复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带移植修复损伤前交叉韧带

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：异种韧带易于获得，具有韧带支架结构，有利于组织长入和爬行替代，经处理可完全消除抗原性，不引起免疫排斥反应，具有良好生长支架功能。
目的：探索生物型异种韧带替代同种异体韧带移植重建山羊前交叉韧带损伤的可行性。
方法：将24只健康山羊随机等分成A，B，C三组，取羊的左膝关节，制作成前交叉韧带断裂缺失模型，建立胫骨、股骨端骨隧道后，A，B，C组分别植入复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带、生物型异种韧带和同种异体韧带。
结果与结论：复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带植入山羊体内后，无明显排斥反应，具有良好的组织相容性，植入韧带作为功能性支架重建前交叉韧带，在动物膝关节内环境的诱导下，使自体新生组织长入并替代支架，形成自体新生韧带，骨腱部愈合良好，但其与同种异体韧带重建前交叉韧带在组织学、免疫反应、生物力学方面差异无显著性意义，而植入复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带山羊宿主自体组织可以长入并建立微循环。提示复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带可加速微循环建立，促进韧带生长，尤其对韧带再血管化作用显著，但对韧带生物力学无明显影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 前交叉韧带损伤, 生物型, 异种, 同种异体, 山羊, 再血管化

Abstract:

BACKGROUND: Xenogeneic ligament is readily available, which has ligament scaffold structure and is conducive to tissue ingrowth and creeping substitution. After processing, the xenogeneic ligament, with the presence of good growth scaffold function, can be completely eliminated antigenicity that can cause immune rejection.
OBJECTIVE: To study the feasibility of biological xenogeneic ligament graft instead of allogeneic ligament graft for reconstruction of goat anterior cruciate ligament.
METHODS: Twenty-four healthy adult goats were randomly divided into A, B, C groups, and then, the left knee joints of goats were removed to establish animal models of anterior cruciate ligament injury in the three groups. After the establishment of the tibia and femoral bone tunnel, groups A, B, C were respectively transplanted with biological xenogeneic ligament graft combined with bone marrow mesenchymal stem cells, biological xenogeneic ligament graft alone, and allogenic ligament.
RESULTS AND CONCLUSION: After implantation, no rejection but good biocompatibility was found in the group A, in which, the transplanted ligament as a functional scaffold for anterior cruciate ligament reconstruction, and new tissues in-grew and replaced the scaffold under intraarticular environment to form the new ligament with
good bone tendon healing. However, there were no differences in histology, immune response, biomechanical findings between groups A and C. Additionally, in the group A, the host tissues were found to grow into the scaffold and establish a micro-circulation. These findings indicate that xenogeneic ligament combined with bone marrow mesenchymal stem cells can accelerate the establishment of micro-circulation and promote the growth of ligaments, especially improve the ligament revascularization significantly, but has no influence on the biological characteristics of the ligament.

Key words: Ligaments, Microcirculation, Histocompatibility, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

赵晓亮，章莹，黄山东，肖进，徐凯，王维，费志军. 复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带移植修复损伤前交叉韧带[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.016.

Zhao Xiao-liang, Zhang Ying, Huang Shan-dong, Xiao Jin, Xu Kai, Wang Wei, Fei Zhi-jun . Biological xenogeneic ligament graft combined with bone marrow mesenchymal stem cells to repair anterior cruciate ligament injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.016.

