脐带源间充质干细胞移植治疗肝纤维化及肝硬化的相关机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝硬化是多种原因引起的肝脏慢性病变，目前尚没有有效的治疗方法，很多研究表明，间充质干细胞对肝纤维化及肝硬化有一定的治疗作用。
目的：研究人脐带源间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化及肝硬化的治疗作用及其作用机制。
方法：应用CCl4诱导制备肝纤维化及肝硬化模型，造模后经尾静脉注射人脐带间充质干细胞。细胞移植后采用Beckman Coulter analyzer检测人脐带源间充质干细胞移植对大鼠肝功能的影响；采用天狼猩红染色检测肝组织病理改变；应用免疫组织化学染色、Western blot和real-time Q-PCR方法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白与mRNA在大鼠肝组织中的表达。
结果与结论：人脐带源间充质干细胞移植可以改善肝纤维化及肝硬化大鼠的肝功能。人脐带源间充质干细胞移植后，除肝纤维化细胞移植1周组与对应模型组相比差异无显著性意义外，其余各细胞移植组肝脏组织中基质金属蛋白酶2 mRNA及蛋白表达水平明显升高，而Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶抑制剂2表达水平明显降低。人脐带源间充质干细胞通过上调基质金属蛋白酶2表达，下调基质金属蛋白酶抑制剂2表达，对肝纤维化及肝硬化起到治疗作用；在致病因素持续存在的情况下，人脐带源间充质干细胞移植并不能逆转肝纤维化或者肝硬化，只能延缓肝纤维化或肝硬化的进程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 肝纤维化, 肝硬化, 脐带间充质干细胞, Ⅰ型胶原, Ⅲ型胶原, MMP-2, TIMP-2

Abstract:

BACKGROUND: Cirrhosis is a long-term consequence of chronic hepatic injury, which has no effective therapy. Mesenchymal stem cells have been shown to play a potential role in the treatment of liver fibrosis/cirrhosis.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect and mechanism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on CCl4 induced liver fibrosis/cirrhosis in rats.
METHODS: A CCl4-induced liver fibrotic/cirrhotic rat model was used, and human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were injected via the tail vein after modeling. Liver biochemical profile was measured by Beckman Coulter analyzer. Histopathological changes were assessed by Sirius red staining. The expressions of collagen type I, collagen type III, matrix metalloproteinases-2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2 protein and mRNA in liver tissues were observed by immunohistochemistry, western blot and real-time PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Liver biochemical profile indicated the transplantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells could improve the liver function of rats with liver fibrosis and cirrhosis. After cell transplantation, except 1-week cell transplantation group, the expressions of the matrix metalloproteinases-2 mRNA and protein were significantly increased, while the expressions of collagen type I, collagen type III and
tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2 mRNA and protein significantly decreased, compared with the corresponding model groups. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells play a role in the treatment of liver fibrosis and cirrhosis through upregulating the expression of matrix metalloproteinases-2 and lowering the expression of inhibitor of matrix metalloproteinases-2. With the continued presence of pathogenic factors, human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell transplantation cannot reverse liver fibrosis or cirrhosis, and only delay the process of liver fibrosis or cirrhosis.

Key words: Liver Cirrhosis, Mesenchymal Stem Cells, Collagen Type I, Collagen Type III, Matrix Metalloproteinases, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

孙慧聪，张国尊，郭金波，冯燕，郑力搏，张晓岚. 脐带源间充质干细胞移植治疗肝纤维化及肝硬化的相关机制[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.015.

Sun Hui-cong, Zhang Guo-zun, Guo Jin-bo, Feng Yan, Zheng Li-bo, Zhang Xiao-lan. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell tansplantation for liver fibrosis and cirrhosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.015.

图/表（结果） 6

2.1 成功分离培养人脐带源间充质干细胞并进行鉴定第3代人脐带源间充质干细胞形态学上显示成纤维细胞形态，呈漩涡样生长，细胞生长状态良好。应用流式细胞技术对其免疫表型进行分析，结果显示分离培养的细胞为人脐带源间充质干细胞(此步由天津和泽干细胞科技有限公司进行分离培养鉴定) (图1)。
2.2 实验动物数量分析参加实验成年健康雄性Wistar大鼠120只，进入结果分析数量117只，脱落3只；其中肝硬化模型4周组1只动物死亡，解剖发现肝脏缩小，中量腹水，考虑为肝硬化终末期所致；肝硬化模型8周组2只动物死亡，解剖发现肝脏缩小明显，大量腹水，腹水呈黄色略浑浊，考虑为肝硬化终末期所致。

