人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)具有加强细胞增殖能力、保持端粒长度恒定、延长体外培养细胞寿命等作用。
目的：观察hTERT基因转染骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响。
方法：建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，随机分为脑梗死组、骨髓间充质干细胞移植组和hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组，每组20只，分别于尾静脉注射1 mL PBS，1 mL第9代骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.5×107 L-1)和第9代hTERT基因转染骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.5×107 L-1)。于移植前及移植后对各组大鼠进行改良神经功能学评分，应用RT-PCR、Western Blot检测梗死脑组织中hTERT基因及蛋白表达的变化，TUNEL法测定脑组织中细胞凋亡情况。
结果与结论：hTERT基因转染骨髓间充质干细胞的细胞生长周期明显延长，随着传代次数的增加，细胞生长良好，无明显形态改变；hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的hTERT基因及蛋白表达明显优于骨髓间充质干细移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与脑梗死组及骨髓间充质干细胞移植组比较，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的神经功能缺损评分明显降低，脑组织中凋亡细胞数目明显减少(P < 0.05)。结果显示hTERT基因转染骨髓间充质干细胞能促进脑梗死大鼠神经功能恢复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, hTERT基因, 大鼠, 脑梗死, 干细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human telomerase reverse transcriptase (hTERT) has the ability to enhance cell proliferation, maintain telomere length, prolonged cell life cultured in vitro.
OBJECTIVE: To observe the effect of hTERT gene-modified bone marrow mesechymal stem cell transplantation on neural function recovery of rats with cerebral infarction.
METHODS: Rat models of middle cerebral artery occlusion were established and randomized into model group, cell transplantation group and hTERT-modified cell transplantation group, with 20 rats in each group. Rats in the three groups were respectively injected via tail vein with 1 mL PBS, passage 9 bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×107/L) and hTERT-modified passage 9 bone marrow mesenchymal stem cell suspension (2.5×107/L), respectively. Modified neurological severity scores were determined before and after transplantation; RT-PCR and western blot assay were used to measure hTERT expression at gene and protein levels; TUNEL method was adopted to detect cell apoptosis in the brain.
RESULTS AND CONCLUSION: hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells had prolonged cell
cycle, and with the increase in passage number, the cells showed good growth with no changes in morphology. The expressions of hTERT mRNA and protein were superior in the hTERT-modified cell transplantation group than the cell transplantation group, and there was a significant difference (P < 0.05). Modified neurological severity scores and number of apoptotic cells were decreased significantly in the hTERT-modified cell transplantation group compared with the other two groups (P < 0.05). These findings indicate that hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells can promote neural functional recovery of rats with cerebral infarction.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Brain Infarction, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

孙晶晶，宋乃光，张耀龙，高淑焕，孙彩悦，薛建，贺永贵，习瑾琨，张国彬. 人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6665-6670.

Sun Jing-jing, Song Nai-guang, Zhang Yao-long, Gao Shu-huan, Sun Cai-yue, Xue Jian, He Yong-gui, Xi Jin-kun, Zhang Guo-bin. Human telomerase reverse transcriptase gene-modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for cerebral infarction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(41): 6665-6670.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验共选取65只Wistar大鼠，其中1只大鼠用于骨髓间充质干细胞培养，其余64只大鼠进行造模，造模过程中死亡4只，最终进入结果分析60只大鼠。2.2 骨髓间充质干细胞及hTERT转染骨髓间充质干细胞形态镜下可见培养四五天时的骨髓间充质干细胞呈亮点状、贴壁生长。7 d时的骨髓间充质干细胞呈多角形、纤维状、长梭形，有明显集落生成。传代3次后骨髓间充质干细胞呈漩涡状，贴壁细胞分布均匀，细胞形态渐趋于一致，胞体较饱满、以梭形为主。传代9次后骨髓间充质干细胞形态呈宽大状，生长缓慢(图1A)，而hTERT转染骨髓间充质干细胞在第40代时，细胞形态及生长特性良好，无明显变化，依旧保持了长梭形的细胞形态生长(图1B)。