图/表（结果） 6

2.1 生物型异种韧带中细胞形态扫描电镜结果显示，细胞呈球形黏附在韧带材料表面及孔隙侧壁，并可见细胞分泌的基质沉积于细胞周围，但基质分泌量较少(图3)。

2.2 实验动物数量分析进入结果分析的实验山羊24只，无脱落。
2.3 大体观察结果各组山羊患肢切口均愈合良好，无感染及死亡。植入后2-4 h站立，术侧不负重，进食正常，3例植入后出现膝关节肿胀、积液，两三天后消失，2周损伤侧可触地，4周后可部分负重，7周仍有明显跛行，12周后步态恢复，15周后可前足立起觅食。生物型异种韧带组1例出现跛行步态。植入后各组山羊关节稳定，前抽屉试验和Lachmann征检查均为阴性。植入后各组山羊韧带各时间点均未出现韧带断裂，消失，关节内组织未见粘连，半月板未见损伤破裂，关节软骨未见明显损伤，无明显炎症表现(图4)。
植入后2个月各组山羊切口均甲级愈合，无明显炎症反应及渗出。各组山羊移植韧带位置良好，形态正常，髌下脂肪垫和原前交叉韧带残端来源的滑膜覆盖移植物中下部，髁间窝覆盖少量滑膜，关节液清亮。A和C组山羊关节内无粘连，B组关节内少量粘连。A组形成明显血管翳，B组部分形成血管翳。植入后4个月各组山羊移植物位置良好，形态正常，淡黄色，移植物表面和髁间窝滑膜覆盖增多，并与后方间室滑膜相连续；滑膜富含血管,关节液呈淡黄透明样。移植韧带柔韧度增加，A组明显周径变大。B和C组材料滑膜覆盖，血管翳增多。A组韧带表面的滑膜组织覆盖完整，表面有小血管长入，但滑膜内韧带无明显变化。植入后6个月A和C组移植物位置良好，形态正常，张力良好，其表面和髁间窝被滑膜覆盖，沿隧道纵轴切开后显示移植物与周围隧道牢固紧密结合。韧带色泽由黄转白，周径变小，柔韧度接近正常韧带，关节内滑膜增生明显。B组移植物张力较好，其表面和髁间窝被滑膜部分覆盖，沿隧道纵轴切开后显示移植物与周围隧道结合，但不紧密。大体观测韧带色泽淡黄白色，韧带周径无明显变化，柔韧度接近正常韧带。植入后12个月A组韧带位置良好，韧带呈亮白色，周径进一步变小，B和C组移植物位置良好，形态正常，植入韧带无破损及变形，表面滑膜红润增厚，移植物呈扁长束状，有光泽。移植物张力良好，无松弛。关节软骨、半月板和后交叉韧带外观完整，无明显退变表现，关节内滑膜无明显增生(图4)。

2.4 生物力学测试结果植入后各时间点，3组韧带股骨-韧带-胫骨试件最大载荷及抗拉强度差异无显著性意义 (P > 0.05；表1，2)。
另取生物型异种韧带、同种异体韧带样品及正常山羊前交叉韧带作牵拉试验，前两者均因韧带撕裂而终止，后者断裂处在韧带的胫骨附着处，测试结果为：生物型异种韧带最大载荷为926.28 N，抗拉强度48.32 N/mm；同种异体韧带最大载荷为914.32 N，抗拉强度43.71 N/mm；正常山羊韧带最大载荷为782.50 N，抗拉强度42.53 N /mm。

