毒具有高滴度，高效感染率，为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

Construction and identification of a recombinant adenovirus vector expressing rat achaete-scute homology 1

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