2.3 人脐带源间充质干细胞移植对肝纤维化及肝硬化大鼠的治疗作用肝功能检测结果表明：人脐带源间充质干细胞移植对肝纤维化及肝硬化大鼠具有积极作用，可以改善肝纤维化及肝硬化大鼠的肝功能(表1)。

天狼猩红染色结果显示：正常对照组大鼠肝小叶中央静脉管壁纤维组织染色，汇管区及小叶间隔仅可见少量纤维沉积。移植前，肝纤维化细胞移植组肝小叶结构紊乱，中央静脉周围及汇管区可见纤维沉积增多，肝纤维化形成；肝硬化细胞移植组纤维组织大量增生，包绕肝细胞形成假小叶，肝硬化形成，这提示肝纤维化、肝硬化造模成功。与模型组相比，细胞移植组纤维沉积明显减少(图2)。定量分析结果显示：与模型组相比，除肝纤维化细胞移植1周组纤维化程度分级及纤维组织沉积定量无明显降低外，其余各时间点细胞移植组纤维化程度分级及纤维组织沉积定量均明显降低。

2.4 人脐带源间充质干细胞移植降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达应用real-time Q-PCR检测肝组织中Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原mRNA表达(图3)。由图可见，人脐带源间充质干细胞移植能够降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，而在人脐带源间充质干细胞移植组内，随着移植时间的延长，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达水平也逐渐增加。