2.5 组织学变化苏木精-伊红染色结果显示，植入后2个月后，各组山羊均出现滑膜增生。A组再血管化明显，滑膜完全包裹移植材料。A和B组有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润，炎症反应2至3级。C组少量淋巴细胞、浆细胞浸润，炎症反应1至2级。3组腱-骨界面间有炎细胞浸润的疏松结缔组织填充，细胞外基质增多，B和C组血管内皮细胞少，A组血管内皮细胞增多，成纤维细胞增生明显。肌腱保持部分腱性特征，细胞核呈长梭形，排列不整，核有增殖像；内部可见胶原纤维卷曲、断裂。移植韧带与隧道之间间隙存在，韧带内部有缺血坏死表现。A和B组两端骨隧道移植材料内可见数个浆细胞巢(图5)。
植入后4个月后，3组山羊移植部位均可见大量成纤维细胞和纤维细胞、血管内皮细胞增生，毛细血管长入，仅有少量的淋巴细胞、浆细胞存留，炎症反应1至2级。A组韧带材料分解，细胞为椭圆形或圆形功能活性高的成纤维细胞，细胞分泌基质，新生细小淡染色胶原纤维，新生胶原纤维排列无序，细胞量多，排列无方向，可见部分为胶原纤维紧密排列成的Sharpey纤维，少量腱-骨连接。B和C组移植物呈碎片状，但尚未形成岛状分割，近关节面骨腱结合部的移植材料纤维周边为疏松结缔组织连接。各组肌腱-隧道界面胶原连接增多，连接处的胶原纤维基本沿应力方向排列；炎性细胞减少，B和C组血管成分增多，界面组织接近成熟；移植物与隧道界面之间没有发现明显不同。A和C组肌腱内纤维母细胞增生明显，细胞排列趋于有序，可见胶原断裂。移植韧带内部出现重塑现象，移植韧带与隧道之间界限不清，隧道出口处移植物被滑膜包被，来自滑膜的血管向移植物内部长入。A和B组两端骨隧道移植材料内浆细胞巢减少消失(图5)。
植入后6个月后，A组移植物进一步分解，新生细小胶原组织比例含量增高，胶原纤维紧密排列，部分胶原纤维排列方向有序。新生胶原纤维内的细胞密度和数量减少，细胞形态亦变化，大部分成为功能活性较低的梭形和长条形的成熟纤维细胞，排列沿着胶原纤维的方向。B和C组韧带材料被分割成岛状，细胞密度和数量未见减少，仍以成纤维细胞为主，新生胶原无序排列，但C组少量出现成熟纤维细胞。3组腱-骨连接增多，与内部纤维连续，连接中可见明显的类软骨过渡区，A组近关节面骨隧道内的移植材料纤维周边可见韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨的直接连接模式，可见潮线，潮线不连续。A组移植物内部血管增多，但仍有部分区域无血管长入，B和C组界面组织部分消失，靠近隧道口部位腱骨连接明显多于隧道内部，移植肌腱内部可见血管长入，边缘部位的血管增生活跃，纤维细胞与胶原纤维沿纵轴方向排列。移植肌腱内部成纤维细胞活跃，类韧带样物质形成增多，移植物内部没有见到明显的坏死，韧带与隧道界面趋于融合。骨隧道内移植材料内未发现明显的淋巴细胞、浆细胞，各组炎症反应为1级(图5)。
植入后12个月后，A组移植材料完全消失，B和C仍有部分移植材料碎片残留。新生的韧带胶原纤维排列有序，细胞量少，成熟，移植肌腱内部细胞和胶原沿纵轴方向排列整齐，细胞核呈长杆状。A组近关节面骨隧道的移植韧带材料纤维周边可见韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨的直接连接模式，可见潮线，潮线连续。B和C组近关节面骨隧道的移植韧带材料纤维周边亦可见韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨的直接连接模式，可见潮线，潮线不连续(图5)。

2.6 淋巴细胞毒试验结果植入后2，4个月时，3组山羊淋巴细胞毒性均高于正常值(P < 0.05)，植入后6，12个月时，3组山羊淋巴细胞毒性与正常值接近(P > 0.05)，且各组山羊淋巴细胞毒性差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。
2.7 血清白细胞介素2和6的水平植入后3组山羊血清白细胞介素2水平与正常值接近(P > 0.05)，但白细胞介素6高于正常值(P < 0.05)，但3组血清白细胞介素2和6水平接近(P > 0.05)，见表4，5。

