CT灌注成像评价神经干细胞移植脑梗死模型大鼠的神经功能恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：CT灌注技术是目前临床上较为常用的无创检查方法，可以早期定量检测到脑梗死组织的缺血程度及范围，进而判断脑组织成活与否及其可恢复性。
目的：应用CT灌注技术评价神经干细胞移植脑梗死大鼠的神经功能恢复情况。
方法：60只SD大鼠中随机分为对照组、脑梗死组、移植组，每组20只，后两组制备大脑中动脉梗死模型，建模后24 h，脑梗死组通过尾静脉注射PBS，移植组注射8×105个神经干细胞。分别于细胞移植后的1，3，7，14，28 d行CT灌注成像，移植后1，2，3，4周采用mNSS进行神经功能评分，移植后4周TTC染色计算各组的脑梗死体积，移植后2周苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化。
结果与结论：对照组在各个时间点血流动力学未见明显异常，移植组的CT值随时间变化逐渐升高，脑血流量的升高可以增加缺血半暗带神经细胞的存活率。移植组的神经功能评分低于脑梗死组，梗死体积小于脑梗死组(P < 0.05)，移植组梗死灶细胞变性坏死程度明显减轻。结果表明CT 灌注成像能够从形态学及血流动力学方面观察神经干细胞移植脑梗死大鼠的神经功能恢复情况。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, CT成像技术, 脑梗死, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: CT perfusion technology is a common non-invasive detection method, which can be used to quantitatively determine the ischemia severity and range at early stage of cerebral infarction and then judge whether ischemic brain tissues can survive or recover.
OBJECTIVE: To assess the neurological function recovery of cerebral infarction rats undergoing neural stem cell transplantation using CT perfusion imaging.
METHODS: A total of 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group, cerebral infarction group, transplantation group, with 20 rats in each group. Rat model of middle cerebral artery occlusion was made in the latter two groups. After 24 hours of modeling, PBS and 8×105 neural stem cells were administrated via the tail vein into the rats in the cerebral infarction and transplantation groups, respectively. CT perfusion-weighted imaging was performed at 1, 3, 7, 14, 28 days after transplantation. Modified neurological severity scores were recorded at 1, 2, 3, 4 weeks after transplantation. Triphenyltetrazolium chloride staining was used to calculate infarct volume at 4 weeks after transplantation. Hematoxylin- eosin staining was adopted to observe pathological changes of brain tissues at 2 weeks after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no abnormal hemodynamic changes in the control group at different time points. The transplantation group exhibited an increasing CT value with time, and the increased cerebral blood flow could improve the survival rate of neurons in the ischemic penumbra. The modified neurological severity score and infract volume in the transplantation group were both significantly lower than those in the cerebral infarction group (P < 0.05). Cell necrosis was improved obviously in the transplantation group. These results show that CT perfusion imaging can be used to observe the neurologic function recovery of cerebral infarction rats in aspects of morphology and hemodynamics.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Brain Infarction, Tomography, Spiral Computed, Perfusion Imaging, Neural Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李映雪，高雪雷. CT灌注成像评价神经干细胞移植脑梗死模型大鼠的神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(41): 6654-6658.

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图/表（结果） 6

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2013年5月至2014年12月在河北医科大学中心实验室完成。

1.3 实验动物及材料健康SD大鼠65只，雌雄不限，1月龄，体质量200-220 g，购于河北医科大学动物实验室，饲养条件：湿度保持在50%左右，温度控制在20-22 ℃，自由饮水和进食，于实验前1 d禁食不禁水。

CT灌注技术评价神经干细胞移植后脑梗死模型大鼠神经功能恢复实验所用主要试剂和设备：
试剂和设备	来源
DMEM/F12	美国KPL公司
胎牛血清	美国Becon Dickinson公司
25%胰蛋白酶	Gibco BRL公司
β-actin兔抗鼠多克隆抗体	迈新公司
辣根酶标记山羊抗兔IgG 抗体	美国Santa Cruz 公司
一抗兔抗鼠NSE多克隆抗体	美国New Jersey公司
超净工作台	苏州安泰空气技术公司
荧光倒置显微镜	德国 Leica 公司
螺旋CT机	Siemens Somatom Sensation

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的分离培养及标记随机取SD大鼠1只，麻醉状态下处死，用体积分数为75%乙醇浸泡行全身消毒，取出脑组织，剪成1 mm³的碎块，PBS洗涤2遍，添加至DMEM/F12完全培养液中，经吸管反复吹打，过滤制成单细胞悬液。以1 200 r/min离心5 min收集细胞，用含体积分数为1%胎牛血清培养液重悬，按 2×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培育。逐日观察生长情况，3 d时进行半量换液，5 d后有少量集落细胞形成，当有较多神经球形成时，可进行细胞传代，每4-7 d 传代1次。吸取少量培养至第3代的细胞悬液，加入含BrdU的培养基进行标记，并对形成的神经球行Nestin免疫组织化学染色。

1.4.2 动物模型的建立和分组干预

动物模型的建立：利用线栓法制作脑梗死模型。大鼠经2.5%氯胺酮腹腔注射麻醉后，俯卧位下颈正中做一切口，分别游离右侧的颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉下方制作“v”形切口，用明胶处理过的1.8号鱼线经切口插入右颈内动脉，进线深度为17.0-18.0 mm，结扎颈内动脉，以完全阻断血供。缝合皮肤，大鼠即刻出现右侧Horner征为制作模型成功的标志。