2.5 人脐带源间充质干细胞移植上调大鼠肝组织中基质金属蛋白酶2表达，下调基质金属蛋白酶抑制剂2表达细胞浆呈棕黄色或褐色颗粒状物者为阳性细胞，主要分布于汇管区及纤维间隔，阳性表达呈灶状或弥漫性分布。正常对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白阳性细胞仅在汇管区少量表达，注射相同时间CCl₄后，模型组胶原蛋白阳性细胞明显多于细胞移植组，而肝纤维化细胞移植组内及肝硬化细胞移植组内，随着移植时间的延长，胶原蛋白阳性的细胞也有所增加(图4)。Western blot检测结果显示，与模型组相比，细胞移植后肝脏组织中基质金属蛋白酶2蛋白表达水平明显升高，基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白表达水平明显降低(图5)；在肝纤维化细胞移植组及肝硬化细胞移植组内，随着移植时间的延长，基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白表达水平也逐渐增加(图5)。
同时应用real-time Q-PCR比较基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2 mRNA在各组大鼠肝组织中的表达(图3)。在肝纤维化细胞移植组及肝硬化细胞移植组内，随着移植时间的延长，基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2 mRNA表达水平也逐渐增加。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2011年6月至2012年12月在河北医科大学第二医院消化实验所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年健康雄性Wistar大鼠120只，体质量350-400 g，清洁级，由河北省实验物中心提供(合格证编号911102)，适应性饲养2周，自然光照，动物房温度维持在 20 ℃左右。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。
1.3.2 细胞、试剂人脐带源间充质干细胞由天津和泽干细胞科技有限公司分离、培养及鉴定。鼠抗β-actin多克隆抗体、小鼠抗基质金属蛋白酶2单克隆抗体、兔抗基质金属蛋白酶抑制剂2多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带源间充质干细胞的分离培养人脐带源间充质干细胞由天津和泽干细胞科技有限公司分离、培养及鉴定。用消毒的手术剪将脐带剪成大小约1 mm³小块，经直径1.5 mm的粗滤网过滤，获得直径小于等于1.5 mm的小脐带组织块。将小块脐带组织加入DMEM/F12完全培养液接种于T75细胞培养瓶中。原代培养细胞三四天后全量换液，弃去非贴壁细胞，以后每三四天换新鲜培养液，当细胞80%融合时，0.125%胰酶消化，1︰3传代。
1.4.2 实验分组成年健康雄性Wistar大鼠120只，随机分为以下几组：①正常对照组(n=8)。②肝纤维化模型1，2，4周组(n=8)。③肝纤维化细胞移植0，1，2，4周组(n=8)。④肝硬化模型2，4，8周组(n=8)。⑤肝硬化细胞移植0，2，4，8周组(n=8)。
1.4.3 模型制作采用40%CCl₄橄榄油溶液，按2 mL/kg的剂量，给予四肢轮流皮下注射，每周2次，肝纤维化组注射3周，肝硬化组注射6周，造模成功后各组继续每周2次皮下注射CCl₄，直至处死。
1.4.4 细胞移植造模成功后，肝纤维化细胞移植组、肝硬化细胞移植组大鼠尾静脉注射人脐带源间充质干细胞，剂量为5×10⁶/只。正常对照组、肝纤维化模型组、肝硬化模型组给予等量生理盐水注射。
1.4.5 取材肝纤维化组注射生理盐水或人脐带源间充质干细胞后第1，2，4周处死大鼠并取材，肝硬化组注射生理盐水或人脐带源间充质干细胞后第2，4，8周处死大鼠并取材；正常对照组大鼠正常饲养，在肝纤维化造模成功时处死4只，肝硬化组造模成功时处死4只。消毒大鼠胸部皮肤，取心尖搏动最强处进针，抽取大鼠左心室动脉血 5 mL并留取血清以进行血清学检测。无菌条件下切开皮肤进入腹腔，迅速分离整个肝脏，生理盐水冲洗，并立即留取大鼠左叶肝组织约100 mg以备提取RNA和蛋白；再切取部分肝脏左叶，大小为5 mm×5 mm×2 mm，以40 g/L多聚甲醛固定12-24 h，常规石蜡包埋切片，用于天狼猩红染色及免疫组织化学染色。肝组织均取自肝左叶的相同部位。
1.4.6 肝功能指标检测采用IFCC推荐法检测血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性，采用溴甲酚绿法检测白蛋白水平，采用钒酸盐氧化法测定血清总胆红素和直接胆红素水平，均应用美国BECKMAN COULTER CX9全自动生化分析仪完成。
1.4.7 天狼猩红染色观察肝组织纤维化程度石蜡包埋的肝组织分别做3 μm连续切片，进行染色：天青石蓝染细胞核，天狼猩红饱和苦昧酸染液染细胞浆及纤维组织，中性树胶封固。
1.4.8 免疫组织化学方法检测基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2表达石蜡包埋的肝组织分别做3 μm连续切片，用SP法进行免疫组织化学检测，DAB显色，苏木精染细胞核。结果判断：细胞浆着棕褐色为阳性染色。
1.4.9 Western blot技术检测基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白表达提取肝组织蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。应用Western blot技术检测基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2及β-actin的蛋白表达，小鼠抗基质金属蛋白酶2单克隆抗体、兔抗基质金属蛋白酶抑制剂2多克隆抗体及小鼠抗β-actin多克隆抗体均为1︰200稀释，采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件进行定量分析。以β-actin作为内参对照，结果以目的条带和内参照的吸光度比值来表示。