参考文献

[1] Huston LJ, Greenfield ML, Wojtys EM. Anterior cruciate ligament injuries in the female athlete. Potential risk factors. Clin Orthop Relat Res. 2000;(372):50-63.
[2] Marrale J, Morrissey MC, Haddad FS. A literature review of autograft and allograft anterior cruciate ligament reconstruction. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2007;15(6):690-704.
[3] Mascarenhas R, MacDonald PB. Anterior cruciate ligament reconstruction: a look at prosthetics--past, present and possible future. Mcgill J Med. 2008;11(1):29-37.
[4] Marcacci M, Zaffagnini S, Iacono F, et al. Intra- and extra-articular anterior cruciate ligament reconstruction utilizing autogeneous semitendinosus and gracilis tendons: 5-year clinical results. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2003;11(1):2-8.
[5] Mascarenhas R, MacDonald PB. Anterior cruciate ligament reconstruction: a look at prosthetics--past, present and possible future. Mcgill J Med. 2008;11(1):29-37.
[6] Heineken FG, Skalak R. Tissue engineering: a brief overview. J Biomech Eng, 1991;113(2):111-112.
[7] Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000;6(11):1229-1234.
[8] Henning CE, Lynch MA, Glick KR Jr. An in vivo strain gage study of elongation of the anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 1985;13(1):22-26.
[9] Kennedy JC, Hawkins RJ, Willis RB, et al. Tension studies of human knee ligaments. Yield point, ultimate failure, and disruption of the cruciate and tibial collateral ligaments. J Bone Joint Surg Am. 1976;58(3):350-355.
[10] 王建,敖英芳.前交叉韧带损伤的临床流行病学研究[J].中国运动医学杂志, 2001,20(4):4.
[11] Dittmer R, Harfmann P, Tenschert W, et al. Monitoring of renal transplant patients with interleukin-2 and interleukin-2 receptor enzyme immunoassay and interleukin-2 receptor immunocytology. Transplant Proc. 1990;22(5):2284-2285.
[12] Van Oers MH, Van der Heyden AA, Aarden LA. Interleukin 6 (IL-6) in serum and urine of renal transplant recipients. Clin Exp Immunol. 1988;71(2):314-319.
[13] Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood. 1989;74(1): 1-10..
[14] 左新成,黄昌林,林子豪,等.不同方法处理异种肌腱的血清免疫体外实验[J].实用医药杂志,2002,19(5):363-365.
[15] van Steensel CJ, Schreuder O, van den Bosch BF, et al. Failure of anterior cruciate-ligament reconstruction using tendon xenograft. J Bone Joint Surg Am. 1987;69(6):860-864.
[16] Madden KN, Johnson KA, Howlett CR, et al. Resorbable and non-resorbable augmentation devices for tenorrhaphy of xenografts in extensor tendon deficits: 12 week study. Biomaterials. 1997;18(3):225-234.
[17] Stone KR, Walgenbach AW, Turek TJ, et al. Anterior cruciate ligament reconstruction with a porcine xenograft: a serologic, histologic, and biomechanical study in primates. Arthroscopy. 2007;23(4):411-409.
[18] Stone KR, Abdel-Motal UM, Walgenbach AW, et al. Replacement of human anterior cruciate ligaments with pig ligaments: a model for anti-non-gal antibody response in long-term xenotransplantation. Transplantation. 2007;83(2): 211-219.
[19] 李岩,陈宝田,邱长春.白细胞介素2及其受体mRNA早期诊断心脏移植免疫排斥反应[J].中华医学杂志,1996,76(7):505-508.
[20] Brevig T, Meyer M, Kristensen T, et al. Xenotransplantation for brain repair: reduction of porcine donor tissue immunogenicity by treatment with anti-Gal antibodies and complement. Transplantation. 2001;72(2):190-196.
[21] Saethre M, Baumann BC, Fung M, et al. Characterization of natural human anti-non-gal antibodies and their effect on activation of porcine gal-deficient endothelial cells. Transplantation. 2007;84(2):244-250.
[22] Key T, Schuurman HJ, Taylor CJ. Does exposure to swine leukocyte antigens after pig-to-nonhuman primate xenotransplantation provoke antibodies that cross-react with human leukocyte antigens? Xenotransplantation. 2004;11(5): 452-456.
[23] Miwa Y, Kobayashi T, Nagasaka T, et al. Are N-glycolylneuraminic acid (Hanganutziu-Deicher) antigens important in pig-to-human xenotransplantation? Xenotransplantation. 2004;11(3):247-253.
[24] Galili U, Ishida H, Tanabe K, et al. Anti-gal A/B, a novel anti-blood group antibody identified in recipients of abo-incompatible kidney allografts. Transplantation. 2002; 74(11):1574-1580.
[25] Galili U. The alpha-gal epitope and the anti-Gal antibody in xenotransplantation and in cancer immunotherapy. Immunol Cell Biol. 2005;83(6):674-686.
[26] Veillette CJ, Cunningham KD, Hart DA, et al. Localization and characterization of porcine patellar tendon xenograft antigens in a rabbit model of medial collateral ligament replacement. Transplantation. 1998;65(4):486-493.
[27] Stone KR, Walgenbach AW, Turek TJ, et al. Anterior cruciate ligament reconstruction with a porcine xenograft: a serologic, histologic, and biomechanical study in primates. Arthroscopy. 2007;23(4):411-419.
[28] Wu G, Pfeiffer S, Schröder C, et al. Co-stimulation blockade targeting CD154 and CD28/B7 modulates the induced antibody response after a pig-to-baboon cardiac xenograft. Xenotransplantation. 2005;12(3):197-208.
[29] Stone KR, Ayala G, Goldstein J, et al. Porcine cartilage transplants in the cynomolgus monkey. III. Transplantation of alpha-galactosidase-treated porcine cartilage. Transplantation. 1998;65(12):1577-1583.
[30] Zahorsky-Reeves JL, Kearns-Jonker MK, Lam TT, et al. The xenoantibody response and immunoglobulin gene expression profile of cynomolgus monkeys transplanted with hDAF-transgenic porcine hearts. Xenotransplantation. 2007; 14(2):135-144.