实验分组及干预：64只大鼠中随机取20只作为对照组，剩余44只参与造模，在建模过程中失败2只、死亡2只，将剩余建模成功的40只大鼠随机分为脑梗死组和移植组。建模后24 h，脑梗死组通过大鼠尾静脉注射PBS，移植组通过大鼠尾静脉注射含8×10⁵个神经干细胞的细胞悬液。

1.4.3 CT灌注成像检查分别于移植后1，3，7，14，28 d行CT灌注成像，采用Siemens Somatom Sensation 64排CT扫描机，扫描参数为：矩阵512×512，管电压80 kV，管电流300 mA，视野200 mm×200 mm，层厚5 mm，层距5 mm，进行大鼠大脑连续冠状位动态灌注扫描。图像经CT Peffusion中的BrainStroke软件处理，选择同一平面对称部位约1.5 mm²范围内测定各组大鼠两侧大脑中动脉供血区的CT值，求出两者的差值。

1.4.4 采取mNSS评分观察各组大鼠的神经行为学改善情况于移植前及移植后1，2，3，4周对3组大鼠进行神经行为学评分。评分内容为运动、感觉、平衡和反射4个部分，总分为18分，正常大鼠为0分，评分越低表明大鼠的神经行为学功能越好，评分越高，表明神经功能障碍越严重。

1.4.5 通过TTC染色计算上述3组大鼠的脑梗死体积在评分结束后，每组随机取3只大鼠，麻醉状态下处死取脑，放置于-20 ℃冷冻10 min。以大脑冠状面作平均厚度为 2 mm的切片，浸入TTC溶液中，37 ℃避光孵育20 min，于40 g/L多聚甲醛液中固定24 h。大鼠脑组织切片中正常脑组织着红色，而梗死灶区域无着色，采用Image pro plus(IPP)图像分析软件，计算脑梗死体积。梗死体积=正常大脑侧体积－梗死侧未梗死区域体积，脑梗死体积百分比=梗死体积/全脑体积×100%。

1.4.6 苏木精-伊红染色观察脑组织病理变化于移植后2周在各组内随机取5只大鼠，水合氯醛麻醉下处死，取梗死处脑组织置于100 g/L多聚甲醛液中，室温下固定24 h。用切片机对脑组织标本皮质进行连续冠状切片，片厚3.0-4.0 μm，置60 ℃烤箱内恒温4-6 h，使切片紧密黏附，常规脱蜡后蒸馏水洗2 min，伊红染色1.0-2.0 min，中性树脂胶封固，于室温下干燥，荧光显微镜观察脑组织病理学形态变化。

1.5 主要观察指标 ①CT灌注成像特征。②神经行为学改善情况。③脑梗死体积。④脑组织病理变化。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 13.0软件包进行处理，以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

CT灌注成像技术作为一种普遍、快捷的检查方法，可以从多角度更好地显示缺血再灌注时期大鼠脑内血流的分布及变化，是临床诊断脑梗死的重要依据，对脑梗死的早期诊断和治疗发挥着重要意义^[16-19]。神经干细胞是一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的种子细胞，在一定条件下其可分化为神经系统的各种细胞^[20-26]。目前神经干细胞移植是一个研究热点^[27-29]，为脑梗死的治疗提供了新的思路和方法，其可在局部微环境的作用下分化成相应的细胞来补充替代受损的细胞，进而促进中枢神经系统正常结构和功能的恢复^[30-33]。王展航等^[33]研究中将神经干细胞与间充质干细胞联合应用治疗脑梗死，结果显示每位患者治疗4个疗程后，日常生活能力评分、神经功能缺损评分以及功能独立性评分均得到显著改善^[34-36]。

通过CT灌注成像技术了解干细胞移植后脑梗死大鼠模型各时段CT扫描征象，对照组在各个时间点血流动力学未见明显异常，移植组的CT值随时间变化逐渐升高，一系列结果说明了脑梗死后脑局部血液动力学发生异常改变，脑血流量的升高可以增加缺血半暗带神经细胞的存活率，脑组织含水量与CT值呈负相关，脑梗死缺血区水肿是引起梗死脑组织密度降低的主要原因。各组神经功能评分显示，移植后各个时间点移植组的神经功能评分明显优于脑梗死组；TTC染色示脑梗死组及移植组的脑梗死体积差异明显；苏木精-伊红染色示梗死灶细胞变性坏死程度降低各组间差异显著，神经干细胞可以促进梗死后的功能恢复，降低梗死灶细胞坏死程度。

综上所述，CT灌注技术可以早期定量检测到脑梗死大鼠脑组织的缺血程度及范围，进而判断脑组织成活与否及其可恢复性，对临床治疗及预后判断提供了指导。CT灌注技术还可为临床早期溶栓治疗争取宝贵时间，能够快速、便捷地为临床提供全面的影像学信息。因此建议临床应通过CT及时明确病灶的性质和范围，CT不能发现的病灶建议行MRI检查，以便进一步为患者早期治疗、促进预后提供可靠依据。
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