2.3 细胞周期流式细胞仪检测结果显示，1-12代的骨髓间充质干细胞中G₀/G₁期细胞比例逐渐增多，S期及G₂/M期细胞明显减少，表明骨髓间充质干细胞的增殖能力有减弱趋势；而1-12代的hTERT转染骨髓间充质干细胞中G₀/G₁期细胞亦逐渐增多，S期及G₂/M期细胞亦逐渐减少，但差异无显著性意义(P > 0.05)，表明hTERT转染骨髓间充质干细胞的增殖能力随着传代次数的增加并无显著减弱(表1)。

2.4 RT-PCR检测hTERT mRNA的表达骨髓间充质干细胞移植组脑组织中hTERT mRNA的表达逐渐降低，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的hTERT mRNA表达较稳定，明显优于骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.5 Western blot检测hTERT蛋白表达骨髓间充质干细胞移植组脑组织中hTERT蛋白表达逐渐降低，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的hTERT蛋白表达较稳定，明显优于骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.6 各组大鼠不同时间点的神经功能评分治疗后1-3周，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的神经功能缺损评分明显低于脑梗死组及骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，图4。

TUNEL法检测细胞凋亡数目 TUNEL法检测结果显示，脑梗死组可见大量呈棕黄色的凋亡细胞，周围组织呈蓝黑色为正常神经元细胞。在骨髓间充质干细胞移植组和hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组中凋亡细胞数目明显少于脑梗死组，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组又明显少于骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义 (P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年1月至2015年2月在华北煤炭医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级健康Wistar大鼠65只，7-9 d龄，雌雄不限，体质量13.5-15.5 g，由华北煤炭医学院动物实验室提供，动物质量合格证号：SCXK(冀)2009-0004。饲养于20-22 ℃恒温，50%左右湿度环境中，实验前1 d禁食不禁水。

1.3.2 主要试剂、仪器胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM培养基(北京天根生化有限公司)，胰蛋白酶(美国Santa Cruz公司)，mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒(Sigma公司)， RT-PCR两步法试剂盒(大连宝生生物公司)，MMLV试剂盒(美国Promega公司)，AMV反转录试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)，Western blot反转录试剂盒(TaKaRa公司)，cDNA合成试剂盒(杭州博日)，兔抗鼠hTERT多克隆抗体、β-actin兔抗鼠多克隆抗体(美国Coulter公司)，辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体(福州迈新生物技术开发有限公司)，电泳仪、转膜仪(美国Contnental Lab Products公司)，荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，二氧化碳培养箱(Thermo Forma公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养取1只7-9 d龄Wistar大鼠，于麻醉状态下处死，全身浸入体积分数为75%乙醇中浸泡10 min。无菌操作下分离双侧胫骨、股骨，剪除骨骺端，用10号注射器吸取1 mL DMEM完全培养基反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，按3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到100 mL培养瓶中，放置到37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，24 h后进行第1次全量换液，以后每3 d换液1次，并按1︰2比例进行传代，逐日观察细胞的生长状况，观察到细胞的融合率达80%-90%时，按1︰3比例进行再次传代。通过多次传代、扩增及培养，使骨髓间充质干细胞逐渐纯化。

1.4.2 通过脂质体法将hTERT基因转染入骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞经体外培养扩增传代至第1，3，6，9，12代时，弃掉上清液，在无血清培养基中培养24 h后采用脂质体法转染质粒PCI-neo-hTERT，按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂说明书进行，转染28 h加入最佳浓度的G418进行筛选，直至出现阳性细胞克隆，收获细胞进行各项指标检测。

1.4.3 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞生长周期收集第1，3，6，9，12代骨髓间充质干细胞和hTERT转染骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为1×10⁶ L^-¹，采用冷PBS洗涤2次后，用体积分数为70%的冷乙醇(4 ℃)固定24 h，与含10 mg/L RNA酶的pH=7.4的Tris-HCL缓冲溶液共同孵育30 min。用碘化丙啶(50 mg/L)进行细胞DNA染色，放置暗室中1 h，流式细胞仪检测细胞DNA含量的分布，并计算出各周期细胞所占的百分比。