引言

膝关节前交叉韧带断裂是发生率较高且严重的运动损伤，国外有学者统计前交叉韧带损伤在一般人群中的发病率为38/100 000^[1]。临床上常使用自体移植物、异体移植物和人工合成材料进前交叉韧带重建，但均存在一定缺陷。自体移植物如自体阔筋膜^[2]、骨-髌腱-骨和半腱肌/股薄肌腱等先后被用于前交叉韧带重建，骨-髌腱-骨自体移植曾经是膝交叉韧带断裂治疗的“金标准”^[2]。现又有研究发现四股半腱肌移植可与骨-髌腱-骨相媲美^[3]，但使用自体移植物重建前交叉韧带，存在来源限制，供区并发症等问题^[4]。人工韧带因早期临床应用中出现的滑膜炎、韧带断裂等缺陷，曾一度销声匿迹，近年随着LARS(ligament reinforcement system)人工韧带的出现，使用其重建前交叉韧带的病例又有日益增多的趋势^[5]，但人工合成材料重建前交叉韧带远期疗效还存在争议，且价格昂贵，限制了其临床应用。
近年来兴起的组织工程韧带是重建前交叉韧带的新途径^[6]。骨髓间充质干细胞是目前研究最多、最具有代表性的种子细胞，具有向多种组织细胞分化的能力^[7]，还可以分泌多种物质。这种细胞在骨髓中大量存在，取材方便，且细胞来源于自体，可避免发生免疫排斥反应，适于与韧带支架相复合移植。
目前，与前交叉韧带移植重建替代物相关的组织工程研究仍处于初始阶段，异种组织材料，即生物型异种韧带是目前组织工程研究的新选择之一。作者应用已取得专利的去抗原技术处理猪的肌腱，得到新型生物型异种韧带。本实验拟将此韧带及复合骨髓间充质干细胞的同类韧带塑形后植入羊的膝关节前交叉韧带缺失模型，观察其在不同时期形态学、组织学、免疫反应、生物力学等方面的变化，探讨此生物型韧带重建正常膝关节前交叉韧带的可行性。

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2011年在解放军广州军区广州总医院完成。
1.3 造模动物及材料健康山羊24只，雌雄不限，年龄6-12个月，体质量25-42 kg，由广东冠昊生物科技股份有限公司动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学的要求，并经过解放军广州军区广州总医院动物伦理学委员会批准。
2种韧带均由广东冠昊生物科技有限公司制作。生物型异种韧带是以新鲜屠宰的猪肌健为原料，用环氧交联固定技术处理使之稳定化，用特定化学试剂封闭特异性抗原基团和改变特异抗原构象的方法多方位全面去除其抗原性，加上多重蛋白修饰技术，使之成为稳定性高、无毒、无抗原、组织相容性高的去抗原生物型异种韧带。同种异体韧带取新鲜屠宰的山羊侧副韧带经深低温冷冻保存脱抗原处理而成。2种试样均经⁶⁰Co灭菌后用生理盐水包装，随机取样作细菌培养，证实无细菌生长后低温保存(图1)。