1.4.10 实时荧光定量PCR技术检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2 mRNA表达 ①采用Trizol试剂盒提取肝组织RNA，电泳鉴定RNA并定量，反转录合成cDNA；Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2及GAPDH引物参照Gene-bank基因序列自行设计，由北京赛百盛基因有限公司合成。Ⅰ型胶原上游引物5’- GTG CGA TGG CGT GCT ATG -3’，下游引物5’- TCT GCG TCT GGT GAT ACA TAT TC -3’；Ⅲ型胶原上游引物5’- ACC TGC TCC TGT CAT TCC -3’，下游引物5’- CCT CCG ACT CCA GAC TTG -3’；基质金属蛋白酶2上游引物5’- GAT ATA GCC TAT TCC TTG TG -3’，下游引物5’- TGT CAG TAT CAG CAT CAG -3’；基质金属蛋白酶抑制剂2上游引物5’- TTA CCC TCT GTG ACT TTA TTG-3’，下游引物5’-CCA TTG ATG CTC TTC TCT G -3’；GAPDH上游引物5’- GGC AAG TTC AAC GGC ACA G -3’，下游引物5’- CGC CAG TAG ACT CCA CGA CAT -3’。②在ABI Prism 7700实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增。SYBR反应体系25 μL，反应条件95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。采用相对定量2-??Ct法比较目的基因mRNA的表达差异。
1.5 主要观察指标 ①肝功能指标：血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、白蛋白、总胆红素和直接胆红素水平。②肝组织纤维化程度。③Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达。④基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白及mRNA表达。
1.6 统计学分析数据均以x±s表示，应用SPSS 13.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝硬化是多种原因引起的肝脏慢性病变，肝纤维化是肝硬化发展的中间阶段。肝纤维化是肝脏对慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化则是肝纤维化的终末结局。肝星状细胞的活化、增殖、黏附、迁移，进而使以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质合成增多或降解减少，在细胞外大量沉积，是肝纤维化发生发展的中心环节^[6]；基质金属蛋白酶及其抑制因子共同参与肝纤维化形成及恢复全过程中细胞外基质代谢的调控^[7]，与肝星状细胞共同维护着肝细胞微环境的稳态。
目前，肝移植是治疗终末期肝硬化的惟一有效方法，但受到肝源缺乏、并发症多、排异反应和价格昂贵等诸多因素的影响，致使其难以广泛开展。间充质干细胞是一种具有较好应用前景的成体干细胞，在临床和亚临床试验中治疗急性心肌梗死^[8]、脑卒中、急性肾损伤^[9]、糖尿病^[10]、骨折、肺动脉高压均取得了可喜的进展^[11]，并且已用于临床治疗成骨发育不全和严重的移植物抗宿主病^[12]，但是作用机制仍不是十分明确。本研究以CCl₄诱导的大鼠肝纤维化及肝硬化模型为研究对象，探讨人脐带源间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化和肝硬化的治疗作用及机制。
病理研究结果显示：应用CCl₄橄榄油溶液皮下给药法成功建立了大鼠肝纤维化、肝硬化模型，从而保证了后续实验的顺利进行。与模型组相比，细胞移植组天狼猩红染色显示肝组织胶原沉积明显减少，这表明间充质干细胞移植对肝纤维化及肝硬化均有治疗作用。
基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂在肝脏内调节细胞外基质降解与合成平衡，其中基质金属蛋白酶负责降解细胞外基质，基质金属蛋白酶抑制剂则具有抑制基质金属蛋白酶活性的功能^[13]。在肝纤维化发展过程中，活化肝星状细胞分泌出大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质，同时基质金属蛋白酶抑制剂表达增强，并通过基质金属蛋白酶抑制剂对基质金属蛋白酶的抑制，导致基质金属蛋白酶抑制剂/基质金属蛋白酶的失衡，使胶原合成增多、降解减少^[14]，增加了胶原的沉积并促进肝纤维化的发展。基质金属蛋白酶2的自然底物主要是变性的Ⅳ型胶原，近来亦有研究发现基质金属蛋白酶2尚能分解Ⅰ型胶原^[15]。基质金属蛋白酶抑制剂2是基质金属蛋白酶2的抑制因子，适量基质金属蛋白酶抑制剂2可以激活基质金属蛋白酶2，但过量时反而会抑制基质金属蛋白酶2的激活及其mRNA的表达^[16]。
Real time Q-PCR结果显示，间充质干细胞移植后，除肝纤维化细胞移植1周组与肝纤维化模型1周组相比差异无显著性意义外，其余细胞移植各组与相应模型组相比，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显减少，这表明间充质干细胞移植可降低Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，对肝纤维化及肝硬化起到治疗作用。免疫组织化学染色、Western blot与Real time Q-PCR检测的结果显示，正常大鼠仅少量表达基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2，间充质干细胞移植后，除肝纤维化细胞移植1周组与肝纤维化模型1周组相比差异无显著性意义，其余间充质干细胞移植各组与相应模型组相比，基质金属蛋白酶2表达明显增多，基质金属蛋白酶抑制剂2表达明显减少，均存在显著性差异，这表明间充质干细胞移植可通过上调基质金属蛋白酶2表达，下调基质金属蛋白酶抑制剂2表达，对肝纤维化及肝硬化起到治疗作用，但是在间充质干细胞移植组内，随着时间的延长，以上指标总体趋势是逐渐增加的，这表明在致病因素持续存在的情况下，间充质干细胞移植并不能逆转肝硬化，只能延缓肝硬化的进程，这提示在临床工作中，需要及时发现和去除肝纤维化或肝硬化的致病因素，并加以其他方面的治疗，才能取到更好的临床效果。
综上所述，CCl4可成功诱导肝硬化模型，间充质干细胞移植能够降低肝硬化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量，并通过上调基质金属蛋白酶2表达，下调基质金属蛋白酶抑制剂2表达，对肝纤维化及肝硬化起到治疗作用，但是间充质干细胞移植后在体内发挥作用需要一个阶段，考虑原因可能与间充质干细胞的肝样细胞分化有关，其中蕴含的机制尚待研究。在致病因素持续存在的情况下，间充质干细胞移植并不能逆转肝纤维化或肝硬化，只能延缓肝纤维化或肝硬化的进程，那么在致病因素去除的情况下，间充质干细胞移植是否能够逆转肝纤维化或者肝硬化呢？更进一步来讲，在临床工作中是否需要再次移植间充质干细胞及再次移植时机的把握上，仍然需要脚踏实地的研究。