1.4.4 动物模型的建立和分组

模型建立：采用改良的Zea-Longa法制作大脑中动脉阻塞模型，将64只健康Wistar大鼠，以10%水合氯醛 4 mL/kg麻醉后，保留自主呼吸，仰卧位固定于手术台上，常规颈部备皮、消毒铺巾。颈部正中做一切口，小心逐层分开、游离右侧的颈总、颈内及颈外动脉，避免刺激迷走神经。在颈总、颈外、颈内动脉上分别放置一根3-0丝线，结扎颈内动脉上放置的丝线，于颈外、颈内分叉处5 mm结扎颈总动脉，结扎颈外动脉根部，将一末端用乙醇灯烧成圆头的尼龙线置入颈总动脉分叉处入颈内动脉18 mm，直至稍遇阻力感立即停止，阻断相应部位的血液供应。

动物分组和干预：将造模成功的60只大鼠随机分为脑梗死组、骨髓间充质干细胞移植组和hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组，每组20只。造模后28 h，骨髓间充质干细胞移植组和hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组于尾静脉注射1 mL第9代骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.5×10⁷ L^-¹)和第9代hTERT基因转染骨髓间充质干细胞悬液(细胞浓度2.5×10⁷ L^-¹)，脑梗死组尾静脉注射1 mL PBS。

1.4.5 神经行为学功能评分细胞移植前及移植后1，2，3周进行改良神经功能缺损评分(mNSS)，评分内容包括运动、感觉、平衡和反射4个部分，总分为18分，正常大鼠为0分，评分越低说明大鼠的神经行为学功能越好，评分越高，说明神经功能障碍越严重。

1.4.6 RT-PCR检测hTERT mRNA的表达细胞移植后3周，每组取5只大鼠梗死脑组织50 mg，制备匀浆，加入Trizol核酸提取液，提取脑组织总RNA^[9]，利用紫外分光光度仪测定RNA含量，根据MMLV试剂盒操作步骤将RNA反转录成cDNA，再将DNA进行PCR，引物序列：hTERT上游引物为5’-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TTT -3’，下游引物为5’-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA -3’，产物大小111 bp；β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，产物大小151 bp。PCR反应条件：95 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃40 s，72 ℃30 s，循环36个周期，72 ℃延伸 7 min。每一PCR反应重复3次，PCR产物于4 ℃保存。取PCR扩增产物进行电泳，用GDSS000凝胶自动成像仪分析系统对电泳结果进行分析，计算hTERT产物与β-actin产物的积分吸光度比值即为hTERT mRNA的相对表达水平。

1.4.7 Western blot检测hTERT蛋白的表达将上述RT-PCR的提取物离心30 min，取上清为粗提蛋白质，采用Bradford法检测hTERT蛋白的浓度。以5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃下摇床封闭2 h，洗膜3次(每次10 min)，以1︰200比例将兔抗鼠hTERT多克隆抗体、β-actin兔抗鼠多克隆抗体稀释溶于TBST中，室温下培育60 min；采用TBST洗膜3次(每次10 min)，放入1︰500稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG抗体，室温下培育60 min；TBST洗膜3次(每次10 min)，DAB显色，应用GDSS000凝胶自动成像系统扫描，以Quantity one软件分析，通过目的条带与β-actin条带的吸光面积比值来评定蛋白的表达水平。