山羊骨髓间充质干细胞由暨南大学细胞实验中心负责提取、培养及与生物型异种韧带复合。无菌条件下抽取实验山羊骨髓，PBS冲洗后置于10 mL离心管中，所收集的细胞于含体积分数10%胎牛血清、1%混合双抗的DMEM-LG常规培养液中培养。收获第2代细胞，以常规培养液调整细胞浓度至1×10⁹ L^-1。将细胞悬液滴加至24孔细胞培养板中的已经去抗原处理过的生物型异种韧带材料上，每孔0.5 mL，37 ℃孵育2 h。细胞贴附于支架上后，加入常规培养液，37 ℃、含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，换液2次/周。
细胞于A组韧带材料(生物型异种韧带)中培养3周，制成复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带。扫描电镜观察证实制备结果。
1.4 方法
1.4.1 造模方法将24只健康山羊随机等分成A，B，C三组。选山羊左后肢为实验部位。植入前12 h禁食禁水。山羊耳缘氯胺酮静脉麻醉，右侧卧位，四肢固定。取膝关节内侧切口，切开皮肤、皮下组织、内侧副韧带、关节囊，外翻髌骨，暴露膝关节内前交叉韧带。切断前交叉韧带上下止点后取出，应用直径5.0 mm钻头在胫骨和股骨前交叉韧带止点处钻孔，植入己经选择好的韧带。A，B，C组分别植入复合骨髓间充质干细胞的生物型异种韧带、生物型异种韧带和同种异体韧带。屈膝，在保持植入韧带适当张力下分别使用界面挤压螺钉方法固定韧带两端于股骨和胫骨隧道，固定牢靠后，冲洗关节腔，逐层缝合。无菌纱布包扎。植入后患肢不予固定，自由活动。常规应用青、链霉素3 d。密切观察山羊进食、活动及切口愈合情况，植入后14 d切口拆线(图2)。

1.4.2 大体观察植入后观察动物的饮食、活动；伤口，膝关节是否肿胀；检查膝关节的活动度稳定性，检查损伤侧膝关节的前抽屉试验和Lachmann征并记录。观察移植韧带及关节软骨、半月板等结构的大体外观。膝关节内的关节液、滑膜、半月板、关节软骨的变化；韧带在膝关节内的大体改变，滑膜覆盖、韧带色泽、韧度、直径变化；骨腱结合部位的愈合情况，界面钉被新生结缔组织的覆盖情况；韧度有无溶解、缺损、断裂、消失等。
1.4.3 生物力学测定植入后2，4，6，12个月，每组各取2只山羊，处死，取实验侧韧带标本，将标本自股骨髁上及胫骨结节下方切断，完整保留膝关节，截取股骨-前交叉韧带-胫骨试件，盐水保持湿润，在万能生物力学测量机上做拉伸试验，牵引速度为100 mm/min，则记录仪自动描记负荷-形变曲线，获得最大载荷和刚度数据。
1.4.4 组织学观察生物力学测定后，迅速切下关节内段约2 cm长韧带，股骨骨腱结合部、胫骨骨腱结合部，置于体积分数10%甲醛固定。两侧骨隧道部固定48 h后以甲酸脱钙，2周后石蜡包埋，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。切片，厚度4 μm，干燥。二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木精染色，盐酸乙醇分化，伊红复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜观察腱细胞增生及排列情况、腱周胶原纤维的含量、成纤维细胞的数量，并行组织学炎症反应分级。
1.4.5 淋巴细胞毒试验分别将韧带供体动物经麻醉后，无菌条件下取脾脏，剪碎，用100目钢网磨碎、过滤。Hank’s液洗涤、离心，弃上清液，然后所得细胞液放置于RMPI-1640培养基上吹打洗涤3遍后，得到脾淋巴细胞，加入PBS，充分混匀。在16孔板上每孔加入100 μL血清和100 μL淋巴细胞悬液，反应20 min，分别滴加250 μL的羊补体，羊抗猪补体，反应2 h后，加入100 μL锥虫蓝染色。白细胞计数板计算死亡淋巴细胞数的百分率。
1.4.6 白细胞介素2和白细胞介素6质量浓度的测定抽取3组山羊植入前及植入后2，4，6，12个月时耳静脉外周血，依次行白细胞介素2，6质量浓度的测定。
1.5 主要观察指标韧带形态、生物力学及病理组织变化。
1.6 统计学分析数据以x±s表示。采用SPSS V13.0软件处理。采用多样本两两比较的方差分析、完全随机设计方差分析(F检验)及Kruskal-Wallis秩和检验进行组间比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着社会的发展和人民生活水平不断提高，运动损伤和交通事故发生率愈来愈高，临床膝关节前交叉韧带损伤也越来越多见。
前交叉韧带重要的生理功能和损伤后不能自行修复所导致的严重后遗症决定了重建前交叉韧带的必要性和重要性。但临床所使用的移植物中，自体韧带移植后供区并发症的问题一直无法解决，人工韧带远期疗效尚不确定，且价格昂贵，临床应用不广。近年来出现的组织工程韧带为前交叉韧带重建替代物的研究带来了巨大的希望，但到目前为止，仍没有明显的突破。同种异体韧带进入临床后取得了不错的结果，但移植后面临免疫排斥和疾病传播的问题，且来源有限，而异种移植物应用最大的问题也在于免疫排斥。国外从20世纪80年代开始就已经有人利用异种异体组织进行前交叉韧带的重建，但由于所用组织与人类前交叉韧带在结构和组织学特性上相去甚远，以及没有有效的脱抗原方法导致了实验的屡屡失败^[8-10]。
研究认为在前交叉韧带重建过程中为了维持膝关节的稳定性，一般要求新生的自体韧带与移植韧带的降解需保持同步，也就是说在移植物出现降解时，能够有新生的自体韧带组织替代，从而补充因移植物降解而丢失的力学强度，同时，需要未降解的韧带仍然能够发挥存留的力学性能。随着移植物的逐步降解，新生的自体韧带组织逐步增加，使前叉韧带的力学特性逐渐恢复至接近或达到正常，从而完成功能性生物力学的重建，这对重建后关节功能的恢复有至关重要的作用^[11-14]。
实验在植入前对移植材料进行力学测试，结果显示生物型异种韧带，即经过环氧化合物交联固定和其他蛋白修饰处理后的猪肌腱与经过处理的同种异体韧带均保留了肌腱胶原纤维的粘弹性、抗拉伸能力强等生物力学特性，抗拉强度和最大载荷均与山羊的前交叉韧带相匹配，符合前交叉韧带重建的力学要求。植入后2个月时各组移植物均从韧带近股骨隧道端拉断，移植物未从中部断裂。韧带大体材料无明显变化，关节内移植韧带材料结构完整，生物型异种韧带和同种异体韧带在植入体内2个月时仍然保持较好的力学特性。股骨骨隧道2个月时连接不牢固，移植材料股骨端的界面固定没有达到要求。植入后4个月各组韧带从关节内断裂或韧带近股骨端撕脱。大体观察生物型异种韧带己初具正常前交叉韧带形态，柔韧度增加，周径变大。此时骨隧道界面连接牢固，材料己经开始降解，新生的胶原纤维无法替代被降解材料导致移植物力学性能的降低，提示滑膜包裹及再血管化过程中新生韧带组织的力学特性没有达到代替材料降解的要求。植入后6个月时材料降解加速，虽然新生韧带组织在组织学上观察排列有序，部分胶原纤维趋向成熟，但仍然不能补足材料降解所丢失的力学强度，导致移植物的力学性能进一步降低。植入后12个月时各组韧带大体上进一步变小，断裂处在关节内韧带中1/3端处，组织学观察显示材料分解完全，虽然新生的韧带胶原纤维排列有序比较成熟，但新生组织无法替代移植物的原有力学性能，无法完全恢复正常前交叉韧带的原有功能。植入后移植物的组织学结构会随着自体组织爬行替代的过程发生变化，从而影响力学性能，但移植物塑性过程一直没有停止，形态学上越来越接近正常前交叉韧带，韧带材料在拉伸载荷下抵抗形变的能力也在经过改建塑型的过程后开始提高。
正常前交叉韧带组织学形态为呈束状的致密胶原结缔组织，表面有滑膜组织覆盖。纵切标本示纤维为小波状排列，顺纤维排列可见有成串状排列的细胞。韧带含有I型和Ⅲ型胶原，Ⅲ型胶原成分较其他肌腱或韧带多，韧带外面由结缔组织、血管和本体感觉神经共同形成外膜^[15-16]。前交叉韧带缺乏主要血管，其血运主要依靠许多从附着处分支而来的小血管提供，尽管血管直径很小，血流有限，但对维持韧带却有极为重要的作用，可以遍布于韧带中并借此给细胞提供营养，维持基质合成以及修复的过程。本实验结果显示，生物型异种韧带植入后与同种异体韧带类似，可以以植入物为支架供自体韧带长入，自体细胞有向成纤维细胞、血管内皮细胞、胶原结缔组织转化的趋势，而复合骨髓间充质干细胞则可以加速这种趋势。各组均未出现明显免疫排斥反应。已有研究表明白细胞介素2、6与细胞免疫有密切的关系^[17-30]，白细胞介素6是急性免疫排斥反应的重要标志之一，实验结果显示复合骨髓间充质干细胞对生物型异种韧带的免疫原性影响不大。
本实验不足之处为山羊膝关节腔较小，给手术带来一定困难，对植入物大小也有一定限制；因取材及理化制备等原因影响，植入物规格有一定差异，韧带长度、直径不能统一，即使术前进行塑形也无法达到满意效果，对植入后观察会造成部分影响；观察的时间仍然不够长。下一步将继续改进组织处理技术，更加深入研究韧带修复再生机制，设计更加合适的动物模型，严格植入物的筛选，完善实验方法，提高手术固定技术，改善和补充观察方法，进一步实验研究生物型异种韧带与自体肌腱、人工韧带移植的差异，继续探索重建前交叉韧带的可行性。
通过本次实验，可以得出以下结论：①生物型异种韧带植入山羊体内后，无明显排斥反应，具有良好的组织相容性，植入韧带作为功能性支架重建前交叉韧带，在动物膝关节内环境的诱导下，使自体新生组织长入并替代支架，形成自体新生韧带，骨腱部愈合良好，稳定膝关节，防止关节继发损伤作用明显。②生物型异种韧带与同种异体韧带重建前交叉韧带从组织学观察、免疫反应、生物力学结果分析无显著性差异，但在体内均达不到正常前交叉韧带的水平。③植入生物型异种韧带在转归过程中，宿主自体组织可以长入并建立微循环，复合骨髓间充质干细胞可加速微循环建立，促进韧带生长，尤其对韧带再血管化作用显著。