1.4.8 TUNEL法检测脑梗死组织凋亡细胞数目细胞移植后3周，采用改良TUNEL法检测脑梗死组织凋亡细胞数目。每组取5只大鼠，采用水合氯醛麻醉后，取梗死脑组织，经40 g/L多聚甲醛灌流固定，脑组织切片经常规石蜡包埋、脱蜡后，体积分数为70%乙醇浸泡清洗3 min，再用PBS冲洗3次，每次5 min，于蛋白酶K溶液(20 mg/L)中室温培养10 min，PBS冲洗3次，每次5 min，于37 ℃的BSA溶液湿盒中密闭15 min，入平衡缓冲液平衡10 min，于37 ℃ TdT酶反应液中密闭状态下培育1 h，于室温下辣根过氧化物酶溶液中反应 20 min，PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色后用清水冲洗；树脂胶封固，室温干燥，荧光倒置显微镜下观察，胞核呈棕黄色颗粒即为TUNEL阳性细胞。

1.5 主要观察指标 ①神经功能缺损评分。②hTERT mRNA和蛋白的表达。③脑梗死组织凋亡细胞数目。

1.6 统计学分析采用SPSS 13.0软件包进行处理，计量资料以x(_)±s表示，组间连续变量比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近些年来，脑梗死的发病率逐渐增高，给社会、家庭都带来很大损失和沉重负担[10-14]。促进脑梗死后神经功能修复一直是神经学科专家们急需解决的关键问题，近几年来神经再生修复问题亦备受关注。脑梗死后神经细胞的凋亡、神经营养因子的缺乏等不利因素阻碍了神经功能的自发修复[15-17]。骨髓间充质干细胞作为一种替代治疗方式，为脑梗死等神经系统疾病的治疗提供了一种新思路。
通常情况下骨髓间充质干细胞在体外经过多次的培养、传代后，细胞会逐渐失去增殖能力，出现生长缓慢，有丝分裂停滞，逐渐衰老、死亡现象，因此，延长细胞的生长周期，使细胞永生化是目前学术界探讨的一个重点问题[18-20]。研究发现，端粒酶在激活后能够持续合成端粒DNA，端粒DNA可以补充细胞每次分裂时丢失的端粒序列，使端粒的有限长度得到延伸，端粒酶能阻止染色体端粒的降解，增强细胞的增殖能力及无限分裂能力，延长细胞寿命，诱导细胞获得永生化，其在细胞衰老过程中起关键作用[21-23]。hTERT是调节端粒酶活性的关键因素[24-27]，将 hTERT导入细胞中，可使细胞内的端粒酶激活，促进端粒酶发挥永生化作用。Abdallah等[28]将hTERT成功转染入骨髓间充质干细胞，在体外经过3周的培养，骨髓间充质干细胞依然具有良好的分化能力和增殖能力，仍然能保持稳定的生长状态。
研究结果显示，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的hTERT基因及蛋白表达明显优于骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义，表明hTERT基因成功的转染入骨髓间充质干细胞，且能在mRNA及蛋白水平上呈现稳定的高表达。治疗后不同时间点hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的神经功能缺损评分明显低于脑梗死组及骨髓间充质干细胞移植组，差异有显著性意义，表明转染了hTERT的骨髓间充质干细胞移植到脑梗死模型后，能更好地促进神经功能恢复。通过流式细胞仪检测结果得知，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的细胞生长周期明显延长，随着传代次数的增加，细胞生长良好，无明显形态改变，表明hTERT对骨髓间充质干细胞具有无限生长增殖的潜力，可使骨髓间充质干细胞永生化。通过TUNEL法测定结果显示，hTERT转染骨髓间充质干细胞移植组的凋亡细胞数目明显少于脑梗死组及骨髓间充质干细胞移植组，进一步表明转染了hTERT的骨髓间充质干细胞移植入脑梗死模型后，能促进脑梗死大鼠神经元细胞的修复，抑制其凋亡。
综上所述，将hTERT基因成功转染入骨髓间充质干细胞，可使骨髓间充质干细胞的增殖能力得到增强，促进骨髓间充质干细胞永生化。相信随着分子学生物技术的发展，以及对hTERT基因永生化机制的进一步研究，转染hTERT的骨髓间充质干细胞移植将会为脑梗死后神经修复、再生以及功能恢复提供更好的素材，且永生化的骨髓间充质干细胞对多种疾病的治疗均具有深远意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程