文章快阅

延伸阅读

1文章要点：
异种组织材料，即生物型异种韧带是目前组织工程研究的新选择之一。作者应用去抗原技术处理猪的肌腱，得到新型生物型异种韧带。实验拟将此韧带及复合骨髓间充质干细胞的同类韧带塑形后植入羊的膝关节前交叉韧带缺失模型，观察其在不同时期形态学、组织学、免疫反应、生物力学等方面的变化，并与同种异体韧带相对比，探讨此生物型韧带重建正常膝关节前交叉韧带的可行性，旨在寻求一种安全、有效、易于推广的前交叉韧带替代材料。
2国内外同类研究水平的介绍：
重建前交叉韧带的必要性和重要性？临床所使用的移植物中，自体韧带移植后供区并发症的问题一直无法解决，人工韧带远期疗效尚不确定，且价格昂贵，临床应用不广泛。近年来出现的组织工程韧带到目前为止，仍没有明显的突破。同种异体韧带进入临床后取得了不错的结果，但移植后面临免疫排斥和疾病传播的问题，且来源有限，而异种移植物应用最大的问题也在于免疫排斥。国外从上世纪80年代开始就已经有人利用异种异体组织进行前交叉韧带的重建，但由于所用组织与人类前交叉韧带在结构和组织学特性上相去甚远，以及没有有效的脱抗原方法导致了实验的屡屡失败。
3与同类研究的比较
在目前临床所应用的前交叉韧带移植物中，自体组织移植及同种异体前交叉韧带移植的优势明显，但其并发症多、来源非常有限。人工合成材料与组织工程韧带近几年研究较多，但其制作工艺复杂，价格昂贵，很难满足临床移植的需要。随着越来越多去抗原处理技术的出现，有效去除异种韧带的免疫原性，提高其组织相容性已不是没有可能，在此基础上异种韧带来源广泛，获取方便、价格低廉、适用性广等优势得以凸显。异种韧带作为移植物用于前交叉韧带的重建将作为一个新的课题摆在人们面前，而异种移植的免疫源性反应仍将是未来异种韧带移植重建所要所面临的最大问题。